Abstract

Desacoplamento proteína-2 (UCP2) é conhecido por suprimir espécies reativas de oxigênio mitocondrial (ROS) de produção e é empregado por células cancerosas resistentes a drogas para atenuar o stress oxidativo. Usando as células HL-60 sensíveis a fármacos e a sub-linha resistente a drogas MX2 como sistemas modelo, mostra-se que genipina, um inibidor de UCP2, sensibiliza as células resistentes a drogas a agentes citotóxicos. O aumento da morte celular MX2 foi observado em presença de co-tratamento com genipina e diferentes doses de menadiona, doxorrubicina, epirrubicina e. DCFH-DA fluorimetria revelou que o aumento da morte celular MX2 foi acompanhada por níveis de ROS celulares melhorados. O aumento induzido por drogas em ROS foi ligada à inibição mediada por genipina de vazamento de protões mitocondrial. Estado 4 e que descansam taxas respiratórias celulares foram maiores nas células MX2, em comparação com as células HL-60, e o aumento da respiração foi prontamente suprimidas pela genipina nas células MX2. UCP2 foram responsáveis ​​por uma notável de 37% do consumo de oxigénio em repouso celular indicando que as células MX2 são funcionalmente dependente desta proteína. Quantidades mais elevadas de proteína UCP2 foram detectados na MX2

relação

as HL-60 mitocôndrias. Os efeitos observados de genipina estavam ausentes nas células HL-60 que apontam para a selectividade deste produto natural para as células resistentes a drogas. A especificidade de genipina de UCP2 foi confirmada utilizando células CHO que expressam estavelmente UCP2 em que genipina induziu um decréscimo ± 22% no estado de 4 a respiração. Estes efeitos estavam ausentes em células CHO vazio vetor expressando nenhuma UCP2. Assim, a inibição química da UCP2 com genipina sensibiliza células cancerosas multirresistentes a agentes citotóxicos

Citation:. Mailloux RJ, Adjeitey CN-K, Harper ME (2010) genipina Induzida por inibição da proteína desacopladora de-2 sensibiliza As células cancerosas resistentes a drogas a agentes citotóxicos. PLoS ONE 5 (10): e13289. doi: 10.1371 /journal.pone.0013289

editor: Maria Moran, Hospital 12 de Octubre de Madrid, Espanha |

Recebido: 27 de maio de 2010; Aceito: 14 de setembro de 2010; Publicação: 13 de outubro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Mailloux et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento foi fornecida pelos Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde: Instituto de Nutrição, Metabolismo e Diabetes para Mary-Ellen Harper, e Dr. Ryan Mailloux é o destinatário de uma bolsa pós de um Heart and Stroke Foundation of Canada Grant Program, concedido pela Função Molecular e do grupo de imagem da Universidade de Ottawa Heart Institute. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

intrínseca ou adquirida resistência a drogas a agentes quimioterápicos representa um grande obstáculo de frente para o sucesso da erradicação de cânceres [1]. A capacidade das células cancerosas a evadir toxicidade do fármaco é atribuída à indução de mecanismos de desintoxicação elaborados. Com efeito, a exposição crónica de células cancerosas a agentes quimioterapêuticos podem provocar respostas pró-sobrevivência caracterizadas pela capacidade aumentada para tornar inócua quimioterapêuticos [2], [3]. Embora as células cancerosas invocar inúmeras estratégias para anular toxinas, um controlo apertado sobre os níveis de ROS representa uma grande resposta adaptativa [4]. A garantia de que os níveis de ROS permanecer na faixa non-toxic é um desafio contínuo para as células cancerosas De fato, as células cancerosas estão continuamente expostas a altos níveis de ROS produzidas pelo metabolismo aeróbio comprometida, quimioterápicos, privação de nutrientes, e de acolhimento respostas imunes [5], [ ,,,0],6], [7]. Se não for controlada estas transportadoras de elétrons singlet pode danificar macromoléculas celulares essenciais que conduzem à morte celular [8], [9]. Assim, um conjunto de estratégias de defesa anti-oxidantes são invocadas pelas células cancerosas para manter os níveis de ROS dentro de limites toleráveis.

A indução de UCP2 representa um dos muitos mecanismos adaptativos invocadas pelas células resistentes aos medicamentos para manter a homeostase ROS [10], [11]. UCP2 pertence à superfamília transportadora anião mitocondrial e possui uma elevada homologia com a proteína original é mitocondrial desacoplamento que é altamente expresso selectivamente em gordura marrom, UCP1 [12]. Vários estudos têm demonstrado que a UCP2 pode prevenir o stress oxidativo, aumentando o fluxo de protões dentro da matriz tornando assim electrões fluem através dos complexos respiratórios mais eficientes [13], [14], [15]. Esta função de UCP2 pode ser especialmente importante em células cancerosas já que suas mitocôndrias são metabolicamente anormal [16].

ROS são um subproduto inerente de respiração aeróbica desde complexos respiratórios mitocondriais I e III pode participar de elétron singlet redução do oxigênio diatômico [17]. Aproximadamente 0,2-2% do O

2 metabolizado pela mitocôndria é convertido para ROS [18]. No entanto, a geração de ROS pode ser bastante reforçada por condições que o excesso de oferta equivalentes redutores para os complexos respiratórios, aumentando assim o potencial de membrana mitocondrial (

Δψ

m). Na verdade, ele tem sido relatada em vários estudos que a formação de ROS pela cadeia respiratória é fortemente dependente de

Δψ

m [19], [20]. Assim, mesmo ligeira despolarização da

Δψ

m pode melhorar o fluxo de elétrons através dos complexos e diminuir a produção de ROS mitocondrial. UCP2 pode cumprir esse papel desacoplamento em células cancerosas; Outros relatórios descrevem a expressão de outras proteínas, incluindo desacoplamento UCP3 e UCP5 em células de adenocarcinoma do cólon e do cancro [21], [22]. De fato, vários

in vivo

e

in vitro

estudos têm mostrado que UCP2 é um

bona fide

desacoplador da fosforilação oxidativa e limita dano oxidativo aos tecidos, enquanto a perda da função UCP2 aumenta a produção de ROS mitocondrial [13], [23], [24], [25], [26]. Além disso, a actividade de desacoplamento de UCP2 é pensado para proporcionar um circuito fechado de realimentação negativa para o controlo de formação de ROS aguda por mitocôndrias [27]. Assim, UCP2 pode desempenhar um papel fundamental na resposta adaptativa das células cancerosas para quimioterápicos.

A inibição de mecanismos de resistência a drogas representa um método para sensibilizar células cancerosas para quimioterápicos [21], [22]. superexpressão UCP2 foi descrito em vários tipos de cancro, incluindo células de leucemia, células de cancro do cólon humanos, tumores da tiróide, e hepatomas [28], [29], [30], [31]. Muito recentemente, UCP2 knock-down também foi mostrado para melhorar os efeitos tóxicos da cisplatina quimioterapêutico [32]. Mais intrigante, UCP2 sobreexpressão tem sido sugerido para ser parte do mecanismo adaptativo requerido para a sobrevivência de células cancerosas em ambientes adversos [11]. Por exemplo, a sobre-expressão da UCP2 em células cancerígenas do cólon humano HCT116 diminui os efeitos pró-apoptóticos da quimioterápicos, etoposídeo e doxorrubicina [33]. Isto também foi observado com L1210 /DDP células leucémicas resistentes aos medicamentos que utilizam UCP2 para extinguir ROS induzida por quimioterapia por meio de um mecanismo de escape de protões [10]. Assim, UCP2 pode representar um alvo único para a sensibilização das células resistentes a fármacos quimioterapêuticos para. O objectivo do presente estudo foi o de testar a hipótese de que genipina, um extracto de

Gardenia jasminoides

qual foi demonstrado inibir a UCP2 e melhorar a secreção de insulina, pode inibir a UCP2 nas células cancerosas resistentes a drogas MX2 para aumentar oxidativo estresse e susceptibilidade a agentes citotóxicos. Genipina foi mostrado como sendo um inibidor altamente selectivo de UCP2. Na verdade, vários estudos forneceram evidências de que genipina impede especificamente UCP2 mediada vazamento de prótons em células beta pancreáticas, mitocôndrias renais e no tecido cerebral [34], [35]. Digno de nota é também o fato de que genipina é um remédio tradicional chinesa para o tratamento da diabetes mellitus tipo 2 [35].

Resultados e Discussão

genipina sensibiliza as células de leucemia resistentes aos medicamentos à toxicidade ROS

o surgimento de fenótipos cancerosas resistentes a drogas é acompanhada pela aquisição do controle eficiente sobre ROS homeostase. UCP2 é um importante modulador da produção de ROS nas células cancerosas resistentes a drogas [10], [11]. Esta proteína de membrana interna mitocondrial é expresso em níveis elevados em células resistentes a drogas e foi demonstrado que desempenha um papel chave na redução estresse oxidativo [10], [36]. Deste modo, procurou-se determinar se a inibição química de UCP2 poderia tornar as células resistentes a drogas mais sensíveis aos agentes citotóxicos. As células resistentes aos medicamentos MX2 mostraram aumento da resistência à menaquinona produtores de superóxidos, menadiona (Figura 1A). Menadione produz ROS pelo ciclismo rapidamente entre a quinona e estadual semiquinona e é usado frequentemente para imitar o estresse oxidativo [37]. Com efeito, HL-60 viabilidade diminuída substancialmente após tratamento com 10 uM de menadiona. Além disso, a exposição de células HL-60 a 100 pM menadiona resultou num decréscimo de 90% na viabilidade celular. No entanto, as células retidas MX2 viabilidade das células com concentrações de menadiona até 100 uM (Figura 1A). A análise de imunotransferência mostrou que as mitocôndrias das células MX2 continham quantidades mais elevadas de proteína UCP2 (Figura 1B). Em contraste com outros estudos, verificou-se que o anticorpo anti-N19 proporciona-se um sinal quimioluminescente muito claro [38]. A mobilidade electroforética de UCP2 foi confirmada utilizando lisado de baço. O anticorpo anti-C20 não proporcionar um sinal, mesmo com o lisado de baço (dados não apresentados). A análise Immunoblot revelou apenas ligeiros aumentos em outras enzimas de defesa anti-oxidantes nas células MX2 (Figura 1B). Portanto, embora as células resistentes a drogas MX2 aumentar várias enzimas de defesa anti-oxidantes, para aumentar a movimentação de ROS, UCP2 exibe o maior aumento na expressão quando comparada com a HL-60 homólogo sensível a drogas. A especificidade de genipina de UCP2 foi confirmada utilizando células CHO estavelmente transfectadas com UCP2 ou controlo de vector vazio. Imunotransferência confirmaram que UCP2 é expressa apenas nas células CHO-UCP2 (Figura 1C). A única banda em cada pista das imunotransferências também alinhados em ~32 kDa, indicando a especificidade do anticorpo para a proteína UCP2.

in situ

bioenergéticos determinações em células CHO estavelmente transfectadas com vector vazio ou UCP2 foram utilizadas para testar a especificidade de genipina. Medição de OCR basal antes de genipina de tratamento revelou que as células CHO-UCP2 exibida uma significativamente maior taxa de consumo de oxigénio que foi ~18% mais elevada do que as células CHO-VE (852,523 ± 45,838 OCR /mg de proteína de CHO-UCP3 vs 721,352 ± 15.050 OCR /mg de proteína de CHO-EV, p 0,05, n = 3). No entanto, o tratamento genipina (20 e 50? M) conduzir a uma diminuição de 12 e 22% no OCR das células CHO-UCP2 em comparação com as células CHO-EV (Figura 1C). Assim, estes dados ilustram claramente a acção inibidora específica de genipina de UCP2. É digno de nota que o tratamento genipina não teve efeito sobre o OCR das células CHO-EV, ilustrando a especificidade de genipina de UCP2.

A) A viabilidade de células HL-60 (losangos a cheio) e MX2 (preenchido quadrada) após a exposição a menadiona. As células foram expostas durante 24 horas a diferentes concentrações de menadiona (0-100 nmol /L), seguida pela avaliação do número de células vivas. A viabilidade foi expressa como uma percentagem do valor de controlo. De Kruskall-Wallis, com um teste post-hoc de Mann-Whitney; n = 3, p 0,05. * Indica significância estatística para células HL-60 em comparação ao controle e # indica significância estatística para MX2 relação ao controle. B) A análise de imunotransferência de enzimas de defesa anti-oxidante e UCP2. As mitocôndrias de MX2 (M) e células HL-60 (H) foram isolados e analisados ​​por UCP2, MnSOD, e GPx4. Citosol foi utilizado para determinações G6PDH. NADP-ICDH serviu como controlo de carga para o citosol e fracções mitocondriais. Baço lisado (100 ug) foi utilizada como um controlo de carga UCP2. O peso molecular de UCP2 foi confirmada utilizando marcadores de massa molecular. C)

A análise in situ

da especificidade da genipina para UCP2. Após a determinação das taxas de consumo de oxigénio basal, o impacto de genipina em OCR em células CHO-UCP2 (barras brancas) foi avaliada células. As células foram expostas a (0-50 uM) genipina durante 15 min e, em seguida, foi testado OCR. Os dados foram expressos como uma% de CHO-EV OCR.

INSET

: análise de imunotransferência de UCP2 em células CHO-UCP2 e CHO-EV. SDH serviu como controlo de carregamento. De Kruskall-Wallis, com um teste post-hoc de Mann-Whitney; n = 3, p 0,05. * Indica a significância estatística quando comparado com o controlo. D) Avaliação da toxicidade genipina e a resposta das células HL-60 resistente a drogas e sensíveis MX2-drogas para o tratamento simultâneo com menadiona e genipina. As células foram expostas a genipina (0-500 nmol /L) na presença ou na ausência de 20 uM de menadiona durante 24 h. Após a exposição, foi determinada a viabilidade das células. ♦ e ▪ representam a exposição a qualquer genipina ou genipina + menadione. A viabilidade foi expressa como uma percentagem do controlo. De Kruskall-Wallis, com um teste post-hoc de Mann-Whitney; n = 3, p 0,05. * Corresponde a significância estatística quando as células expostas a ambos menadione e genipina foram comparados com o controle. # Corresponde a significância estatística quando as células expostas ao genipina foram comparados com as células de controlo. E) O tratamento com genipina e menadione aumenta a morte celular MX2. MX2 células foram expostas a 20 umol /L de menadiona e genipina (0-500 nmol /L) durante 24 h. A quantidade de morte celular foi determinada utilizando o ensaio de PI. 1-way ANOVA com um teste post-hoc de Tukey, n = 5, p 0,05. * Representa significância quando comparado a 0 �.

É evidente a partir dos dados acima que as células MX2 expressam quantidades elevadas UCP2 e genipina inibe especificamente a UCP2. Em seguida foi avaliado se genipina poderia sensibilizar as células MX2 à toxicidade menadione. Bem como a sua utilização no tratamento de diabetes de tipo 2, genipina tem sido empregues para o tratamento de glioma, hepatomas, e tem propriedades anti-inflamatórias [35], [39], [40], [41]. No entanto, a escassez de informação existe sobre a toxicidade genipina. Os nossos resultados mostram que as concentrações mais elevadas do que genipina 50 uM resultou na perda de viabilidade celular em ambas as HL-60 e MX2 culturas (Figura 1D). Isto é muito provavelmente devido à sua capacidade de recticulação de proteínas. resultados de reticulação genipina na produção de um pigmento azul. No entanto, nenhum pigmento azul foi observada em concentrações de genipina 100 uM (dados não apresentados). As concentrações inferiores a 50 ^ M não teve impacto significativo sobre a viabilidade de qualquer MX2 ou células HL-60. Mais importante, a exposição de células MX2 a uma combinação de menadiona 20 uM e genipina (concentração tão baixa quanto 10 uM) resultou numa diminuição acentuada da viabilidade celular (Figura 1D). Houve um aumento na viabilidade MX2 após exposição a 100 uM em combinação com genipina menadiona no entanto ainda havia uma redução significativa na viabilidade quando comparados com o controlo. O efeito sensibilizante da genipina para menadiona foi confirmada utilizando o ensaio de PI. A exposição de células MX2 durante 24 h a 20 uM na presença de menadiona de 10 ou 20 uM genipina resultou num aumento de 2 vezes e 8 vezes na morte celular, respectivamente (Figura 1E). Em contraste, as concentrações de menadiona ≥50 uM foram necessárias para induzir a morte MX2 genipina quando estava ausente (Figura S1). Além disso, o aumento da morte celular era várias vezes superior quando foi incluído genipina. captação de iodeto de propídio pode ocorrer em ambas as células apoptóticas e necróticas. Assim, medimos vários marcadores de apoptose. N activo caspase-3 foi detectada e citocromo C estava ausente do citosol consistentes com a indução de necrose (dados não mostrados). Embora esses dois biomarcadores de apoptose não foram detectados, uma análise mais aprofundada do mecanismo de morte celular é necessária. Também avaliou o impacto de diferentes quantidades de genipina na linha celular de mioblastos C2C12 não-cancerosas. mioblastos C2C12 apresentado um aumento na morte celular quando tratada com ≥50 genipina uM (Figura S1). Estas observações indicam que a genipina não induz uma perda significativa da viabilidade celular em concentrações inferiores a 50 uM e os efeitos de genipina nas células MX2 são, devido às suas interacções com UCP2. Apesar dessas observações, mais

in vivo

análises sobre a toxicidade de genipina e sua aplicabilidade para o tratamento de câncer no contexto clínico são necessários. Assim, genipina sensibiliza as células resistentes a drogas expressam a UCP2 agentes ROS-produtoras.

genipina sensibiliza células para MX2 antraciclina toxicidade

menadiona foi demonstrado ter um efeito anti-cancro e tem sido empregada com mitomicina C em ensaios de fase II para o tratamento de câncer de pulmão avançado [42]. No entanto, menadiona não está actualmente empregue como um agente quimioterapêutico do cancro. Assim, determinou-se genipina poderia sensibilizar as células a MX2 quimioterapêuticos vulgarmente utilizados, especificamente do baseada quinona antraciclinas, doxorubicina e epirubicina. MX2 células são bem conhecidos por serem resistentes a esta classe de agentes quimioterapêuticos [43]. Como mostrado na Figura 2A, as células MX2 foram mais resistentes a concentrações aumentadas epirubicina (0,5 um) em contraste com a sua contrapartida sensível a drogas. No entanto, os aumentos acentuados nos morte celular foi observada nas células tratadas com genipina MX2 expostas a quantidades crescentes de epirrubicina (Figura 2A). Curiosamente, genipina e epirrubicina (0,05-0,1 ^ M) de co-tratamento aumentou a morte celular nas células HL-60, mas esta resposta foi anulado em doses mais elevadas de epirrubicina (0,5 uM, as células MX2 apresentado um aumento de quatro vezes, enquanto que as células HL-60 apresentado um aumento de 2 vezes). MX2 células também eram resistentes a tratamento com doxorrubicina (Figura 2B). Curiosamente, as células HL-60 é indicado apenas uma tendência para o aumento da morte celular, no entanto significância estatística não foi atingido (0,05-0,5 uM doxorrubicina, apenas um aumento de 20-40%; p 0,05). A observação importante na Figura 2B é o aumento significativo na morte celular após tratamento com MX2 genipina e doxorrubicina (0,05-0,5 uM; ~50-110%; p 0,05). O efeito sensibilizador de genipina não foi observado nas células HL-60 tratadas com doxorrubicina, que é consistente com a acção inibidora de genipina de UCP2. A utilização de concentrações de epirrubicina e doxorrubicina acima de 1 uM em combinação com genipina resultou em aumentos drásticos na morte de células de HL-60 e células MX2 (dados não mostrados). Assim, genipina desarma resistência quimioterapêutico em células resistentes a fármacos que sobre-expressam UCP2.

HL-60 e MX2 células foram cultivadas até 70% de confluência e, em seguida, expostas quer a epirrubicina (0-0,5 M) ou doxorrubicina (0-0,5 ^ M) na ausência ou na presença de 20 uM genipina. Quantidade de morte celular foi determinada por ensaio de PI. Os resultados foram expressos como uma percentagem do controlo. A) ♦ epirubicina somente, ▪ epirubicina + genipina. 1-way ANOVA com um teste post-hoc de Tukey, n = 5, * p 0,05. * Corresponde a significância estatística quando epirrubicina e células genipina tratados foram comparados com o controle. # Corresponde a significância estatística quando as células tratadas com epirubicina foram comparadas com células de controlo. B) ♦ doxorrubicina somente, ▪ doxorrubicina + genipina. 1-way ANOVA com um teste post-hoc de Tukey, n = 5, p 0,05. * Corresponde a significância estatística quando epirrubicina e células genipina tratados foram comparadas com células de controlo.

tratamento genipina perturba a respiração aeróbia em células resistentes aos medicamentos

Apesar do fenótipo glicolítica das células cancerosas, a maquinaria enzimática necessária para a respiração aeróbia frequentemente permanece intacto [44]. Manutenção das mitocôndrias funcionais é crucial para a célula cancerosa,

por exemplo.

, As enzimas do ciclo de Krebs fornecer precursores anabólicos para células em divisão rápida [6]. Nosso grupo tem mostrado previamente que as mitocôndrias nas células de leucemia resistentes aos medicamentos são desacoplado e que esta está associada à diminuição dos níveis de ROS celulares [10]. Assim, a hipótese de que o efeito sensibilizante da genipina foi devido à sua capacidade de evitar qualquer desacoplamento mediado por UCP2 do

Δψ

m. Como mostrado na Figura 3A, a taxa de consumo de oxigénio basal foi maior no MX2, quando comparado com as células HL-60 (~54% maior, p 0,05). Isto indica que as mitocôndrias em células MX2 são metabolicamente mais activos do que a HL-60 mitocôndrias. O tratamento das células HL-60 e células MX2 com oligomicina respiração diminuída por -60% e ~38%, respectivamente (Figura 3A). Isso indica que ~62% do O celular descansando

2 consumo nas células MX2 é devido à respiração desacoplado (

por exemplo.

Não-ATP produzindo atividades). desvios afiados no metabolismo mitocondrial muitas vezes acompanham a aquisição de fenótipos agressivas de câncer [6]. Com efeito, ruptura direccionada do metabolismo mitocondrial tem sido descrita como uma potencial terapia do cancro [2]. Pré-tratamento com genipina diminuiu significativamente respiração basal nas células MX2 (Figura 3A). Estes efeitos não foram observados em células HL-60. Genipina induziu um decréscimo ~37% na taxa respiratória é revelando que UCP2 quantitativamente importantes na manutenção de um fenótipo mitocondrial desacoplada, mesmo sob condições de incubação padrão. Em comparação, as células CHO-UCP2 experimentou um declínio ± 22% no OCR a seguir ao tratamento com 50 uM genipina (Figura 1C). A discrepância entre as células CHO e MX2 é muito provavelmente devido às diferenças da dose e do tempo de exposição entre as duas linhas de células separadas. Esta observação indica global que UCP2 é um dos principais contribuintes para bioenergética celular MX2. Além disso, a seguir à adição de genipina de oligomicina-tratados células MX2, a taxa de respiração foi idêntico ao das células HL-60 (Figura 3A). Isto indica que a UCP2 estava inteiramente responsável pela respiração aumentada de células MX2. Vários estudos têm mostrado que inibe especificamente genipina desacoplamento mediado por UCP2 [34], [45]. Por exemplo, Zhang

et ai

ilustrado que a perda de protão não é afectada pela genipina em UCP2

– /- e as células no tecido que não expressa UCP2 [35]. Observou-se tendências semelhantes nas células CHO expostos a genipina (Figura 1C). Assim, genipina completamente inibe o aumento da respiração celular nas células MX2, enquanto que não tem efeito sobre as células-mãe HL-60.

medições A) consumo de oxigénio em células expostas a 20? M genipina 24 h de exposição. medição do consumo de oxigénio foram realizadas seguindo uma incubação de 30 minutos no meio de reacção na ausência (barras brancas) ou na presença (barras cinzentas) do oligomicina. 1-way ANOVA com um teste post-hoc de Tukey, n = 6, ** p 0,01. células MX2 tratada ou HL-60 só foram comparadas com seu controle correspondente valores médios. B) medição do consumo de oxigênio em células expostas a genipina (20 mM) e /ou menadiona (20 �) durante 24 h. Um ANOVA de uma via com um post-hoc de Tukey, n = 4, * p 0,05,

UCP2 é conhecida por ser um regulador negativo da produção de ROS mitocondrial, uma propriedade atribuída ao seu desacoplamento leve atividade. Em dois estudos elegantes, Echtay

et al

forneceram evidências convincentes de que a condutância de protões mediada por UCP2 é maximamente ativado pelo estresse oxidativo nas mitocôndrias [27], [46]. Este tipo de vazamento “indutível” protão tem sido descrita como uma salvaguarda importante na prevenção de aumentos na emissão de ROS mitocondrial. Assim, testamos se o tratamento ROS poderia aumentar vazamento de prótons nas células MX2. Menadiona tratamento não alterou o consumo de oxigénio nas células MX2 (Figura 3B). Estes dados indicam que ROS não causar novos aumentos nos vazamento de prótons respiração dependente. No entanto, nas células HL-60, o tratamento de menadiona diminuiu significativamente o consumo de oxigénio, talvez devido à diminuição da capacidade destas células para controlar os níveis de ROS celulares (Figura 3B). metabolismo mitocondrial (

por exemplo.

, enzimas do ciclo do ácido cítrico e proteínas da cadeia de transporte de elétrons) é um dos principais alvos de toxicidade ROS. Assim, a diminuição do consumo de oxigénio observada nas células HL-60 expostas a menadiona indica estas células têm uma menor capacidade para manter os níveis toleráveis ​​de ROS celular na presença de agentes citotóxicos. Os dados acima estabelecem que UCP2 previne deficiências induzidas ROS no metabolismo mitocondrial. Em outras palavras, a baixa abundância de UCP2 nas células HL-60 pode significar que eles são incapazes de desintoxicar o ROS. Nas células MX2, nossos resultados suportam a conclusão de que UCP2 já está maximamente activado. Na verdade, em duas experiências separadas (Figura 3A e 3B) genipina diminuiu o consumo de oxigénio pelo ~37% em células sob condições de incubação padrão. Além disso, a respiração nonphosphorylating representaram ~62% do O

2 consumo nas células MX2 inibido genipina e mais de metade deste respiração, resultando na normalização da respiração não fosforilar (

ie

, para HL valores -60). Assim, UCP2 é responsável por uma grande fracção da respiração nonphosphorylating em células MX2. Assim, o perfil metabólico original das células cancerosas resistentes a drogas parece incluir reforçada desacoplamento mitocondrial mediada por UCP2 para evitar os efeitos citotóxicos de ROS droga e transmitidas por mitocondrial.

O tratamento com genipina aumenta ROS induzida por drogas

produção

os dados acima indicam que a inibição de UCP2 por genipina resultados na indução da morte celular induzida pelo fármaco em células de MX2 multirresistentes. Uma vez que a inibição UCP2 sensibiliza células para agentes ROS-produtoras, que, em seguida, testado se o tratamento genipina aumentada formação de ROS induzida por drogas. células tratadas com menadiona HL-60 sozinho produziu muito mais do que a sua contraparte de ROS resistente a medicamentos (Figura 4A). Esta observação é consistente com a capacidade de manuseamento de ROS aumentada de células resistentes aos medicamentos. No entanto, o co-tratamento de células com genipina MX2 e menadiona aumentou os níveis de ROS. Com efeito, a exposição das células tratadas MX2-genipina a diferentes quantidades de menadiona resultou num aumento dos níveis de ROS (Figura 4B). Aos 50 mM menadione, houve um aumento acentuado dos níveis de ROS nas células MX2 expostos-genipina. Apenas aumentos moderados de produção de ROS foram observados em células HL-60 tratadas com menadiona e genipina (Figura 4B). O tratamento com genipina sozinho em células MX2 não aumentou os níveis de ROS (Figura 4B). Assim, genipina torna as células MX2 mais sensíveis ao tratamento com agentes de produção de ROS, interferindo com a fuga de protões.

os níveis de ROS foram avaliadas em células HL-60 e células intactas utilizando MX2 DCFH-DA. A) os níveis de ROS em células expostas a menadiona unicamente (0-50 uM), durante 24 h. 1-way ANOVA com um teste post-hoc de Tukey, n = 5, * p 0,05. B) os níveis de ROS em células expostas a 0 ou 20 uM genipina e menadiona (0-50 uM), durante 24 h. 1-way ANOVA com um post-hoc teste de Tukey, n = 5, * p 0,05, ** p . 0,01

Foram feitas observações semelhantes com doxorrubicina. A doxorrubicina é classicamente referidos como um inibidor de topoisomerase II [47]. No entanto, outros mecanismos de toxicidade, tais como a produção de ROS, foram sugeridas [48]. O tratamento com doxorrubicina resultou num aumento dependente da dose nos níveis de ROS nas células HL-60 (Figura 5A). Em contraste, nenhum aumento no ROS foram observadas nas células MX2, mesmo em 1 uM. No entanto, quando genipina foi incluído com a doxorrubicina, os aumentos nos níveis de ROS foram observadas nas células MX2 (Figura 5B). Com efeito, a exposição das células carregadas com genipina a concentrações de doxorubicina tão baixo quanto 0,1 uM resultou num aumento acentuado dos níveis de ROS. Embora a doxorrubicina é amplamente usado como um agente anti-cancro, o seu mecanismo de acção não está completamente compreendido. Neste estudo, que mostram que a doxorrubicina pode aumentar os níveis de ROS nas células MX2 Em caso de co-tratamento com genipina. É perfeitamente possível que a toxicidade de doxorubicina tem como alvo as mitocôndrias. As antraciclinas são moléculas de quinona, como menadiona, que são capazes de catalisar a redução de electrões singleto de oxigénio diatómico de superóxido. Superóxido, em concentrações suficientemente elevadas, interferem com o funcionamento correcto das mitocôndrias. No entanto, neste estudo, a produção de ROS e por doxorrubicina em células de menadiona MX2 necessário tratamento genipina. É inteiramente possível que as células resistentes aos medicamentos lidar com os efeitos inibitórios de doxorrubicina e quinonas, mantendo mitocôndrias em estado desacoplado limitar a formação de ROS.

níveis de ROS foram avaliadas em HL-60 e MX2 células intactas utilizando DCFH -DA. A) os níveis de ROS em células HL-60 e células MX2 expostas a doxorrubicina (0-1? M) durante 24 h. 1-way ANOVA com um teste post-hoc de Tukey, n = 5, * p 0,05, ** p 0,01. B) os níveis de ROS em células HL-60 e células MX2 expostos a genipina 20 uM e doxorrubicina (0-1? M) durante 24 h. 1-way ANOVA com um post-hoc teste de Tukey, n = 5, * p 0,05, ** p . 0,01

Nossas descobertas indicam que a genipina produto natural pode render cancro resistente a fármacos as células mais sensíveis a agentes ROS-produtoras. A aplicação clínica da genipina como um potencial agente de sensibilização drogas requer uma investigação mais aprofundada. Na verdade, os efeitos sensibilizadores de drogas de genipina foram aqui examinados com linhas comummente estudadas de células cancerosas. Assim, para fornecer mais clareza sobre o papel potencial da genipina no tratamento do câncer, abrangente

in vivo

análises são agora obrigados (

por exemplo. Estudos

, animais). No entanto, este estudo fornece alguns insights preliminares importantes sobre o uso potencial de genipina no tratamento do câncer. Neste estudo, o efeito sensibilizador de genipina foi atribuído a sua interacção com UCP2, uma proteína expressa abundantemente nas mitocôndrias de células MX2. A especificidade de genipina de UCP2 foi confirmado com células CHO que expressam estavelmente UCP2. células HL-60 foram insensível à genipina tratamento que é mais provável atribuído às baixas quantidades de UCP2 expressa nestas células. A acção inibidora específica de genipina foi confirmada utilizando células CHO que expressam, quer ou não que expressam UCP2. Assim, nossos resultados são consistentes com um efeito específico da genipina em UCP2. UCP2 é expressa em várias células normais somáticas (esplenócitos, células p pancreáticas, células do timo, e várias outras células do tipo imune) [26]. A quantidade expressa em células de cancro resistente a fármacos ultrapassa grandemente os níveis de proteína em células não-cancerosas e as células cancerosas sensíveis a fármacos. Os níveis de proteína UCP2 baixo são mantidos pelo controle de translação apertado e rápida degradação [49]. Curiosamente, a glutamina tem sido implicado na indução de ARNm de UCP2 tradução [50] e as células cancerosas resistentes a fármacos têm melhorado a absorção e metabolismo da glutamina, um processo mediado por Myc [51]. Assim, é possível que a dependência glutamina desempenha um papel no aumento da expressão da proteína UCP2 em células resistentes a fármacos. Seria interessante determinar se UCP2 pode ser induzida por Myc. Neste estudo, o mecanismo para a redução mediada por UCP2 das ERO resulta da sua actividade de desacoplamento.