Abstract

histonas modificações específicas do local são importantes reguladores epigenéticos da expressão do gene. Como a desregulamentação dos genes muitas vezes resulta em doenças complexas, a modulação corretiva de marcas histonas específicas do local poderia ser uma estratégia terapêutica ou doença preventiva poderosa. No entanto, essa modulação por compostos alimentares e o impacto resultante sobre o risco de doença permanecem relativamente inexplorados. Aqui nós examinamos phenethylisothiocyanate (PEITC), um composto dietético comum derivado de vegetais crucíferos com propriedades quimioprotector conhecido sob condições experimentais, como um possível modulador de modificações de histonas em células cancerígenas do cólon humano. O presente estudo relata novela, dinâmicos, site-specific mudanças químicas a histona H3 de uma forma gene específico do promotor, associados à exposição PEITC em células epiteliais SW480 derivadas de tumores de cólon humano. Além disso, PEITC atenuada proliferação celular de um modo dependente da concentração e do tempo, provavelmente mediada por sinalização apoptótica dependente da caspase. Os efeitos de PEITC sobre histonas modificações e alterações de expressão de genes foram obtidas a baixas concentrações, não citotóxicas, em contraste com as concentrações mais elevadas necessárias para deter a proliferação de células de cancro. Maior compreensão das alterações epigenéticas específicas por componentes da dieta possam oferecer uma melhor estratégias quimiopreventivos para reduzir a carga de cuidados de saúde de câncer e outras doenças humanas

Citation:. Liu Y, Chakravarty S, Dey M (2013) Phenethylisothiocyanate Altera Site- e modificações de histonas cauda promotor específico em células cancerosas. PLoS ONE 8 (5): e64535. doi: 10.1371 /journal.pone.0064535

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 17 Setembro, 2012; Aceito: 16 de abril de 2013; Publicado em: 28 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Apoio major para este trabalho veio do National Institutes of Health conceder [R00AT4245] (para MD). suportes adicionais vieram da Estação Experimental de Dakota do Sul Agricultura concede 328100/318000 (para MD) e 3AH386 (para SC), Controle Biológico e análise por Photonics Aplicadas: a Dakota do Sul 2010 3SG163 centro de subvenção (para SC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cancro continua a ser a segunda principal causa de todas as mortes nos Estados Unidos [1]. Felizmente, muitos componentes da dieta podem potencialmente modular vários alvos moleculares, levando a prevenção da iniciação do câncer, promoção e progressão. Em particular, frutas e vegetais são ricas fontes de compostos biologicamente ativos que muitas vezes têm baixa toxicidade, mas eficácias significativas [2]. No passado, o câncer foi estritamente concebida como uma doença de mutações, mas uma pesquisa mais nova também associa o estado de doença com a perturbação das redes regulatórias celulares, bem como a perturbação da função dos genes e regulação de genes são agora ambos reconhecidos como marcas do câncer [3] , [4], [5]. Assim, medidas de doença preventiva com o objetivo de direcionar elementos-chave das redes que regulam a função do gene, tais como cromatina, pode ser eficaz. As alterações de modificações da cromatina específicas do local, conhecidos como mudanças epigenéticas, são relevantes para a oncologia clínica, uma vez que estão intimamente associados com a expressão gênica e perturbações de rede no estado de doença [6], [7]. Portanto, elucidar o papel dos compostos alimentares em repor as paisagens epigenéticas aberrantes responsáveis ​​pela expressão do gene alterado pode facilitar práticas médicas preventivas.

A base epigenética de regulação do gene se manifesta na unidade estrutural da cromatina, o nucleosome, que é uma montagem de octâmeros histona embrulhadas por ADN genómico. Modificações das histonas constituem um ponto de controle molecular importante na regulação da expressão do gene, e essas modificações são freqüentemente alterados em cancros [6], [7]. Entre muitas modificações cauda de aminoácidos das histonas conhecida, a metilação e a acetilação de resíduos de lisina na histona H3 têm sido extensivamente estudadas no que diz respeito ao silenciamento do gene e regulação do gene. Dimetilação de H3 na lisina 9 (H3K9me2) e trimethylation de H3 na lisina 27 (H3K27me3) são frequentemente associadas com transcricional repressão e gene silenciamento [8]. metila�es histona lisina específicas do local são catalisadas por transferases de histona de metilo (HMTs), e a remoção de grupos metilo são catalisadas por desmetilases. Da mesma forma, a desacetilação das histonas em promotores de genes catalisadas por histona desacetilases (HDACs) está correlacionada com a condensação de domínios de regiões cromossómicas de incompetência transcricional e a sub-regulação dos genes associados marcação [9]. Embora os estudos in vitro sobre o papel de fitoquímicos dietéticos na modulação dos níveis de HMTs e as HDACs existem em números pequenos [10], a modulação de modificações H3 lisina posições específicas de compostos da dieta de um modo específico para o gene permanece relativamente inexplorado [11] . Aqui, nós investigamos H3-acetilação (H3-Ac) e methylations H3 lisina site-specific (H3K27me3 e H3K9me2) em associação com phenethylisothiocyanate (PEITC) modulação da expressão do gene mediada em células cancerígenas do cólon humano. Este é um seguimento dos nossos anteriores relatórios sobre PEITC como um composto alimentar com potenciais funções anti-inflamatórios em diferentes modelos experimentais [12], [13].

PEITC ocorre naturalmente sob a forma do seu precursor de glucosinolatos, gluconasturtiin, em vegetais como repolho, couve-flor, wintercress, e brócolis. PEITC mostrou potencial antioxidante e atividade quimiopreventiva em modelos experimentais de vários tipos de câncer [14], [15]. Ele não exibiu qualquer toxicidade aparente em estudos de segurança de medicamentos [16] e está actualmente em ensaios clínicos para tratamentos de câncer de pulmão (clinicaltrials.gov: NCT00005883, NCT00691132). No rato, foi demonstrado anteriormente que PEITC atenua a inflamação do cólon e modula um número de biomarcadores potenciais relacionadas com a inflamação e a carcinogénese do cólon. Estes biomarcadores incluídos genes relacionados com a resposta inflamatória, a apoptose, regulação do ciclo celular, proliferação de citocinas /quimiocinas atividade e regulação da transcrição [12], [13].

O câncer colorretal é a segunda principal causa de câncer mortes relacionados com nos Estados Unidos [21]. Curiosamente, uma associação mecânica entre a inflamação crónica e um aumento do risco de cancro decorrente da instabilidade genética e epigenética induzida por inflamação é agora bem aceite [17]. os principais atores dessa associação incluem fatores de transcrição, como o fator nuclear kappa B (NFkB) e transdutores de sinal e activadores de transcrição (Stats), citocinas /quimiocinas e metaloproteinases de matriz (MMP), uma família multigênica de matriz-extracelular dependente de zinco remodelação endopeptidases. Estes mediadores celulares, alguns dos quais nós estudados anteriormente em modelos de rato [12], [13], têm funções importantes relacionadas com o bypass da imunidade adaptativa, a proliferação, a sobrevivência das células malignas, o crescimento do tumor, angiogénese, invasão e metástase [17 ], [18], [19], [20]. O presente estudo investigou alterações na cromatina em associação com modulação PEITC mediada da expressão desses mediadores em células cancerígenas do cólon humano.

Materiais e Métodos

Drug and Chemicals

Dimetil sulfóxido (DMSO), lipopolissacárido (LPS, a partir de

Escherichia coli

estirpe O55: B5), penicilina /estreptomicina, e phenethylisothiocyanate (PEITC) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Meio de Dulbecco Modificado de Eagle (DMEM), soro fetal de bovino (FBS), e TrypLE foram adquiridos de Gibco (Grand Island, NY). Human interferon-γ (IFN-y) foi adquirido a R D Systems (Minneapolis, MN). solução salina tamponada com fosfato (PBS) foi adquirido a partir de Thermo Scientific (Rockford, IL). Para transferência western, um anticorpo contra β-actina foi adquirido de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), e anticorpos contra STAT1 e STAT1 fosforilada (Ser727) foram adquiridos a Millipore (Billerica, MA). anticorpo secundário 800 anti-coelho DyLight foi comprado de Li-Cor Biosciences (Lincoln, NE). Os anticorpos utilizados para o ensaio de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) eram anti-acetil-Histona H3, IgG anti-trimetil-Histona H3 (Lys27), e de coelho para as amostras de controlo negativo a partir de Upstate Biotechnology (Billerica, MA) e anti-dimetil-Histona H3 (Lys9) de Abcam (Cambridge, MA). As enzimas utilizadas para o ensaio de nuclease microcócica foram ChIP (MNase) a partir de Cell Signaling (Beverly, MA) e proteinase K a partir de Thermo Scientific Pierce (Rockford, IL). Os oligonucleótidos foram sintetizados por IDT ADN Inc. (Coralville, IA). A aprotinina produtos químicos de ensaio Chip, DL-1, 4-ditiotreitol (DTT), e Nonidet-P40 (NP-40) foram adquiridos a Thermo Scientific (Rockford, IL), enquanto que o butirato de sódio, proteína-A Sepharose, e sacarose foram adquiridos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). tampão de incubação chip foi comprado de Abcam (Cambridge, MA), e uma pasta de ADN de purificação para a purificação de ADN-ChIP grau foi comprado de Diagenode (Denville, NJ).

Cultura celular

SW480 (ATCC CCL-228), HT-29 (ATCC HTB-38), e THP-1 (ATCC TIB-202), linhas de células obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA) foram cultivadas em DMEM suplementado com FBS a 10%, 1% de penicilina (25 U /mL) /estreptomicina (25 ug /ml) em um ar /5% de CO atmosfera de 95%

2-humidificado a 37 ° C. Três linhas de células foram cultivadas como descrito [24]. Resumidamente, as células THP-1 foram tratadas com PEITC a uma dose pré-determinada durante 8 h antes de eliciação com LPS (1 ug /ml). SW480 e células HT-29 foram preparados com IFN-y (10 ng /ml) durante 12 h, tratada com PEITC durante 5 h, e em seguida estimuladas com LPS (10 ou 50 ng /ml) durante 4 h ou 1, respectivamente. LPS e PEITC foram dissolvidos em DMEM e DMSO, respectivamente, com DMSO utilizado como veículo. Para cada experiência, um controlo positivo (células tratadas com DMSO e LPS /IFN-y) e um controlo negativo (células tratadas com apenas DMSO) foram incluídos. Duas réplicas foram feitas para cada tratamento. PEITC tratamentos foram realizados a 2,5, 5, 10, e 15 uM concentrações. Para analisar as alterações de expressão que dependem do tempo de STAT1 e outros genes de interesse (GOI), em resposta a PEITC, SW480 células foram tratadas com 10? M PEITC durante 5, 8, 12, e 18 h. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes.

Viabilidade Celular Ensaio, Dose Intervalo Determinação, e proliferação celular

A CellTiter 96 Aqueous One Solution kit de Proliferação Celular Assay (MTS, 3 (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio, sal interno; Promega, Madison, WI) foi utilizado para determinar o número relativo de células viáveis ​​SW480 remanescente após tratamento PEITC, de acordo com as instruções do fabricante. O ensaio foi realizado por tratamento SW480 células com diferentes concentrações PEITC, seguido pela adição de reagente CellTiter 20 ul directamente aos poços de cultura, incubação durante 2 h a 37 ° C, e, em seguida, gravar a absorvância a 490 nm com um leitor de placa BioTek Synergy H4 ( BioTek, Winooski, VT). Fundo 490 nm de absorvância foi corrigida por preparação de um conjunto de triplicado poços de controlo (sem células) contendo o mesmo volume de meio de cultura e o reagente CellTiter como nos poços experimentais. O mesmo ensaio foi também realizada utilizando concentrações mais elevadas de PEITC (até 80 uM) e expondo as células por períodos de tempo mais longos de até 48 horas para determinar os efeitos anti-proliferação de células PEITC em SW480 (Figura 1). Deve notar-se que as concentrações ainda mais baixas (acima de 5 uM) de tratamento PEITC por períodos de incubação mais longos, tais como 48 h induzir a morte celular significativa e degradação do ARNm (Figura 1). As concentrações de PEITC em que há perda significativa de viabilidade celular ocorreram (sem efeitos citotóxicos) foram selecionados para todas as novas experiências (Figuras 2, 3, 4, 5, 6). Assim, todos os ensaios de expressão de genes (RNA e expressão de proteína) e variação epigenética relatados neste manuscrito foram determinadas no ponto de tempo de 5 h, a menos que mencionado de outro modo. Uma exposição de 40 uM de PEITC durante 12 h ou menos não mostraram uma perda significativa da viabilidade celular (Figura 1A). Para observações dependente do tempo (Figura 5 e S1, S2, S3, S4, S5), células com 10 uM tratamento PEITC foram incubadas durante até 18 h, como uma perda estatisticamente significativa na viabilidade celular não foi observado até que ponto de tempo ( Figura 1A).

sequência 12, 24, e 48 h de exposição PEITC e uma subsequente 2 h de incubação com o reagente CellTiter aquosa (Promega), a

490 nm foi medida em células SW480 num BioTek Synergy H4 leitor. Percentagem de viabilidade celular é mostrado em relação ao controlo (sem PEITC) como a média ± SEM (A); efeitos dependentes da concentração de PEITC às 48 h sobre a fragmentação do ADN (B); modulação dependente da concentração, da expressão de genes relacionados com a apoptose e o ciclo celular por PEITC às 48 h. GAPDH foi usada como um controle de arrumação para a quantificação relativa de modificações de expressão de genes (C); para todas as experiências N = 3. * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. Nenhuma perda de viabilidade celular no grupo PEITC 10 uM em comparação com o grupo sem PEITC foi observado até 12 h.

seis genes para os quais são mostrados PEITC associada alterações na modificações H3 também foram observadas . Gois para os quais não foram observadas alterações H3 PEITC-associados-exposição, são mostrados na Tabela 3, mas não na figura corrente. Os efeitos dos tratamentos PEITC foram medidas pela quantidade de ARNm relativa expressa pelos GI nas células tratadas. A quantidade de ARNm foi determinada utilizando em tempo real de RT-PCR, com GAPDH como um controlo interno. Os valores baixos representam maiores efeitos inibitórios. Os valores são média ± SEM (n = 6). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. Quando todos os valores abaixo da linha pontilhada corresponde à mesma categoria de

valor p

, estrelas individuais são omitidos para evitar a superlotação da figura. significância estatística foram medidos em relação ao controlo positivo, que são células tratadas com LPS e não PEITC, mostrando os mais elevados níveis de indução do gene.

Histona H3 metilação alterações nas regiões promotoras de genes de interesse (GI ) em células SW480. Cromatina a partir de células SW480 foi colhido após 5 h de tratamento de 10 mM PEITC. Os resultados das análises usando ChIP (A) anti-trimetil-Histona H3 Lys27 (H3K27me3) e (B) anti-dimetil-Histona H3 Lys9 (H3K9me2) anticorpos são mostrados. Dentre 13 Gois testados em células SW480, seis genes mostrou alterações PEITC-associados estatisticamente significativas nos estados H3K27me3 e um gene mostraram mudanças PEITC-associados estatisticamente significativas no estado H3K9me2. As sequências de ADN foram quantificados por PCR em tempo real utilizando iniciadores de promotor. Média ± SEM percentagem de entrada (n = 3) a partir de cada experiência é traçada. * P 0,05, ** p 0,01, *** p . 0,001 em comparação com células de controlo positivo

alterações acetilação de histonas H3 na região promotora de genes de interesse (GOI) em SW480 células. A cromatina de células SW480 foi colhida após 5 h de tratamento 10 uM PEITC. Dentre 13 Gois testados em células SW480, dois genes mostraram mudanças PEITC-associados estatisticamente significativas do estatuto H3-Ac. Os resultados das análises de ChIP utilizando um anticorpo anti-acetil Histona H3-são mostrados. As sequências de ADN foram quantificados por PCR em tempo real utilizando iniciadores de promotor. Média ± SEM percentagem de entrada (n = 3) a partir de cada experiência é traçada. * P 0,05, *** p . 0,001 em comparação com células de controlo positivo

Os resultados representativos que mostram os efeitos dependentes do tempo de tratamento de 10 uM PEITC sobre níveis de ARNm de STAT1 e sobre o estado de metilação H3K27me3 . células SW480 foram tratadas com 10? M PEITC nos pontos de tempo indicados (A, B). Os níveis de ARNm de STAT1 foram normalizados para níveis de GAPDH e expressas como uma percentagem em relação ao controlo positivo em células-(A). Histona H3 metilação alterações na região promotora de STAT1 em células SW480 foram determinados utilizando um anticorpo anti-H3K27me3 para o chip. As sequências de ADN foram quantificados por PCR em tempo real (B). Os pontos de dados representam a média ± SEM (n = 4) a partir de cada experiência. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 em comparação com células de controlo positivo. As linhas pontilhadas verdes indicam uma possível correlação inversa (para marcas repressivas) entre as mudanças nos níveis de mRNA e status de modificação H3 nas células. A presença ou ausência de correlações semelhantes para as restantes cinco GI são mostrados nas Figuras S1, S2, S3, S4, S5.

análises de imunotransferência que mostra a supressão de STAT1 celular total, bem como pSTAT1 nuclear activado em resposta aos tratamentos PEITC em células SW480 de uma forma dependente da concentração. (A) Immunoblot. (B) análise densitométrica de imunotransferência. As células foram pré-tratadas com várias concentrações de PEITC durante 5 h antes da activação por LPS 4 h. células não estimuladas e estimuladas células serviram como controlos negativos e positivos. intensidades de bandas foram normalizados para a p-actina. Os valores são expressos como médias ± SEM (n = 3) de três experiências separadas. * P 0,05, ** p . 0,01

ADN A fragmentação Ensaio para a Detecção de apoptose

SW480 células tratadas com diferentes concentrações de PEITC foram incubados durante 48 h antes da colheita do DNA genómico usando DNAzol (Invitrogen, Grand Island, NY), seguindo o protocolo do fabricante. fragmentação do DNA foi visualizada utilizando electroforese em gel de 1,5% de agarose e coloração GelRed (Biotium, Hayward, CA).

ARN total extração, purificação, e de cDNA síntese |

O ARN total foi extraído a partir de células utilizando TRIzol reagente (Invitrogen, Grand Island, NY), seguindo as instruções do fabricante. O ARN foi quantificado por meio de medições de absorção a 260 e 280 nm utilizando o sistema de espectrofotômetro NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). O ARN foi, em seguida, tratou-se com ADNase I (Invitrogen Inc.), seguindo as orientações do fabricante para remover quaisquer vestígios de contaminação de ADN. Os cDNAs foram sintetizados utilizando-se 3 ug de ARN para cada amostra utilizando o High-Capacity cDNA de transcrição reversa Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), seguindo o protocolo do fabricante. extracção de ARN, a purificação, e a síntese de ADNc foram realizadas como anteriormente descrito [13].

Real-Time PCR quantitativa

Os cADNs foram sintetizados diluída quatro vezes. Dois microlitros de cada amostra diluída foram adicionados a 0,5 ul de iniciadores específicos do gene e 12,5 ul de alimentação SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosciences, Foster City, CA) e o volume final para 25 uL trazido por adição de água destilada estéril. As amplificações de PCR foram realizadas num sistema Mx3005P (Roche /Stratagene) usando um ciclo a 50 ° C durante 2 min, um ciclo de 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de 15 s a 95 ° C e 1 min a 60 ° C e um último ciclo de 95 ° C durante 1 min, 55 ° C durante 30 s, e 95 ° C durante 30 s, como descrito [13]. NTC (sem controle de modelo), controle não-RT, e PEITC-somente controles foram utilizadas como adequado para fins de controle de qualidade. Todas as amostras foram testadas em duplicado. iniciadores, abrangendo-intrão específicas do gene utilizado no presente estudo estão descritos na Tabela 1 (para expressão do mRNA PEITC dependente da concentração) e Tabela 2 (para experiências chip). Cálculos de níveis de expressão relativos foram realizadas utilizando o ΔΔC

t-método de [25]. Os valores de dados são médias de pelo menos três experiências independentes e estão expressos como a quantidade de ARNm relativo em relação a um controlo positivo, que é normalizado para um valor de 1,0.

Western Blot Análise

para as análises de imunotransf erência, IFN-y-primed, PEITC-tratada SW480 células foram activadas com LPS durante 4 horas e colhidas utilizando tampão de lise RIPA (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Na 1 mM de

2EDTA, EGTA 1 mM, 1% de NP-40, 1% desoxicolato de sódio, pirofosfato de sódio a 2,5 mM, glicerofosfato β-1, 1 mM de Na

3VO

4, 1 ug /mL de leupeptina). Para a preparação de extracto nuclear e determinação da concentração de proteína, do fabricante (Thermo Scientific, Rockford, IL) para protocolos NE-PER nucleares de extracção Reagentes e o kit de ensaio de proteína BCA Pierce foram seguidos. As proteínas (50 ^ g /pista) foram separados por 12% SDS-PAGE e os produtos foram electro-transferidas para polyvinyldene (PVDF) membranas (Thermo Scientific, Rockford, IL). As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% durante 1 h, lavou-se três vezes em PBS, incubadas com anticorpo primário (de coelho anti-β-actina a partir de Santa Cruz Biotechnology e de coelho anti-STAT1 e anti-fosforilado STAT1 [Ser727] de Millipore) durante a noite, lavou-se três vezes em Tween-20 (0,1% em PBS), e incubadas com 800 DyLight anticorpo secundário anti-coelho de LI-COR, durante 1 h, todas à temperatura ambiente. Depois de enxaguar em Tween-20 (0,1% em PBS), borrões foram fotografadas com um sistema de imageamento infravermelho Odyssey (Li-Cor).

Quantitative imunoprecipitação da cromatina (ChIP) Análise

As células foram colocadas a uma densidade de ~3-5 × 10

6 por poço em placas de 6 poços 18-24 h antes do tratamento, em seguida, lavadas duas vezes com PBS frio e colhido após o tratamento [26]. O ensaio de chip foi realizada utilizando uma versão modificada de um método previamente publicado [27]. As células foram suspensas em tampão gelado 1 (0,06 M de KCl, 15 mM de NaCl, 5 mM MgCl

2, 15 mM de Tris-HCl a pH 7,4-7,6, 0,1 mM de EGTA, 0,3 M de sacarose, 180 mg de aprotinina, 5 mM butirato de sódio, PMSF 0,1 mM, DTT 0,5 mM) e a solução tampão 2 (0,8% de NP40 + Tampão 1) durante 10 min em gelo. As suspensões de células foram adicionados a novos tubos contendo tampão 3 (0,06 M de KCl, 15 mM de NaCl, 5 mM MgCl

2, 15 mM de Tris-HCl a pH 7,4-7,6, 0,1 mM de EGTA, 1,2 M de sacarose, 180 mg de aprotinina, 5 butirato de sódio mM, PMSF 0,1 mM, DTT 0,5 mM). Depois as amostras foram centrifugadas, os núcleos foram recolhidas e re-suspensas em tampão de digestão de MNase (0,32 M de sacarose, Tris-HCl 50 mM pH 7,4-7,6, MgCl 4 mM de

2, CaCl 1 mM de

2, 0,1 PMSF mM, butirato de sódio 5 mM), incubou-se num banho a 37 ° C em banho-maria, durante 6 minutos, e 20 ul de H EGTA 0,5 adicionado para parar a reacção. Desta forma, a cromatina foi digerido até um comprimento médio de ADN de 300-800 pb. Após centrifugação, o sobrenadante continha a primeira fracção solúvel da cromatina, S1. O pelete foi re-suspenso em tampão de diálise (Tris-HCl 1 mM, pH 7,4-7,6, EDTA 0,2 mM, PMSF 0,2 mM, butirato de sódio 5 mM), colocados em gelo durante 1-2 h, e centrifugou-se. O sedimento resultante foi a segunda fracção solúvel cromatina, S2. Alíquotas das duas fracções de cromatina (10-20 ug S1 e S2 10-20 ug) foram misturados, o volume diluído para 1 ml com tampão de incubação ChIP (Abcam), e a mistura submetida a imunoprecipitação com anticorpos específicos, com rotação durante a noite a 4 ° C. cromatinas imunoprecipitadas foram extraídos utilizando proteína A Sepharose e purificou-se usando uma pasta de ADN de purificação (Diagenode, Denville, NJ). Uma alíquota de cada molde de ADN imunoprecipitado (100-150 ng) foi usada para análise de PCR quantitativo em tempo real utilizando iniciadores de gene promotor específicos de sequência (Tabela 2). O sinal de ADN imunoprecipitado amplificado por PCR foi normalizado ao sinal de PCR a partir de ADN de entrada não-imunoprecipitada [28]. Os sinais obtidos por precipitação com IgG de controlo foram subtraídos dos sinais obtidos com os anticorpos específicos. Os cálculos basearam-se na média de pelo menos três experiências independentes, e os resultados são expressos como uma percentagem da entrada (Figuras 3, 4, 5, S1, S2, S3, S4, S5).

Estatística análise

a significância estatística dos grupos de tratamento foi avaliada por ANOVA de uma via seguido por teste post-hoc de Dunnett para comparação de grupos de tratamento individuais com o controlo. Os dados estão expressos como médias ± SEM. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes. A probabilidade (

p

) valor de 0,05 ou menos foi considerado o critério para uma diferença significativa.

Resultados

Efeito da PEITC na expressão do gene em células humanas

para reexaminar os resultados de expressão gênica em resposta a tratamentos PEITC obtidos em nosso estudo prévio de macrófagos de camundongos [12], foram realizadas otimizações de ensaio usando três linhas de células humanas: a linha celular monocítica humana THP-1 eo humanos linhas de células epiteliais do cólon HT-29 e SW480. Otimização incluídos parâmetros de indução da resposta inflamatória em células tratadas com LPS ou LPS + IFN-y e da gama de concentrações PEITC não citotóxicas e durações de exposição. Informação não existia na literatura sobre os efeitos PEITC em SW480 e células THP-1. No estudo anterior [12], 21 genes induzidos por LPS foram suprimidos três vezes ou mais, em 10 mM PEO (PEITC óleo essencial) em comparação com a ativação LPS sozinho em células RAW 264.7 de macrófagos do rato. (PEO é PEITC obtido a partir de

Barbarea verna

sementes [15] Ambos os PEO e adquirida comercialmente PEITC são compostos de .. 95% puro PEITC No estudo atual com THP-1, HT-29, e SW480 células, que incluiu dois genes adicionais, MMP7 e MMP9, para um total de 23 genes finais de interesse (GOI). PEITC suprimidos 9, células 3, e 13 dos 23 genes em células THP-1, HT-29, e SW480 , respectivamente (Tabela 3). os resultados também mostraram que as células SW480 foram os mais sensível à indução por LPS de IFN-y-primed entre as três linhas celulares testadas. os 13 genes regulada negativamente por tratamento PEITC em células SW480 representam jogadores celulares chave na inflamação e o cancro. por conseguinte, todas as experiências de expressão de genes subsequentes foram realizados usando estes 13 genes em células SW480. os 10 genes que foram rastreados mas não foram induzidas /expressa nas linhas de células humanas não são discutidas mais adiante neste manuscrito. após a análise da expressão do gene , alterações em modificações de histonas (H3K27me3, H3K9me2, e H3-AC) nas regiões promotoras de cada uma destas 13 genes foram investigados. Observamos H3-modificações diferenciais em relação aos controles para apenas seis desses 13 genes, que são discutidas em detalhe no manuscrito. Todos os 13 genes, com ou sem modificações H3 foram observadas em suas regiões promotoras em associação com a exposição PEITC, estão listados na Tabela 3.

Efeito da PEITC no cancro do cólon (SW480) Proliferação Celular

Vários dos genes seleccionados observados para ser modulada por PEITC em células SW480 regulação da proliferação celular durante a carcinogénese (Tabela 3). Por isso, nós investigamos se PEITC tinha um efeito antagonista sobre a proliferação de células de tumor, encontrando que PEITC atenuada viabilidade em células SW480 de uma maneira tempo e dependente da concentração (Figura 1A). Curiosamente, as concentrações PEITC e tempos de exposição necessárias para deter a multiplicação de células cancerosas são mais elevados e mais, respectivamente, do que as necessárias para induzir mudanças na química da cromatina (Figuras 3, 4, 5, S1, S2, S3, S4, S5) e gene expressão (Figuras 2, 6, S1, S2, S3, S4, S5). Para concentrações inferiores a 80 uM, pelo menos, uma exposição de 24 h, foi necessário para induzir significativamente a morte de células de cancro (Figura 1). Para a maioria das experiências restantes (Figuras 2, 3, 4, e 6), utilizou-se uma exposição PEITC de 5 h a ou abaixo de 15 uM. Nas Figuras 5 e S1, S2, S3, S4, S5, 10 uM PEITC foi utilizada em vários pontos de tempo em células SW480 por até 18 horas de tempo de exposição PEITC. Uma concentração de 10 ^ M de PEITC viabilidade celular significativamente afectada pelo ou para além de 24 horas (Figura 1A), e um ensaio de fragmentação de DNA (Figura 1B) revelou que os efeitos antiproliferativos de PEITC pode ser devido a apoptóticas sobre-regulação que também é comprovado pelo maior expressão de caspase 3 e 8 (Figura 1C). A ausência de alterações significativas na proteína do ciclo celular CyclinD1 (CCND1) indica que PEITC não inibe directamente o ciclo celular (Figura 1C).

Modulação de quimiocinas por PEITC em células do cólon humano

as quimiocinas desempenham um papel importante na manutenção de processos inflamatórios no intestino grosso. A produção de quimiocinas no intestino estabelece um gradiente quimiotáctica capaz de aumentar a migração de monócitos /macrófagos, granulócitos e linfócitos do sangue através do endotélio em tanto na mucosa e submucosa durante doenças crónicas inflamatórias do intestino (IBD) [29]. Anteriormente, observamos que PEITC reduziu a inflamação, a depleção de células caliciformes, e infiltração de células inflamatórias na mucosa e submucosa do rato [12]. No presente estudo, foi observada a atenuação PEITC mediada dependente da concentração dos níveis de mRNA de quatro quimiocinas pró-inflamatórias /citocinas (CCL2, QCA 2, CXCL10, e IL8) em células SW480 (Tabela 3, Figura 2). experimentos ChIP individuais sobre esses promotores quimiocinas revelou hiper-trimethylation de H3 na lisina 27 (aumento estados H3K27me3) em torno das regiões promotoras dos IL8 e CCL2 e um adicional de diminuição da acetilação em torno das regiões promotoras dos IL8 associados com 10 mM de exposição PEITC (Tabelas 3- 4, As figuras 3A e 4). No entanto, foi observada uma correlação inversa dependente do tempo para H3K27me3 (marca repressiva), mas não H3-Ac com níveis de expressão de mRNA IL8 (Tabela 4, Figura S5). No caso de CCL2, níveis de ARNm e estados H3K27me3 foram observados a variar em conjunto, o que exclui uma possível relação de causalidade (Tabela 4, Figura S4). Embora Polycomb complexo repressor 2 (PRC2) -catalyzing trimethylation H3K27 está envolvido na reprogramação de genes de citocinas em resposta a estímulos inflamatórios [30], [31], a aparente selectividade de PEITC no contexto de modificações de histonas em torno das regiões promotoras das quimiocinas segmentados /citocinas nos leva a crer que PEITC é improvável que afetam diretamente a PRC2.

PEITC exposição perturba fator de transcrição Actividades em células de cólon humano

os NFκBs e estatísticas são duas importantes famílias de factores de transcrição activados em resposta a uma variedade de estímulos que regulam vários processos celulares, incluindo a resposta imune e a carcinogénese. Os NFκBs e estatísticas têm efeitos distintos, bem como sinérgicos sobre a indução gene efetor a jusante [32]. O papel de NFkB na DII [33], bem como o efeito sobre a actividade de NFkB PEITC [34], [35], [36], [37] são bem estudadas. Aqui observamos regulação jusante PEITC mediada por vários membros da família de NFkB, nomeadamente NFκB1, NFκBiα e proteínas REL, que não foi previamente reportados para SW480 células (Tabela 3, Figura 2). Curiosamente, um aumento dependente do tempo no estado H3K27me3 foi associada com uma diminuição dependente do tempo em células em expressão NFκB1 PEITC-expostos, sugerindo o potencial de regulação epigenética NFκB1 que merece futuro validação (Tabela 4, as Figuras 3A, S1).