Abstract

carcinoma hepatocelular (HCC) é o quinto câncer mais comum em todo o mundo. β-catenina, o orquestrador central da via Wnt canônica e um oncogene conhecido é fundamental em HCC patogênese. A administração de fenobarbital (PB) contendo água (0,05% w /v) como promotor tumoral após intraperitoneal injectado dietilnitrosamina (DEN) A injecção inicial (IP) (5 ug /peso corporal g) como um indutor de tumor é um modelo vulgarmente utilizado para estudar HCC em ratos. Aqui, nove ratos de quinze dias macho β-catenina knockout (KO) e quinze controles da mesma ninhada de tipo selvagem (WT) foram submetidos a tratamento DEN /PB e foram examinados para tumorigênese hepática em oito meses. Paradoxalmente, uma carga tumoral significativamente mais elevado foi observado em KO (p 0,05). Tumores em KO foram β-catenina e glutamina sintetase negativo e HGF /Met, EGFR sinalização IGFR era normal. Um aumento significativo na PDGFRα e o seu ligando PDGF-CC que conduz a um aumento da fosfotirosina-720-PDGFRα foi observada em ratinhos KO portadores de tumores (p 0,05). Simultaneamente, estes fígados exibida aumento da morte celular, activação de células estreladas, fibrose hepática e proliferação celular. Além disso, PDGF-CC induzida significativamente a proliferação de células de hepatoma especialmente após a supressão β-catenina. Nossos estudos também demonstram que o protocolo /PB utilizados DEN na /6 ratinhos WT C57BL não selecionou de mutações genéticas β-catenina durante hepatocarcinogênese. Assim, DEN /PB reforçada HCC em ratinhos sem β-catenina no fígado pode ser devido à sua inaptidão para a sobrevivência da célula que regula, que conduz a fibrose aumentada e a regeneração através da activação PDGFRα. β-catenina downregulation também fez células de hepatoma mais sensíveis à tirosina quinases receptor e, portanto, pode ser explorada para a terapêutica

Citation:. Awuah PK, Rhieu BH, Singh S, Misse A, Monga SPS (2012) β-catenina perda em hepatócitos Promove cancro hepatocelular após dietilnitrosamina e fenobarbital administração a ratinhos. PLoS ONE 7 (6): e39771. doi: 10.1371 /journal.pone.0039771

editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 27 Abril de 2012; Aceito: 30 de maio de 2012; Publicação: 25 de junho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Awuah et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede 1R01DK62277 (Instituto Nacional de Doenças digestivas e do rim) e 1R01CA124414 (Instituto Nacional do Câncer) para SPSM e pelo Fundo das Rango para o Aperfeiçoamento de Patologia Research. P.K.A. foi financiado em parte por T32 EB001026 (Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma hepatocelular (HCC) é o quinto câncer mais comum ea terceira causa de morte por câncer em todo o mundo [1]. Há uma forte necessidade para delinear as alterações moleculares responsáveis ​​pela iniciação e exacerbação da doença. A fim de estudar as perturbações celulares e da molécula em CHC, muitas estratégias pré-clínicos empregar o uso de modelos genéticos e químicas da carcinogénese. A administração de dietilnitrosamina (DEN) isoladamente ou em conjunto com fenobarbital (PB) em ratinhos é frequentemente utilizado para induzir HCC em ratinhos.

Uma via de importância crítica para o HCC é a sinalização /β-catenina Wnt. β-catenina é o efector central da sinalização de Wnt canónica, que é uma via altamente conservada regulação de processos celulares críticos, tais como a proliferação, diferenciação, sobrevivência e auto-renovação [2], [3], [4], [5]. Na ausência de Wnt, β-catenina é fosforilada na serina amino-terminal e resíduos de treonina e direccionado para a ubiquitinação [6]. Após a ligação da proteína Wnt ao seu receptor da superfície celular e Frizzled de co-receptor lipoprotein- baixa densidade proteína relacionada com 5/6 (Lrp5 /6), um sinal é transduzida através revoltos que permite a inactivação do complexo composto de degradação de glicogénio sintase quinase 3β (GSK3β), polipose adenomatosa produto do gene coli (APC) e a caseína cinase Iα, que permite β-catenina a dissociar-se e translocam-se para o núcleo para se ligar ao factor de células linfóides de ligação ao potenciador /factor T (LEF /TCF) da família de proteínas de genes-alvo transactivar. A via /β-catenina Wnt tem sido implicada em um subconjunto de HCC em que mutações de activação do gene β-catenina (

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) têm sido relatados em 20% -40% dos pacientes [7], [8 ]. Knockdown de β-catenina em células de hepatoma leva à diminuição do crescimento e sobrevivência. Pelas razões acima mencionadas, β-catenina é um oncogene bem reconhecido e considerado um alvo terapêutico valioso.

Com este pano de fundo, temos a hipótese de que a falta de β-catenina em hepatócitos pode proteger contra a carcinogênese induzida pelo química especialmente em um modelo onde HCC é concebida através da indução de tumor por DEN e promoção do tumor através do uso contínuo de PB [9], [10]. Nós usamos ratos machos condicional específico do hepatócito β-catenina knockout (KO) e controles da mesma ninhada de tipo selvagem pareados por sexo (WT) para estudar tumorigênese em resposta a DEN /PB. Relata-se um aumento paradoxal na tumorigénese hepática na ausência de β-catenina que foi atribuível a lesão aumentada, fibrose e subsequente regeneração, que parecem ser conduzidos por um receptor de quinase em vez não clássica epitelial do receptor tirosina PDGFRα. Também demonstramos que utilizando o protocolo /PB comumente empregues DEN em ratinhos C57BL /6, a tumorigénese não ocorre por meio de mutações β-catenina como é observada em ratinhos C3H. Por último, β-catenina inibição levam à ativação PDGFRα e, portanto, pode fazer as células de hepatoma mais passíveis de receptor tirosina quinases inibição para terapias.

Resultados

perda de β-catenina em hepatócitos engendra reforçada hepatocarcinogênese em camundongos em resposta ao DEN /PB

WT e KO ratinhos machos (C57BL /6) receberam uma única dose (5 mg /grama) de injecção DEN no dia pós-natal 14 dias e duas semanas mais tarde permitiu

ad libitum

acesso a PB contendo água potável para 8 meses em que ratos de tempo foram examinadas para os tumores do fígado (Fig. 1A). Curiosamente, os ratinhos que carecem β-catenina em hepatócitos indicadas significativamente melhorada tumorigénese de ratinhos WT que foi grosseiramente apreciável quanto maiores e um maior número de tumores (Fig. 1B). H E de coloração foi também empregue para determinar a focos microscópicos de tumor em ambos os grupos de animais (Figura 1C.). O número total de focos foram contadas em secções representativas de quatro lóbulos do KO e WT, que mostram significativamente mais tumores em KO, em comparação com o WT (p 0,05) (Fig. 1D).

estratégia experimental resumindo DEN tratamento /PB em camundongos KO e WT. A. fotografias representativas dos fígados portadores de tumor em DEN /PB tratados KO e WT no momento da colheita aos 8 meses de idade. B. DEN /PB induzida focos do tumor microscópico (delineado por pontas de seta) visualizada por H E no WT e KO fígados aos 8 meses de idade. C. Um aumento significativo em focos de tumor microscópico em KO, em comparação com WT (p 0,05). Os tumores foram contados da H E seções coradas representam 4 lobos do fígado de cada KO e WT animais em DEN protocolo /PB

fígados β-catenina KO após DEN /PB mostras de tratamento aumento da morte celular, estreladas. ativação celular e fibrose e proliferação do tumor

em seguida, dirigiu-se aos mecanismos celulares que podem ser a base de desenvolvimento de neoplasias reforçada em KO. Identificamos os números mais elevados de hepatócitos de TUNEL positivos em Ko aos 8 meses após DEN /OP, em comparação com WT tratados de modo semelhante, sugerindo uma maior morte celular (Fig. 2A). Houve um aumento de acompanhamento na proliferação de células do parênquima hepático em KO que superou o de WT (Fig. 2A). Além disso, os ratinhos KO exibiram um aumento dramático no número de actina de músculo liso-α, que identifica células estreladas activadas que são responsáveis ​​pela deposição de colagénio e de fibrose (Fig. 2A). Concomitante a activação de células estreladas, observou-se fibrose aumentada por coloração com Tricromo de Masson no KO, em comparação com o WT (Fig. 2B). De facto, apenas um dos 15 animais WT após DEN /PB desafio mostraram fibrose, que foi comparável a fibrose no KO. Todos juntos, os nossos resultados sugerem que a maior tumorigênese em fígados KO foi associada com significativamente maior de morte e proliferação celular (Fig. 2C), e fibrose hepática também.

A. Representante portador de tumor KO fígados mostram aumento da morte de células do parênquima (TUNEL), uma maior activação de células estreladas (α-SMA) e aumento da proliferação de células do parênquima (PCNA) em comparação com WT. B. Aumento da fibrose hepática (azul) em ratos com fígados KO é evidente pela coloração Masson Tricromio em relação ao controle. C. PCNA- e células positivas TUNEL foram contados em 4 secções aleatórias de 5 representativos KO WT e os fígados. Um aumento significativo tanto em células do parênquima positiva TUNEL PCNA e era evidente em fígados KO, em comparação com WT após o tratamento DEN /PB.

Os tumores em fígados KO após DEN /PB não são compostas de β-catenina hepatócitos -positivas

Uma vez que tem havido relatos de nosso laboratório e outros que em resposta a lesões específicas, não há pressão sobre os hepatócitos que podem ter escapado supressão mediada por CRE, o nosso primeiro objetivo era verificar se os fígados expostos a DEN /PB do grupo KO mostrou qualquer reaparecimento de β-catenina, especialmente quando comparado com o WT. Um representante WB mostrou que todos os fígados de ratinhos KO DEN /PB exposta expressaram níveis dramaticamente inferiores de β-catenina em comparação com WT por Western blot (Fig. 3A). Isto também foi verificada por meio de uma análise imuno-histoquímica detalhada incluído numa próxima secção (Tabela 1 e Fig. 4). O baixo nível de β-catenina em fígados KO representa a sua presença nas células não parenquimatosas do fígado, que não apresentam qualquer albumina de recombinação mediada por CRE. Da mesma forma a partir de análise apresentada representativos fígados e KO WT também mostraram ausência de glutamina sintetase, um gene alvo substituto de sinalização β-catenina no KO (Fig. 3A). A ciclina D1, um outro objectivo importante da β-catenina no fígado e em outros lugares foi aumentada em mais de WT, enquanto que 09/08 KO apresentaram muito baixa ou ausente ciclina D1 em resposta a DEN /PB (Fig. 3A e não mostrado). C-Myc, um outro alvo de β-catenina, ironicamente foi maior em KO, em comparação com ratinhos WT após a exposição /PB, como mostrado na DEN um western blot representativo (fig. 3A). Assim fígados KO após DEN /PB continuar a ser negativo para β-catenina após 8 meses.

A. western blot representante de 5 WT e 4 KO fígados portadores de tumor apresenta baixa β-catenina, GS ausentes e dramaticamente inferior a ciclina D1 em KO enquanto que os níveis de c-Myc foram aumentadas. Actina verifica o carregamento igual. B. Exame de TKU nos mesmos conjuntos de animais mostra notavelmente mais baixos fosfo-met e fosfo-IGFR e apenas marginalmente inferior fosfo-EGFR, em KO que WT fígados por Western blot. GAPDH verifica carga comparáveis.

Os tumores no WT foram heterogêneos e eram positivas tanto para β-catenina e PDGFRα, ou para qualquer um deles. Em KO, quase todos os tumores não tinha qualquer β-catenina e mostrou intensa PDGFRα-positividade.

tumores em KO fígados após DEN /PB não estão associados com ativação de HCC tradicional associado tirosina-quinases receptoras.

devido a um aumento paradoxal na tumorigênese induzida PB DEN /em KO, o próximo explorado possíveis mecanismos moleculares. Tanto o factor de crescimento epidérmico (EGF) e a sinalização de factor de crescimento de hepatócitos (HGF) são agentes críticos no desenvolvimento e exacerbação de HCC [11]. Nós exploramos estado tanto total e fosforilada de receptores destas tirosina-quinases receptoras (RTK) em fígados de ratinhos KO WT e DEN /PB-tratados. É interessante notar que uma redução nos níveis totais e fosforiladas de c-Met, o receptor do HGF em animais KO, em comparação com WT (Fig. 3B). Ambos os níveis totais e fosforiladas de EGFR entre animais WT e KO permanecem inalterados (Fig. 3B). Examinámos também a insulina como receptor do factor de crescimento, uma outra via de sinalização envolvidos no carcinoma hepatocelular [11]. Notamos níveis mais elevados de fosforilação na sua o WT, em comparação com KO (Fig. 3B). Assim, RTKs clássicos não parecem ser responsáveis ​​pela HCC reforçada em KO, mas p-Met e P-IGFR são proeminentemente induzido em portadores de tumores ratinhos WT, indicando o seu papel importante no HCC.

Caracterização imuno-histoquímica de KO e WT tumores do fígado para β-catenina e PDGFRα

a seguir, caracterizou os tumores observados no WT e KO por imuno-histoquímica para a localização β-catenina. Cerca de 31% do total de focos do tumor em ratinhos WT mostrou β-catenina nuclear (Tabela 1, Fig. 4). Fora de 63 focos observada em 9 ratinhos KO, apenas dois foram compostos de células tumorais-β-catenina positivo que exibiram o seu /localização citoplasmática nuclear (dados não apresentados), enquanto outros foram negativos (Fig. 4). Este fundamentadas as observações na Fig. 3A e também demonstra que quase todos os tumores neste grupo foi constituído por hepatócitos β-catenina-negativos e não pode ser devido a expansão de células, o que pode ter retido β-catenina devido à incompleta recombinação cre-albumina.

a seguir, investigou PDGFRα sinalização, que tem sido implicado em HCC e está envolvido no crescimento do tumor, angiogénese, e manutenção do microambiente do tumor [12], [13], [14]. 54,5% de todos os focos de tumor nos ratinhos WT mostraram expressão citoplasmática PDGFRα (Tabela 1). Foram encontradas cerca de 94% de focos tumorais em Ko ser fortemente positivo para PDGFRα no citoplasma das células de tumor (Tabela 1, Fig. 4). Apenas quatro focos foram negativos para PDGFRα. Os focos dois tumor que foram-β-catenina positiva nos fígados KO foram simultaneamente positivas para PDGFRα.

Em uma análise adicional, 9 dos 55 tumores observados no WT foram concomitantemente positiva tanto para PDGFRα e β nuclear -catenina, enquanto outros eram positivas para qualquer um dos dois (Tabela 1, Fig. 4). Uma pequena fracção de tumores foram negativas para ambas as proteínas. Os dois tumores que foram compostos de hepatócitos β-catenina-positivas no KO também foram positivos para PDGFRα sinalização (Tabela 1). Em geral, a expressão foi mais elevada PDGFRα e também em maior número de focos tumorais no KO, em comparação com o WT 8 meses após a exposição DEN /PB.

DEN /PB induziu aumento tumorigénese está associada com a activação de PDGFRα de sinalização.

Para verificar aumento PDGFRα na KO sobre WT após DEN /PB, utilizamos a análise western blot. Os níveis de proteína PDGFRα foram maiores no KO que os fígados WT (Fig. 5A), e esta diferença era estatisticamente significativa (Fig. 5B). Houve um aumento modesto em níveis PDGFRβ nos fígados KO (Fig. 5A). Também identificamos um aumento notável nos níveis de proteína total do ligante PDGFRα PDGF-CC seletivo ao PDGF-AA ou PDGF-BB permaneceu inalterada entre os dois grupos (Fig. 5C).

A. Western blots representativos de 8 e 9 KO WT mostram um aumento dramático nos níveis totais de PDGFRα e aumento modesto em PDGFRβ no KO. Carregando actina verifica o carregamento igual. B. médio integrado densidade óptica (IOD) obtido a partir de autoradiografias digitalizados mostrados na Fig. 5A revelaram níveis significativamente mais elevados no PDGFRα KO (p = 0,002). C. mancha Ocidental a partir de amostras representativas mostra um aumento dramático na PDGF-CC, um ligando para PDGFRα em Ko passo que o PDGF-AA e BB permaneceu não digna entre os dois grupos. D. Bar gráfico mostra um aumento significativo na Tyr720-PDGFRα em KO, em comparação com WT (p 0,05). E. diferenças insignificantes eram evidentes em Tyr-849-PDGFRα entre a WT e KO.

Para determinar as consequências do reforço da PDGF-CC /níveis PDGFRα em KO que avaliaram os níveis de fosforilação PDGFRα em vários tirosina específica resíduos utilizando anticorpos listados nos métodos. Como se mostra nas análises densitométricas, um aumento significativo na Tyr720-PDGFRα (p 0,05) (Fig. 5D), mas não em Tyr849-PDGFRα (Figura 5E.) Ou Tyr572 /574- e Tyr754-PDGFRα (não mostrado) foi observada em KO. Estas observações demonstram activação PDGFRα em KO, o que pode estar jogando um papel importante na hepatocarcinogênese.

PDGFRα ligando estimula a proliferação de células de hepatoma apenas mediante β-catenina supressão

Para saber ainda mais a relevância da sinalização PDGFRα na ausência de β-catenina, utilizamos células do hepatoma humano. PDGF-CC foi incapaz de induzir um aumento significativo na síntese do ADN das células Hep3B quando comparado com HCl, que foi utilizado para reconstituir o PDGF em culturas celulares quase confluentes (Fig. 6). β-catenina knockdown quando comparado com ARNsi de controlo de transfecção, reduzido de forma significativa a incorporação de timidina em células Hep3B (p 0,0005) (Fig. 6). Somente após o silenciamento β-catenina, foi o tratamento de PDGF-CC capaz de induzir a síntese de ADN em células Hep3B significativa, em comparação com HCl (p 0,005). Assim β-catenina supressão activado PDGF-CC para ser mitogénico para células Hep3B.

Tratamento

PDGF-CC (10 ng /ml) não aumenta a síntese de ADN, em comparação com o tratamento de HCl de células Hep3B. β-catenina knockdown levou à diminuição significativa na incorporação de timidina, em comparação com ARNsi de controlo (p 0,0005). No entanto o tratamento de PDGF-CC conduziu a um aumento significativo na incorporação de timidina em β-catenina-suprimida, em comparação com células de controlo transfectadas com ARNsi (p 0,005).

Discussão

Para compreender a base molecular e celular do HCC em pacientes, vários modelos pré-clínicos estão em uso, incluindo DEN ou regimes DEN /PB em roedores. DEN é uma substância cancerígena comumente usado para induzir HCC em modelos de roedores, no entanto, tem alta especificidade tensão. Em ratinhos C57BL /129Sv × ratinhos C3H /He, uma estirpe mais susceptível a hepatocarcinogenese, injecção DEN a cerca de 6 semanas de idade numa dose de 90 ug /peso corporal GM, induz HCC através de mutações Ha-ras, enquanto que a inclusão de PB em beber água após 3 semanas de DEN, promove tumorigênese devido ao

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mutações. [15]. No entanto, outro estudo em ratinhos B6C3F1 machos, obtidos pelo intercruzamento fêmea C57BL /6J e C3H ratinhos macho /HeJ, injectado DEN a 10 ug /g peso de corpo a 3 semanas de idade, sem PB, mostraram através CHC

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mutações [16]. Outro modelo utiliza DEN a uma dose de 5 ug corpo /g em ratinhos C57BL /6, uma estirpe relativamente resistentes à HCC. Aqui, DEN induz aductos de ADN em hepatócitos submetidos a divisão celular, e, eventualmente, conduz ao desenvolvimento de HCC [17], [18]. Inclusão de PB melhora tumorigênese via sua capacidade promover tumor [9], [10]. Em nosso estudo, mostramos que ao contrário de camundongos C57BL /129Sv × C3H /He, DEN /PB tumores hepáticos induzidos em ratos C57BL /6 não apresentaram localização nuclear /citoplasmático da β-catenina e, portanto, não causa seletivamente HCC via

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mutações. Assim consideração a linhagem de rato para estudar tumorigênese em resposta a protocolos específicos é altamente relevante.

Muitas vias amplamente classificados em Ras /MAPK, PIK3CA /AKT, e sinalização /β-catenina Wnt, foram mostrados para ser de importância no HCC [11], [19]. β-catenina, o orquestrador central da via de sinalização Wnt, é um oncogene conhecido devido às suas implicações em uma variedade de cancros, incluindo 20% -40% de todas as HCCs [20]. Curiosamente, porém, a sobre-expressão de ambos os de tipo selvagem ou mutante de forma β-catenina em fígados de murino é incapaz de induzir HCC espontânea [21], [22], [23], [24]. No entanto, na presença de um outro “hit” sob a forma de um transgene ou um carcinógeno químico, estes vários ratinhos mostram reforçada tumorigénese [23], [25], [26]. HCC Paradoxalmente, perda condicional de β-catenina em hepatócitos em ratinhos C57BL /6 levou a uma susceptibilidade inesperadamente superior para DEN-induzida [27]. Outro grupo também mostrou recentemente demonstraram aumento tumorigênese em camundongos KO em resposta a DEN /PB,

embora

em ratinhos C3H /N [28]. No estudo actual, que fornecem evidências de que β-catenina KO em ratos C57BL /6 sujeitos a fundo DEN-indução tumoral mediada pelo P14 seguido de promoção do tumor 2 semanas mais tarde por PB também levou a uma maior carga tumoral dramaticamente.

DEN ou DEN /HCC induzida PB em qualquer estirpe de ratinhos não é tipicamente associada com qualquer fibrose hepática. No entanto, no β-catenina ratinhos nulos DEN exposição /PB condicional levou ao desenvolvimento de HCC, que foi associada com fibrose hepática e está de acordo com estudos recentes por outros nós e [27], [28]. Nós também vimos um aumento na morte celular e consequente aumento na proliferação celular. Na verdade nós identificamos uma maior ativação de células estreladas, um aumento modesto no PDGFRβ e consequente fibrose hepática. Estes dados indicam que a perda de β-catenina faz fígados mais propenso à lesão genotóxico e, eventualmente, tumorigénese imitando o cenário predominante de HCC humana em que os tumores frequentemente ocorre no fundo cirrótico [29]. Papel de β-catenina na regulação do estado redox tem sido implicado em diversos estudos recentes, em que as suas interacções com HIF1α, FOXO3 e outros podem ser crítico [30], [31]. Assim, será importante para compreender a base de tais papéis dos supressores de tumor “de β-catenina em HCC que podem, eventualmente, necessitam de cuidadosa seleção de pacientes a serem tratados com terapias anti-β-catenina [32].

para determinar a base molecular de HCC na ausência de β-catenina, estávamos interessados ​​em vias de sinalização que são bem conhecidas no desenvolvimento e exacerbação de HCC. C-met e fosforilação IGFR foi aumentada em WT, mas não em ratinhos KO enquanto que a activação do EGFR foi apenas ligeiramente elevados em WT. Assim, enquanto estes RTK podem jogar um papel importante na tumorigênese no WT expostos a DEN /PB, a sua participação na KO é improvável. Com base em nossas descobertas anteriores na tumorigênese induzida por DEN em KO [27] e estudos independentes mostram um papel importante de PDGFR sinalização em HCC [12], [13], [14], nós investigamos a sua expressão e activação DEN estudos /PB . níveis PDGFRα foram significativamente upregulated em KO após DEN /PB-exposição. Além disso, PDGF-CC um ligando selectivo de PDGFRα, cuja sobre-expressão em ratinhos transgénicos específico do fígado foi mostrado para induzir a cirrose e carcinoma hepatocelular [33], foi também aumentado em Ko. Na verdade, PDGF-CC foi localizada em hepatócitos KO expostos a DEN /PB (dados não mostrados), sugerindo um loop autócrino de sinalização. Os resultados obtidos a partir do ensaio de incorporação de timidina nas células Hep3B, corrobora

in vivo

descobertas. Enquanto diminuição da proliferação celular foi observada em células de hepatoma após β-catenina knockdown [34], PDGF-CC promovido a sua mitogénese mais robustamente somente após a supressão β-catenina que leva à sobre-regulação PDGFRα [27]. Isso também verifica PDGFRα sinalização como um meio de escapar da β-catenina inibição terapêutica.

PDGFRα superexpressão na presença de aumento PDGF-CC levou ao aumento Tyr720-PDGFRα em portadores de tumor KO mas não fígados WT após DEN /PB. A fosforilação em tirosina 720 é conhecida para activar SHP2 fosfatase, que por sua vez desfosforila Src, que conduz à sua activação [35]. activação de Src tem sido mostrado induzir c-Myc, uma importante proto-oncogene [36], que foi concomitantemente elevados em KO. Outros sites de tirosina em PDGFRα apresentaram alterações discretas na fosforilação entre o KO e WT e, portanto, pode ser de menor relevância no modelo de tumorigênese atual.

Apenas cerca de 3% de todos os tumores no 9 KO aos 8 meses após a DEN /PB regime eram tumores de β-catenina positiva que pode ser devido a ‘furado’ cre-recombinase. tumores p-catenina-negativos também foram negativas para GS e principalmente negativo para a ciclina D1. Nós não ter seguido todos os animais neste estudo além de 8 meses. Outros têm relatado recentemente extensa repovoamento espontânea em fígados KO

embora Restaurant at 18-20 meses de idade [37]. Um grupo relatou um repovoamento mais robusto espontânea e adenomatose hepática em Ko, o que não tem sido relatada por qualquer outro grupo de trabalho com os ratinhos knockout condicionais β-catenina [38]. O único exemplo de uma extensa repovoamento nos ratinhos KO na nossa experiência foi observada após a administração contínua de dieta contendo 0,1% de 3,5-dietoxicarbonil-1,4-dihydrocollidine (DDC) durante 5 meses [39]. Na verdade KO foram estudados após a hepatectomia parcial, dieta deficiente de metionina-colina, dieta álcool ou DEN e exibiram falta de repovoamento hepática com hepatócitos-β-catenina positiva [27], [31], [40], [41] .

Materiais e Métodos

os estudos em animais

Todos os experimentos com animais foram realizados sob as orientações dos Institutos Nacionais de Saúde e de uso e cuidado Comitê Institucional animal da Universidade de Pittsburgh. Os estudos realizados no relatório atual foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidados Institucional Animal da Universidade de Pittsburgh. Os ratos com eliminação condicional de β-catenina em hepatócitos com genótipo CTNNB1

loxP /loxP; Alb-Cre

+/- são referidos como knockout camundongos (KO) e foram descritos anteriormente [41]. Ninhada com qualquer um dos seguintes genotypes- CTNNB1

loxP /loxP; Alb-Cre

– /-, CTNNB1

loxP /WT; Alb-Cre

+/-, CTNNB1

loxP /WT; Alb-Cre

– /- são referidas como do tipo selvagem ou WT. Estes ratinhos são em murganhos C57BL /6 do fundo.

KO Homem (n = 9) e WT (n = 15) os ratinhos foram injectados intraperitonealmente com DEN (Sigma-Aldrich, Inc.) a uma dose de 5 ug /grama de peso corporal ao dia pós-natal 14 e a partir do dia 28 em diante, a água potável disponível

ad libitum

continha fenobarbital (PB) (0,05% w /v). Água contendo PB fresco foi preparado por semana durante a duração dos estudos. Os ratos foram sacrificados aos 8 meses e fígado coletadas para análise histológica e proteína

Análise Western blot:.

Total de lisados ​​de tecido preparadas de ensaio radio imuno-precipitação tampão (RIPA) contendo 1% Igepal CA -630, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS em 1 × PBS, juntamente com a protease inibidor de fosfato (1:100) (Thermo Scientific). As proteínas foram resolvidas por electroforese de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida de 4-15% de gel e, em seguida, transferidos para membranas Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA) em tampão de transferência contendo 10% de metanol. As membranas foram sondadas com anticorpos primários (ver abaixo) em solução salina tamponada com Tris com Tween-20 contendo 5% de leite desnatado ou de BSA. Os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano foram utilizados a 1:50,000 diluição e o sinal avaliado com Super Signal West Pico quimioluminescência do substrato (Pierce, Rockford, IL) e autorradiografia. Os filmes (Molecular Tecnologia Vendas, St. Louise, MI) foram digitalizadas para obter densitomery óptica integrada (IOD), utilizando software NIH Imager. O IOD média para uma proteína foi comparada entre os grupos KO e WT e avaliadas para significância estatística pelo estudante

t

de teste e p .. 0,05 foi considerado significativo

Anticorpos

Os anticorpos primários utilizados para Western blot foram: c-Met (1:500), fosfo-Met Tyr1234 /1235 (1:1000), EGFR (1:1000), fosfo-PDGFRα Tyr849 (1:1000), fosfo-IGFR (1:1000) tudo a partir de Cell Signaling Technology; β-catenina (1:1000) da BD Biosciences; PDGFRα (1:180), PDGFRβ (1:500), fosfo-EGFR (1:500), fosfo-PDGFRα Tyr720 (1:200), c-myc (1:200), PDGFA (1:200), PDGFB (1:200), PDGFC (1:200), fosfo-PDGFRα Tyr754 (1:200), Glutamina Synthethase (1:200), e GAPDH (1:1000) todos os produtos da Santa Cruz Biotechnology; fosfo-PDGFRα Tyr572 /574 (1:800, Invitrogen); A ciclina D1 (1:200, Neomarkers); alfa actina de músculo liso (1:300, Abcam); e β-actina (1:2000, Millipore).

Histologia e imunohistoquímica

secções de quatro micron de tecidos hepáticos embebidos em parafina foram usados ​​para histologia e coloração imuno-histoquímica. Hematoxilina e Eosina (H E) de coloração foi empregada para identificar focos tumorais. Normalmente quatro lobos representativos de cada rato foram incluídos em cada slide. focos de tumor foram identificados com base em atributos característicos como citoplasma basofílico e figuras de mitose. Para efeito de comparação, o número total de nódulos microscópicas foram contadas e números médios comparados para significância estatística pelo estudante

t

teste com p . 0,05 considerado significativo

Para imuno-histoquímica, recuperação antigênica foi alcançada tanto por vapor cozinhar ou a ferver as lâminas em microondas em tampão citrato, durante 20 minutos ou 10 minutos, respectivamente. As secções foram inactivados por peróxido endógeno, bloqueados e incubados com o anticorpo primário durante a noite à temperatura ambiente ou durante uma hora à temperatura ambiente, lavadas e incubadas com anticorpo secundário conjugado com biotina apropriado durante 30 minutos. As secções foram lavadas, incubadas com o reagente ABC, lavadas e incubadas com DAB. Os cortes foram próxima contrastadas com solução de Shandon hematoxilina (Sigma) ea tampa escorregou usando XYL Cytoseal (Richard Allen Scientific, Kalamazoo, MI). Para controlo negativo, o anticorpo primário foi omitido no protocolo. As lâminas foram vistos sob uma Axioskop 40 (Zeiss) microscópio de pesquisa vertical e imagens digitais obtidas. Colagens foram preparadas usando o software Adobe Photoshop CS4. Para PCNA e TUNEL, o número de células positivas foram contadas em quatro campos aleatórios 400 × em cinco fígados representativos de cada grupo e as médias comparadas para a significância entre grupos pelo estudante

t

teste. valor de P inferior a 0,05 foi considerado significativo. Para a análise quantitativa de β-catenin- e PDGFRα-positividade nos tumores, todos os focos microscópicos em KO e WT fígados foram avaliados. Qualquer focos tumorais mostrando coloração β-catenina citoplasmática e /ou nuclear foram marcadas como sendo-β-catenina positivos e dos seus focos exibindo coloração citoplasmática para PDGFRα, em comparação com as áreas circundantes não tumorais foram marcadas como sendo PDGFRα-positivos. Isso nos permitiu calcular percentual de β-catenina e /ou tumores PDGFRα-positivos em cada grupo após o tratamento DEN /PB.

cultura de células e tratamento

Hep3B células (ATCC) foram cultivadas para 100% de confluência em 10% de FBS e meios EMEM. As células foram tripsinizadas e plaqueadas em placas de 6 cavidades contendo 2 mL de 10% de meio de FBS EMEM e privadas de soro durante a noite. A transfecção foi realizada através de pré-validado β-catenina e ARNsi de controlo (Ambion) utilizando lipofectamina como descrito anteriormente [34]. 24 horas após a transfecção, as células foram tratadas com 10 ng /ml de PDGF-CC recombinante (R D systems) ou HCl (utilizado para reconstituir o PDGF-CC) em meios contendo 4% de timidina tritiada. Após 24 horas, o meio foi descartado e 1 ml de ácido tricloroacético a 5% (TCA) foi adicionado a cada poço e as placas colocadas em 4 ° C durante 15 minutos.