Abstract

O câncer de próstata (PCA) é a segunda principal causa de morte por câncer em os EUA. Morte de CaP resulta principalmente da metástase. activada por mitogénio proteína quinase quinase 4 (MAP2K4) é sobre-expresso nas lesões CaP invasivos em seres humanos, e pode ser inibida por pequenas moléculas terapêuticas que demonstram actividade favorável nos estudos de fase II. No entanto, o papel de MAP2K4 na regulação do comportamento metastático é controversa e desconhecida. Para investigar, nós engenharia linhas de células CaP humanos que superexpressam tipo selvagem ou MAP2K4 activa constitutiva. implante ortotópico em ratos demonstraram MAP2K4 aumenta a formação de metástases à distância. Constitutiva MAP2K4 activo, embora não tipo selvagem, aumenta o tamanho do tumor e células de tumor que circulam no sangue e medula óssea. Complementar

in vitro

estudos estabelecem superexpressão MAP2K4 estável promove invasão celular, mas não afeta o crescimento celular ou a migração. MAP2K4 superexpressão aumenta a expressão da proteína de choque térmico 27 ​​(HSP27) a produção de proteína e de protease, com o maior efeito sobre a metaloproteinase da matriz 2 (MMP-2),

in vitro e em amostras de tumores de ratinho. Além disso, os aumentos mediados por MAP2K4 na invasão de células são dependentes de proteína de choque térmico 27 ​​(HSP27) e MMP-2, mas não sobre imediato alvos a jusante, p38 MAPK JNK ou de MAP2K4. Nós demonstramos que MAP2K4 aumenta metástase CaP humana, e prolongada sobre a expressão induz alterações a longo prazo na célula vias que levam à independência da MAPK p38 e JNK sinalização. Estes resultados fornecem uma explicação mecanicista para estudos humanos que ligam aumentos de HSP27 e MMP-2 a progressão para doença metastática. MAP2K4 é validado como um importante alvo terapêutico para inibir a metástase CaP humana

Citation:. Pavese JM, Ogden IM, Voll EA, Huang X, Xu L, Jovanovic B, et al. (2014) Mitógeno-Activated Protein Kinase Kinase 4 (MAP2K4) promove o câncer de próstata humano metástase. PLoS ONE 9 (7): e102289. doi: 10.1371 /journal.pone.0102289

editor: Chih-Hsin Tang, China Medical University, Taiwan

Recebido: 01 de maio de 2013; Aceito: 17 de junho de 2014; Publicação: 14 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Pavese et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para RCB, CA122985 e próstata SPORE CA90386, e JMP, NIH T32 AG000260 “Descoberta de drogas Formação em Distúrbios Age-Related”, e pela Walter S. e Lucienne Driskill Graduate programa em Ciências da Vida da Universidade de Northwestern. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é o câncer mais comumente diagnosticado em homens Estados Unidos, e a segunda forma mais comum de morte por câncer [1]. Enquanto mais de 90% dos indivíduos com CaP localizada não vai morrer de sua doença, aqueles com doença metastática tem um diagnóstico terminal ea grande maioria vai morrer de CaP [2]. Compreender como a propagação metastática do CaP humana é regulada é de importância biológica fundamental. Esse conhecimento nos permitirá identificar pacientes em risco e, portanto, na necessidade de intervenção, e irá fornecer a base para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas.

Mitógeno-activado proteína quinase quinase 4 (MAP2K4, também conhecido como MKK4, MEK4, ou SEK1) é uma proteína quinase de dupla especificidade que fosforila resíduos de serina e treonina, bem como resíduos de tirosina. MAP2K4 é um membro da proteína quinase activada por mitogénio (MAPK) e sinalização activa tipicamente dois alvos a jusante, de quinase p38 activada por mitogénio proteína (MAPK p38) e da cinase c-Jun N-terminal (JNK) [3]. O papel de MAP2K4 na progressão do cancro humano CaP, e o desenvolvimento de metástases, em particular, é controversa. MAP2K4 está localizado em 17p11.2 segmento cromossómico, que pode ser perdida a uma velocidade de cerca de 7-10% em cancros epiteliais humanos, particularmente do ovário e da mama [4], [5] Por esta razão, foi inicialmente presumido ser um supressor de tumor. Em um modelo de CaP de rato, utilizando células sem um segmento cromossómico contendo MAP2K4, restauração específica de proteína reduzida MAP2K4 CaP metástases no pulmão após injecção flanco destas células [6]. Nesse modelo, o aumento MAP2K4 crescimento também atrasou de células metastáticas que chegam aos pulmões, provavelmente devido ao G1 do ciclo celular prisão [7].

No entanto, outros estudos indicam que MAP2K4 confere um fenótipo pró-metastático, e apoio a noção de que aumentaria a metástase. MAP2K4 activa p38 MAPK, que acciona diversos passos da cascata metastática, incluindo epitelial para mesenquimal (EMT), invasão celular e colonização metastático (revisto em [8]). MAP2K4 expressão é aumentada em alto grau neoplasia intra-epitelial prostática (lesões HGPIN), tanto no modelo TRAMP à base de murino de CaP espontânea, bem como em amostras humanas, [9]. Além disso, a expressão é aumentada MAP2K4 no início invasivo, isto é, o PCA, lesões nos seres humanos, e aumento da expressão MAP2K4 correlaciona-se significativamente maior com o estádio patológico [9]. Curiosamente, nestes estudos e outros, os níveis de MAP2K4 foram, em seguida, diminuiu na metástase fase tardia, indicando que o aumento MAP2K4 é crítico para os passos iniciais da cascata metastática [10]. Esta influência nas primeiras etapas é confirmado em

in vitro

estudos. Usando várias linhas diferentes de células humanas normais e câncer de próstata e de expressão engenharia transiente de MAP2K4, nosso grupo demonstrou que MAP2K4 aumenta invasão celular, uma indicação crítica de progressão metastática

in vitro

[11]. Foram também identificadas MAP2K4 como um importante alvo terapêutico de inibidores de compostos pequenos. Especificamente, demonstrou-se que MAP2K4 foi o alvo terapêutico da pequena composto, 4 ‘, 5,7-trihydroxyisoflavone (genisteína), para os seus efeitos sobre a inibição da invasão [11], [12], e que a genisteína inibe a metástase CaP humano numa modelo murino ortotópico [13]. Através de uma série de estudos relacionados, identificou-se a caminho, fator transformador de crescimento (TGF) β → MAP2K4 → p38 proteínas MAPK → choque térmico 27 ​​(HSP27) → matriz tipo de metaloproteinase 2 (MMP-2) → invasão de células CaP humana, e que é inibido por genisteína [11] – [16]. Nós também demonstrado que a administração de genisteína potencial para os seres humanos com PCA localizada diminui de MMP-2 de expressão no tecido da próstata [11]. Usando

in vivo

modelos animais, expressão MAP2K4 alterada pode alterar metástases em outros cancros epiteliais humanas. Particularmente, outros grupos têm mostrado MAP2K4 knockdown diminui o crescimento do tumor metastático em modelos de ratos com câncer de mama e de pâncreas [17], [18].

Dada expressão alterada de MAP2K4 e relevância prognóstico em seres humanos, a sua

in vitro

efeitos sobre células da próstata humanas, e respostas variadas em rato e linhas de células de cancro epiteliais humanos, é importante para determinar especificamente o papel de MAP2K4 na regulação do comportamento metastático de CaP humano. Embora MAP2K4 é um alvo terapêutico da genisteína, a genisteína exerce muitos efeitos diferentes. Por conseguinte, apesar da inibição da metástase da genisteína CaP humana, o papel de MAP2K4 na regulação da formação de metástases não pode ser determinada a partir destes resultados. A incerteza de papel de MAP2K4 na regulação da metástase do cancro da próstata humano é ainda mais aumentada por estudos em vários tipos de cancro diferentes, que suportam quer um supressor de metástase [6], [7], [19] – [21], ou papel estimulador [9], [11], [17], [18]. Importante, nenhum examinaram o papel da MAP2K4 na regulação do comportamento metastático do CaP humano.

No presente estudo, demonstramos várias descobertas novas. Em primeiro lugar, MAP2K4 aumento metástase CaP humano. MAP2K4 aumento do crescimento tumoral

in vivo

, mas não

in vitro

. Sob a pressão de expressão crónica, que emula a situação clínica, MAP2K4 levou a uma religação de vias de sinalização celular. Isto resultou num desvio de proteínas de sinalização a jusante imediatas, p38 MAPK e JNK. Foram identificados um único mecanismo de compensação através do qual MAP2K4 levou a uma regulação para cima na expressão de proteína total HSP27. Este, por sua vez resultou em níveis absolutos mais elevados de HSP27 fosforilada, e aumentos na jusante MMP-2. O fenótipo metastático-driven MAP2K4 mostrou ser dependente da HSP27 e o seu efector a jusante, a MMP-2. Estes resultados demonstram que MAP2K4 é um importante motor de metástase CaP humana, e assim validá-lo como um alvo terapêutico para inibir CaP metástase. Eles também fornecem uma explicação mecanicista para estudos clínicos que ligam aumentos na MAP2K4, HSP27 e expressão de MMP-2 para o futuro desenvolvimento de metástases.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os estudos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use na Northwestern University (PHS Assurance # A3283-01). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia isoflurano, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Cultura de Células e Transfecção

células PC3-M e LNCaP foram mantidas em RPMI 1640 suplementado com mM L 2 -glutamina, 10 mM de tampão HEPES, 50units /ml de penicilina, 50 ug /ml de estreptomicina, e 10% de soro fetal de bovino (Life Technologies) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de dióxido de carbono a 5%. 1542CPTX células foram mantidas em meio de queratinócitos SFM suplementado com 2 mM de L-glutamina, tampão HEPES 10 mM, 50units /ml de penicilina, 50 ug /ml de estreptomicina, soro bovino fetal a 10%, 5 ng /ml de EGF humano recombinante, 50 ng /mL pituitária bovina extracto (Life Technologies) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de dióxido de carbono a 5%.

MAP2K4 células transfectadas estáveis ​​foram criadas transfectando PC3-M, células LNCaP, células ou 1542CPTX, cuja origem foi anteriormente descrito [22], com transit-LT1 Transfection Reagent (Mirus Bio LLC) e DNA plasmídeo acordo com as instruções do fabricante. As células foram cultivadas sob condições de selecção com G418, as colónias individuais colhidas e expandidas, como anteriormente descrito por nós [23]. Em experiências indicadas, as linhas celulares clonais individuais resultantes foram adicionalmente transfectadas, como descrito acima, com o plasmídeo de expressão de GFP, seleccionado sob condições de crescimento blasticidina, e, em seguida, purificado utilizando células estéril triagem baseada em estado GFP. As linhas celulares foram autenticadas de acordo com métodos descritos na American Type Culture Collection (ATCC) Boletim Técnico No. 8, Cell Recomendações Linha teste de verificação [24]. Especificamente, as células de baixa passagem (ou seja, 15 passagens) congelados stocks foram utilizadas e foram reabastecido após 20 passagens, as células foram submetidos a exame microscópico de rotina para confirmar uniforme e arquitetura celular padrão e nenhuma infecção microbiana, e as células foram testado e considerado negativo para infecção por micoplasma.

Para experiências knockdown, Dharmacon ON-Targetplus SmartPool siRNA segmentação MAP2K4 (L-003574-00-0005), HSP27 (L-005269-00-0005), MMP-2 (L-005959- 00-0005), ou não segmentação de siRNA (D-001810-10-05) foi transfectado em células utilizando Dharmafect Duo (T-2010, tudo a partir de Thermo Scientific), juntamente com pCMV-β-galactosidase (Agilent Technologies), e utilizado após 48 horas, conforme descrito por nós [11]

Reagentes e Plasmids

A seguir foram adquiridos:. anticorpos, SEK1 /MKK4 (# 9152), fosfo-p38 MAPK (T180 /Y182) (# 4631), p38 MAPK (# 9212), fosfo-SAPK /JNK (T183 /Y185) (# 4668), SAPK /JNK (# 9258), fosfo-HSP27 (# 2401), HSP27 (# 2402) , e GAPDH (# 2118), tudo a partir de Cell Signaling Technology, e peroxidase de rábano conjugado com anti-ratinho e anti-coelho, de GE Healthcare Biosciences; plasmídeos, tipo selvagem e MAP2K4 activa constitutiva (# 14615 e # 14813; Addgene) e GFP (cores vívidas pcDNA 6,2 /N-EmGFP-GW /TOPO, Invitrogen); inibidores químicos, inibidor de p38 MAPK, SB203580 (Sigma-Aldrich) e controle negativo associado, SB202474 e JNK Inhibitor II (SP600125), e o Controlo Negativo JNK Inhibitor II (N

1-metil-1,9-pyrazoloanthrone), tudo a partir de EMD Millipore.

Modelo murino de próstata humana metástase de câncer

As células foram implantadas e metástases à distância quantificados como descrito anteriormente por nós, com modificações [13], [25]. Resumidamente, 2,5 × 10

5 células foram implantadas na próstata ventral de c atímicos camundongos 6-8 semanas de idade do sexo masculino Balb /, alimentados Harlan Teklad 2016S comida e água

ad libitum

, e alojados em uma barreira facilidade com 12 horas ciclo claro /escuro. Após 6 semanas, o tecido tumoral foi congelado rapidamente, os pulmões foram fixados em formalina /parafina, e sangue e medula óssea foram cultivadas em RPMI completo 1640 com G418 por 10 dias, e na presença de CTCs gravado.

Com 45 mícron passo-seções, 4-micron secções de tecido de pulmão adjacentes foram histoquímica para GFP e com hematoxilina e eosina (H e). Metástases foram marcados, de forma cega, como grupos de células positivas ≥5 GFP.

Celulares Invasão Ensaios

invasão celular foi medida como descrito por nós, com modificações [26]. Após a adição de 1 × 10

5 células, em meio RPMI 1640 com 0,1% de BSA, a BD BioCoat Factor de Crescimento Reduzida câmaras de Matrigel com 8 uM membranas, células invadidas por 24 horas para a câmara inferior, que contém isento de soro NIH 3T3 meio condicionado . Os ensaios foram realizados pelo menos 3 vezes separados, cada um em repetições de n = 3. Em algumas experiências, as células foram tratadas com 10 uM de inibidor a 48 horas antes, e durante a invasão.

invadir as células, isto é, na membrana de fundo, foram metanol fixo, cristal violeta manchado, e fotografada e contadas sob microscopia de luz. Em poços paralelos, as células da membrana superior não foram removidos, permitindo a confirmação de números iguais de células total carregado. Para as experiências de ARNip, as células foram coradas utilizando o

In Situ

β-Galactosidase A coloração Kit (Agilent Technologies), seguida por imagem e contagem invadida e não invadida β-gal positivos células por poço.

celular Ensaios de migração

migração celular foi medida como descrito por nós, com modificações [26]. Cada BD Falcon bem, com 8 uM membranas, foi carregado com 2,5 × 10

4 células, e deixadas migrar durante 8 horas para os meios condicionados na câmara inferior. As células foram coradas com violeta de cristal, como acima. Os ensaios foram realizados 3 vezes separados, cada um em repetições de n = 3.

quantitativa da Transcriptase Reversa de Reacção em Cadeia da Polimerase

quantitativa de transcriptase reversa da polimerase de reacção em cadeia (qRT /PCR) foi realizada como descrito por nós [27]. Resumidamente, o ARN foi isolado com o RNeasy Mini Kit (QIAGEN), para as células e com Trizol (Invitrogen), seguido de RNeasy Mini Kit de purificação para o tecido do tumor, o ADNc sintetizado utilizando TaqMan Transcrição Reversa Reagentes e qPCR realizada utilizando TaqMan Universal PCR Master Mix e Primer- pares de sondas em um ABI Tempo real PCR System 7500 (todos da Life Technologies). sondas de iniciadores foram: GAPDH (Hs99999905_m1), MMP-2 (HS00234422_m1), MMP-9 (Hs00234579_m1), MMP-10 (Hs00233987_m1), MMP-13 (Hs00233992_m1). Pelo menos dois ensaios separados foram realizados, cada um em repetições de n = 2, ciclos limiares médios resultantes foram normalizadas para GAPDH, e a expressão do gene relativo calculado pela 2

-ΔΔCt método de [28].

celular ensaio de crescimento

Cinco ensaios de crescimento celular dia foram realizadas como descrito por nós [23]. Resumidamente, após cinco dias de crescimento exponencial não confluentes em placas de 96 poços, dimethylthiazoldiphenytetrazolium brometo (MTT) foi adicionado, e OD

540 determinado. Os ensaios foram repetidos três vezes, cada um em réplicas de N = 3.

macio Agar Crescimento Ensaio

Em um formato de placa de 6 bem, 1 × 10

4 células /0,5 ml 0,3% ADN agar de base de qualidade (Sigma Aldrich) foram mergulhadas em 1 ml de 0,5% de agar, todos feitos com e, finalmente, coberto com 0,5 ml de RPMI 1640 meio de cultura celular. Após 14 dias, as colónias foram coradas violeta de cristal e contadas por microscopia de luz. Os ensaios foram realizados três vezes, cada uma em réplicas de N = 2.

Western blots

As transferências de Western foram realizados como anteriormente descrito por nós [15]. As concentrações de anticorpos foram as instruções do fabricante.

foram considerados estatisticamente significativos se p-valor do teste t de Student dos dois lados era ≤0.05 análise estatística

Grupos.

Resultados

Aumenta MAP2K4 Human Prostate Cancer Metástase

Nós engenharia expressão estável de tipo selvagem MAP2K4 (WT-MAP2K4), constitutiva MAP2K4 ativa (CA-MAP2K4) ou vector vazio, para controles (VC), em células PC3-M. A construção de CA-MAP2K4 tem mutações pontuais Ser220Glu e Thr224Glu no seu motivo de activação [29]. Conforme determinado por Western blot, Fig 1A, CA-MAP2K4 e WT-MAP2K4 linhas celulares expressam MAP2K4 2,9 e 4,3 vezes maiores níveis em média, respectivamente, em comparação com a média de linhas celulares de capital de risco. Cada CA- indivíduo ou linha de células WT-MAP2K4 expressa níveis ≥2.6 vezes maior. Estes resultados demonstram que é possível projetar linhas celulares MAP2K4 superexpressão.

A) a expressão da proteína MAP2K4 em linhas celulares variante MAP2K4. A expressão da proteína MAP2K4 foi medida no tipo selvagem, WT1, WT2, e constitutiva ativa, CA1, CA2, CA3, MAP2K4 sobre expressando linhas celulares, e controle do vetor, VC1, VC2, linhas celulares por Western blot. Um Western blot representativo é descrito, com a quantificação dos níveis de MAP2K4 /GAPDH, normalizados para células de VC1, mostrados por cima de cada pista. B) Invasão de linhas celulares variante MAP2K4. Os ensaios de invasão de células de Boyden câmara de Matrigel foram realizadas, tal como descrito em Métodos. Os dados são a partir de 5 experiências independentes, cada uma em repetições de n = 3. Os dados do respectivo tipo selvagem, linhas de células activas e de controlo do vector constitutivos foram combinadas para dar uma média lida para WT-MAP2K4, MAP2K4-CA e VC células, respectivamente . Os dados são expressos como a média ± SEM de percentagem de células de VC. C-E) O efeito de expressão MAP2K4 sobre o crescimento disseminação e tumor metastático. um número igual de ratinhos foram implantados com células ortotopicamente VC1 ou VC2 (formando o grupo Vc), ou células de WT1 WT2 coorte (WT), ou com CA1, CA2 ou células CA3 (CA) da coorte. Em (C) o número resultante de metástases distantes é expressa como a média ± percentagem SEM de ratinhos CR, em (E) O número de ratinhos em desenvolvimento de células tumorais em circulação é descrito, e em (F), o volume do tumor é representada graficamente como a média ± SEM de percentagem de ratinhos VC. Uma imagem representativa de uma metástase distinta é mostrado em (D). * Denota p≤0.05 entre VC e um grupo experimental.

Para avaliar a relevância funcional do MAP2K4 superexpressão, avaliamos a capacidade de linhas de células para invadir em um ensaio de câmara de Boyden Matrigel, Fig 1B. A sobre-expressão de MAP2K4 aumentou significativamente a invasão para uma média de 328% para as linhas de células WT-MAP2K4 e de 490% para as linhas celulares CA-MAP2K4, em comparação com as linhas celulares de CV. Para as linhas celulares individuais, isto é, dois de dois WT-MAP2K4 e três de três CA-MAP2K4, níveis de invasão foram estatisticamente significativa, em comparação com células de controlo (dados não apresentados). Em paralelo com a engenharia MAP2K4 linhas de células que sobre-expressam, nós também desenvolveram uma série de linhas de células estáveis ​​MAP2K4 knockdown utilizando dois curto hairpin shRNA vectores que expressam diferentes, e confirmou knockdown era específico para MAP2K4 (dados não mostrados). No entanto, ao testar a função destas linhas de células em ensaios de invasão, não observamos um fenótipo consistente. Especificamente, metade das linhas de células clonais exibiram invasão diminuiu, ao passo que a metade não apresentaram qualquer alteração. Este achado é congruente com um nível de limiar de expressão necessária para efeitos de MAP2K4 sobre regulação da invasão. Devido à falta de fenótipo consistente com knockdown de MAP2K4, que optou por não seguimento a este projecto. Em contraste, com sobre-expressão MAP2K4 nossos resultados demonstram claramente um aumento consistente de fenótipo invasão e são consistentes com as observações em humanos, onde a expressão aumentada MAP2K4 ocorre em lesões na próstata invasivo.

Para determinar se a expressão aumentada aumenta MAP2K4 metastático potencial, que examinou o efeito de MAP2K4 sobre o crescimento do tumor e formação de metástases

in vivo

utilizando um modelo murino ortotópico de metástase CaP humana especificamente desenvolvido por nós para quantificar esses parâmetros [13], [25]. Este modelo é sensível aos agentes terapêuticos anti-motilidade, bem como para alterações na expressão de genes que regulam a progressão metastático. Neste modelo, as células CaP humanos são directamente implantadas na próstata, o que permite a medição do tamanho do tumor primário, as células de CaP que entram na corrente sanguínea como no trânsito células tumorais (CTCs), células CaP circulando na medula óssea, e de pulmão distante metástase. Metástases para os pulmões é uma característica objectivo primário deste modelo, permitindo que a quantificação precisa de depósitos metastáticos individuais, e, por conseguinte, uma medida precisa da capacidade das células primárias para metastizar para fora do seu órgão de origem, emulando a situação em seres humanos.

Três grupos de ratos foram implantados com a utilização de células de capital de risco (onde um número igual de ratinhos foram implantados com células quer VC1 ou VC2), as células WT-MAP2K4 (números iguais implantados com células WT1 ou WT2), ou com CA-MAP2K4 células (números iguais implantado com qualquer CA1, CA2 ou células CA3), obtendo-se ratinhos viáveis ​​21, 26 e 28 após a cirurgia em ratos VC, WT-MAP2K4 e CA-MAP2K4 coortes, respectivamente. Seis semanas após a cirurgia, o tamanho do tumor primário, metástase, e CTC foram medidos em cada ratinho. A expressão aumentada de qualquer WT-MAP2K4 ou CA-MAP2K4 aumentou significativamente metástases à distância de 16,2 e 17,4 vezes, respectivamente, em comparação com ratos de capital de risco, sem diferença significativa entre camundongos CA-MAP2K4 WT-MAP2K4 e, Fig 1C. Uma imagem representativa de uma metástase distinta é mostrado na Figura 1D. Estes resultados demonstram MAP2K4 aumentos aumentou humana CaP metástase. Curiosamente, CTC foram apenas observados em ratos CA-MAP2K4, foram detectados no sangue de 11% (28/03) e de medula óssea de 7% (2/28), Fig 1E, e demonstram que CTC são relativamente raras em MAP2K4- metástase conduzido.

Apesar ratinhos WT-MAP2K4 exibem significativamente aumentada em comparação com a metástase VC, o tamanho do tumor primário em ratinhos WT-MAP2K4 foi uma média de 24% menor, embora não estatisticamente significativa, a Fig 1F. Como o aumento do tamanho do tumor em-e-do-si pode afectar a propagação metastática, isto demonstra MAP2K4 tem um efeito principal sobre a regulação do comportamento metastático. Curiosamente, os tumores de murganhos CA-MAP2K4 aumentou significativamente de 2,04 e 2,67 vezes, em comparação com ratinhos WT e VC-MAP2K4, respectivamente. Portanto, tipo selvagem MAP2K4 não aumenta o crescimento do tumor, mas constitutiva MAP2K4 ativo faz.

MAP2K4 altera a produção de protease, mas não crescimento celular migração ou célula

in vitro

Tendo mostraram que MAP2K4 aumenta a metástase, buscamos aprofundar nossa compreensão dos mecanismos subjacentes. expressão MAP2K4 crônica aumentou invasão celular (Fig 1B) e invasão celular é um dos principais determinantes do comportamento metastático. A seguir, avaliou se o aumento da invasão celular em células com superexpressão MAP2K4 era dependente MAP2K4 por derrubar MAP2K4 com siRNA. Na Figura 2A, para cada uma das linhas de células, foi conseguida knockdown de 21-55%. A seguir, demonstrou que MAP2K4 knockdown inverteu significativamente o aumento da invasão fenótipo observado em ambas as células CA-MAP2K4, Fig 2B WT-MAP2K4 e. Portanto, a invasão da célula permanece dependente de expressão MAP2K4 continuou.

Os estudos foram realizados em linhas de células variante MAP2K4. A) Queda de proteína MAP2K4 por siRNA. Após a transfecção das células com ARNsi de segmentação MAP2K4 (siMAP2K4) ou controlo não-direccionamento (SICON), MAP2K4 expressão foi medido por transferência de Western. Percentagem knockdown é indicada acima da mancha. B) Efeito do MAP2K4 knockdown na invasão celular. As linhas celulares variantes MAP2K4 foram tratadas com siRNA, como indicado, e a invasão de células medido e representado como na figura 1. Os dados são de quatro experiências, cada uma em repetições de n = 2, e são expressos como a percentagem de células invasoras. C) Efeitos sobre a migração celular. A migração celular foi medida como descrito em Métodos. Os dados de tipos individuais de clones foram combinados, são de três experiências independentes, cada uma em repetições de n = 3, e são expressos como a percentagem de células que migram, normalizada para VC. D) expressão transcrição MMP. Os níveis de MMP-2, MMP-9, MMP-10 e MMP-13 os níveis de transcritos foram medidos por qRT /PCR, normalizadas para GAPDH e expressas como a percentagem de CV. Os dados são de quatro experiências independentes, cada uma em réplicas de N = 2. E o crescimento celular). As células foram colocadas nas concentrações indicadas, deixadas a crescer durante 5 dias, o MTT adicionado, e a densidade óptica determinada. Os dados são de três experimentos independentes, cada N = 3. A formação F) Colony. A formação de colónias após 14 dias foi determinado em três experiências independentes, cada um N = 2, e expressos como a percentagem de CV. Valores em todos os gráficos representam a média ± SEM. * Denota p≤0.05 entre os grupos indicados.

Dado o papel reconhecido de invasão celular na progressão metastática, examinamos ainda mais as bases mecanicistas do efeito do MAP2K4 sobre a invasão da célula. invasão celular é essencialmente ditada pela migração celular acoplado a protease de digestão. Nem WT-MAP2K4 nem CA-MAP2K4 superexpressão aumento da migração celular em um ensaio de câmara de Boyden não revestido, Fig 2C. Além disso, observou-se um efeito consistente sobre a migração celular medida por ensaio de motilidade de uma única célula (dados não mostrados). A seguir, examinou o efeito do MAP2K4 após expressão protease. Uma vez que existe uma grande variedade de proteases conhecidas, que em primeiro lugar realizada uma tela para proteases relevantes. Nós previamente estabelecido genisteína se liga a e inibe a quinase MAP2K4, inibindo assim a invasão de células CaP humana [11]. Por isso, examinaram os efeitos do tratamento de genisteína em células PC3-M nativas utilizando a matriz extracelular e moléculas de adesão RT

2 sistema Array Profiler PCR, os perfis 84 genes humanos que regulam célula-célula e as interacções célula-matriz (Figura S1). Os seguintes proteases foram significativamente regulada para baixo por, pelo menos, duas vezes por genisteína: MMP-2, MMP-10 e MMP-13, e foram confirmados por específica para o gene de qRT /PCR (Figura S1). Com base nestes achados, foi examinada a expressão destes três proteases no contexto de MAP2K4 superexpressão. gelatinases Além disso, como a MMP-2 e MMP-9 estão intimamente relacionados, frequentemente co-regulado, e como genisteína afecta a MMP-9 é algumas linhas de células, ainda que esporadicamente e em pequeno grau, que, adicionalmente, medido a MMP-9 [30]. A medição dos níveis de transcrito por qRT /PCR revelou que a MMP-2 foi significativamente aumentada em média de 15 vezes em comparação com VC, em ambas as células WT-MAP2K4 e CA-MAP2K4. MMP-9 fez aumentar de forma significativa de 2 vezes, mas apenas em células WT-MAP2K4. MMP-10 e MMP-13, não foram afectados. aumenta Portanto, MAP2K4 mediadas na invasão não é devido a alterações na migração celular, mas estão associados com alterações na expressão de protease, a MMP-2 em particular. Isto é clinicamente relevante, como a MMP-2 pode degradar o colagénio IV, um dos principais componentes de tecido da próstata, e tem sido associada com mau prognóstico, incluindo o desenvolvimento de metástases (revisto em [31]).

A seguir investigou o aumento do tamanho do tumor observada em ratinhos CA-MAP2K4, Fig 1E, para determinar se o crescimento é alterado

in vitro

, Fig 2E-F. Em cinco dias

in vitro

ensaio de MTT, não foram observadas diferenças no crescimento celular entre os grupos, Fig 2E. Em um ensaio de formação de colónias em agar mole de 14 dias, as células CA-MAP2K4 cresceu ligeiramente mais lento do que as células de capital de risco e WT-MAP2K4, mas essa mudança não foi significativa, Fig 2F. Estes resultados demonstram que, sob

in vitro

condições de crescimento, nem WT-MAP2K4 nem CA-MAP2K4 afetar o crescimento celular.

MAP2K4 superexpressão altera especificamente a fosforilação HSP27 e expressão de proteína total

os resultados acima demonstram que MAP2K4 relativamente especificamente aumenta MMP-2. modificação transiente de MAP2K4 regula a MMP-2 e células invasão por fosforilação e activação da MAPK p38 [12]. Além de p38 MAPK, MAP2K4 também pode ativar de JNK, ou ambas as proteínas, dependentes do sistema modelo [32]. JNK é comumente associada a alterações na proliferação e apoptose em resposta ao estresse em CaP humana [33] – [35], mas também com as mudanças na migração celular e invasão [36], [37]. Por conseguinte, a hipótese de que a expressão MAP2K4 crónica iria aumentar a activação de MAPK p38 e /ou JNK. Nós testamos esta teoria, examinando MAPK fosfo-p38, -JNK1 e -JNK2 níveis de Western blot em MAP2K4 mais de linhas celulares que expressam, utilizando anticorpos específicos fosfoproteína. No entanto, os nossos resultados não suportam nossa hipótese como superexpressão de MAP2K4 não aumentou tanto os níveis de proteína fosfo- ou totais de ambos p38 MAPK ou JNK, Figura S2.

Nossos resultados suportam a hipótese de que, sob condições de MAP2K4 sustentada a sobre-expressão, como ocorre no cenário clínico, as vias de compensação podem ser alvos ignorando imediatamente a jusante de MAP2K4, deixando-as assim num estado inactivado. HSP27, um a jusante de p38 MAPK, aumenta tanto a MMP-2 e expressão invasão celular em CaP humana, sob condições de transfecção transitória [12], [15]. Estudámos, portanto, o estado de HSP27, Fig 3A-B. Os níveis totais de ambos HSP27 fosfo- total e, em comparação com a GAPDH, foram aumentadas. Fosfo- e HSP27 total aumentou de 3,4 (significativamente) e 2,7 (apenas uma tendência; valor p = 2 faces 0,065), respectivamente, para células WT-MAP2K4, e ambos significativamente de 3,1 e 3,0 vezes para as células CA-MAP2K4 . A /aumento total rácio HSP27 fosfo-HSP27 era pequena, e significativa apenas para as células WT-MAP2K4. Estes resultados demonstram MAP2K4 conduz ao aumento dos níveis de proteína total e fosfo-HSP27. Não houve diferença na expressão dos genes HSP27 e que sobre-expressam entre MAP2K4 células VC, Figura 3C, o que indica que as diferenças na expressão da proteína resultou de alterações na tradução e /ou a degradação de proteínas. Tomados em conjunto, estes resultados determinar que a sobre-expressão MAP2K4 crónica conduz a um aumento da expressão da proteína HSP27, enquanto evitando a activação de p38 MAPK e JNK.

A expressão das formas totais e fosforiladas de proteínas Hsp27 foram avaliadas por transferência de Western na linhas celulares indicadas, AB. Dados de três manchas separadas são graficamente INB, como média ± SEM. C), os níveis de transcritos de hsp27 foram medidos por qRT /PCR, normalizadas para GAPDH e expressos como a média ± SEM de percentagem de VC.