Abstract

A diferenciação de células-tronco cancerosas (CSCs) em células cancerosas causas aumento da sensibilidade a agentes quimioterápicos. Embora a inibição do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) leva a sobrevivência CSC, o efeito de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA), um complexo mTOR 1 (mTORC1) activador permanece desconhecida. Neste estudo, foram examinados os efeitos de BCAA em células de carcinoma hepatocelular (HCC) que expressam um marcador de CSC hepática, EpCAM. Foram examinados os efeitos de BCAA e /ou 5-fluorouracil (FU) sobre a expressão de EpCAM e outros marcadores relacionados-CSC, bem como a proliferação celular em células de carcinoma hepatocelular e num modelo de murganho de xenoenxerto. Também caracterizado CSC relacionadas com o e relacionados com o sinal de mTOR expressão da molécula e tumorigenicidade em células do CHC com knockdown de Rictor ou Raptor, ou superexpressão de rheb constitutivamente activo (caRheb). sinal relacionadas com mTOR expressão da molécula também foi examinado em células de carcinoma hepatocelular tratados com BCAA.

In-vitro

BCAA reduziu a frequência de células-EpCAM positiva e melhorou a sensibilidade para o efeito anti-proliferativo de 5-FU. Combinada com 5-FU e BCAA proporcionou melhor eficácia antitumoral de 5-FU sozinho no modelo de xenoenxerto. A estimulação com doses elevadas de BCAA mTORC1 activado. experiências de knockdown e superexpressão revelou que a inibição do complexo mTOR 2 (mTORC2) ou activação de mTORC1 levou a uma diminuição da expressão de EpCAM e pouca ou nenhuma tumorigenicidade. BCAA podem aumentar a sensibilidade à quimioterapia, reduzindo a população de cscs através da via mTOR. Este resultado sugere a utilidade de BCAA em terapia de câncer de fígado.

Citation: Nishitani S, Horie M, Ishizaki S, Yano H (2013) de cadeia ramificada Amino Suprime Ácido cancro hepatocelular Stem Cells através da ativação do alvo da rapamicina em mamíferos. PLoS ONE 8 (11): e82346. doi: 10.1371 /journal.pone.0082346

editor: Diego CALVISI, Institut für Patologia, Greifswald, Alemanha, Alemanha |

Recebido: 28 Julho, 2013; Aceito: 31 de outubro de 2013; Publicação: 27 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Nishitani et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm financiamento ou apoio ao relatório.

Conflito de interesses: Esta pesquisa pertence a Ajinomoto Pharmaceutical Company. Os autores declaram que um pedido de patente relacionada com BCAA utilizada neste estudo (nome da patente: Agent para aumentar a atividade antitumoral do fármaco quimioterapêutico, pedido de patente No: WO2012 /111790). SN, MH e SI são empregados por Ajinomoto Pharmaceuticals, Co, Ltd. Este estudo é realizado em modelos animais e não tem implicações diretas em seres humanos. No entanto, o trabalho deste estudo serão traduzidos para seres humanos em estudos futuros e, portanto, esta publicação pode adicionar algum benefício para a Ajinomoto Pharmaceuticals, Co, Ltd. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento a declarar. Para agravar proporção de BCAA usado neste estudo é o mesmo que uma relação de composição de grânulos de BCAA que são vendidos pela Ajinomoto Pharmaceuticals Co. Ltd. do Japão com o nome de LIVACT ® grânulos. No entanto, a empresa não desenhar um benefício comercial directa a partir deste estudo, uma vez que não é realizado em seres humanos. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O termo “células-tronco cancerígenas” (CSC) refere-se a uma célula cancerosa com o características de uma célula-tronco. As células estaminais têm o potencial de auto-renovação e diferenciação em outros tipos de células, e, por conseguinte, pode restaurar células em apoptose. Supõe-se que os carcinomas em desenvolvimento a partir de células estaminais passam por um processo de divisão assimétrica. CSCs foram inicialmente identificados na leucemia mielóide aguda [1] e, subsequentemente, foram descobertos em outros cancros. Um desafio surgiu quando se pensava que os CSCs foram resistentes à terapia. Muitos agentes quimioterapêuticos alvejar células em proliferação activa e pode não ser eficaz contra células em proliferação limitada. Sobreviventes células cancerosas foram determinados como sendo um factor de recrudescência ou metástase para outros tecidos [2,3]. Estudos descobriram muitos marcadores CSC em vários cancros. No carcinoma hepatocelular (HCC), CD133 e EpCAM foram identificadas como marcadores CSC [4]. Além disso, CSCs expressar transportadores ABC quando expostos ativamente para agentes quimioterápicos, contribuindo para a resistência terapêutica [5]. Um estudo combinação avaliar essas CSCs refratários aos tratamentos descobriram que as células cancerosas existentes poderiam ser completamente erradicado [6]

Duas abordagens para a terapia do cancro têm sido sugeridos:. Terapia Acorde e terapia do sono. terapia acordar aumenta a sensibilidade a agentes quimioterápicos por induzir a diferenciação de CSCs para células cancerosas. A oncostatina M, uma citocina da família da IL-6, é um indutor bem conhecido da diferenciação. A combinação desta citocina com um agente quimioterapêutico anti-tumoral melhorada eficácia num modelo de xenoenxerto de carcinoma hepatocelular [7]. No entanto, a oncostatina M não foi clinicamente testado. terapia do sono supostamente mantém baixa proliferação de CSCs, mas a fisiopatologia deste fenómeno permanece obscuro. Estudos têm focado principalmente em células hematopoiéticas com alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) sinais associados com a diferenciação [8,9]. É bem conhecido que os aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA), especialmente leucina, activar mTORC1 [10,11]. BCAAs são necessárias para o metabolismo de amônio nos músculos quando o fígado é incapaz de executar esta função. Relatórios recentes têm demonstrado que a síntese de albumina de BCAA activa em hepatócitos primários de rato [12] e do fígado cirrótico rato [13] por meio de sinalização da mTOR, um regulador central da síntese de proteínas, através da detecção de condições nutricionais [14]. No Japão, a suplementação farmacológica com grânulos de BCAA é utilizado para o tratamento de hipoalbuminemia em pacientes com cirrose descompensada fígado (LC) [15]. grânulos de BCAA, prescrito três vezes por dia após as refeições para proporcionar uma dose diária total de 12 g de BCAA, têm uma relação de 2: 1,2 em peso de leucina para isoleucina para valina: 1. BCAA suprime a ocorrência de HCC em modelos animais [16,17] e os pacientes LC [18]. Estamos focados em induzir a diferenciação CSC, em particular o aumento da sensibilidade quimioterápico. CSC diferenciação foi avaliada através da activação mTORC1 com BCAA, e estudou-se o efeito anti-tumor da combinação de BCAA e agente quimioterapêutico

In vitro

e

vivo. Nossos resultados vão ser de valor considerável para a compreensão da eficácia clínica da terapia carcinoma de fígado em pacientes com LC.

Materiais e Métodos

Todo o trabalho animal foi conduzido de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais relevantes. h3>

cultura celular e reagentes

Duas linhas celulares de carcinoma hepatocelular, HAK1-B [19] e Huh7, foram mantidas em RPMI 1640 (Nacalai Tesque, Japão) e DMEM (Nacalai Tesque, Japão) ou, respectivamente, LC médio, que é um meio com baixa relação de Fischer (relação entre a concentração de BCAA em relação à concentração de ácido aromático) [20] contendo 1% de penicilina /estreptomicina e soro bovino fetal a 10% (FBS). Os reagentes utilizados incluíram anti EpCAM-FITC anticorpo conjugado (Abcam, EUA), Hoechst 33342 solução (DOJINDO, Tóquio, Japão) para a coloração nuclear e número de células contando por matriz sistema de digitalização (tecnologia Thermo Fischer, EUA); 5-fluorouracil (5-FU) foi obtido a partir Kyowa Kirin, no Japão.

construção de plasmídeo de Rheb constitutiva forma ativa

plasmídeo Bandeira-caRheb foi fornecido pelo Dr. Tomohiko Maehama (The Metropolitan Tokyo Instituto de Ciência médica, Tóquio, Japão).

plasmídeos shRNA

RNA hairpin Pequeno (shRNA) plasmídeos foram obtidos a partir de terapêutica iGENE (EUA).

O sistema de lipofectamina shRNA foi concebido de acordo com as instruções do fabricante. As sequências alvo de shRNA foram como se segue: SH-rapina: 5′-GCGGAAAGGATTATGGGT-3 ‘; SH-Rictor: 5’-GTAGAAAGTTCAACGAGCT-3 ‘; e U6RepT7STOP (SH-ARN controlo de vector): 5’-CACCTTTTTTTAAAAAAATCCT-3 ‘

reacção em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (Q-PCR)

Q-PCR foi utilizado para detectar mRNA. níveis de CYP3A4, Bmi1, EpCAM, FOXO3a, Raptor, e Rictor. Um total de 1 × 10

5 células HAK-1B foram semeadas em meio RPMI1640 contendo 10% de FBS durante 24 horas antes das experiências. BCAA (4 mM) foi adicionado ao meio e mantida durante 72 h. O ARN foi isolado utilizando o reagente TriPure isolamento (Roche Applied Science) e DNA complementar (cDNA) foi sintetizado utilizando o ADNc de alta capacidade kit de transcrição reversa (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Real-time polymerase chain reaction (PCR) foi realizada utilizando o Sistema de Real-Time PCR 7500 (Applied Biosystems) e potência PCR Master Mix SYBR Green (Applied Biosystems), contendo iniciadores específicos, de acordo com as instruções do fabricante. Cada amostra foi normalizado para a expressão de GAPDH

As sequências dos iniciadores para a RCP foram as seguintes: CYP3A4:. Directo 5′-TTGGAAGTGGACCCAGAAAC-3 ‘, reverso 5′-CTGGTGTTCTCAGGCACAGA-3′; Bmi1: frente 5’-CCAGGGCTTTCAAAAATGA-3 ‘, reverso 5′-GCATCACAGTCATTGCTGCT-3′; EpCAM: directo 5’-GCTGGTGTGTGAACACTGCT-3 ‘, reverso 5′-ACGCGTTGTGATCTCCTTCT-3’;

FOXO3a: encaminha 5′-TGCTGTATGCAAGAACTTTCCAGTAGCAG-3 ‘, reverso 5′-ACTCTAGCCCCCATGCTACTAGTG-3’; Raptor: frente

5′-CCCTGCTACTCGCTTT-3 ‘, reverso 5′-GTGAGGTGTTTCCCCT-3’;

Rictor: frente 5′-GGAAGCCTGTTGATGG-3 ‘, reverso 5’-GGCAGCCTGTTTTATG-3 ‘

a contagem de células e EpCAM-positivo de detecção de células de ensaio

as células foram cultivadas na presença ou ausência de BCAA durante 72 h, em seguida, fixo usando paraformaldeído a 4% e coradas com Hoechst 33342 (10 mg /ml, Dojindo, Tóquio, Japão) durante 1 min. As contagens de células foram realizadas utilizando o protocolo de ativação alvo e um sistema de verificação de matriz. células EpCAM-positivos foram detectados por coloração das células fixadas com anticorpo FITC EpCAM conjugado durante 1 h, e o número de células EpCAM-positivos por 5000 células foram detectadas pelo sistema de digitalização

Ensaio de apoptose

células foram cultivadas com 5-FU (0, 1, 2 ug /mL) na presença ou ausência de BCAA 2 mM durante 72 h em placas de 96 poços (BD Biosciences). Anexina ligação a membranas celulares V foi visualizado com um kit de detecção de anexina V-FITC (TAKARA BIO INC, Tóquio, Japão) e Hoechst 33342 solução de digitalização matriz.

Western blot

Um total de 1 × 10

5 Huh7 células foram semeadas em meio DMEM 24 h antes do estudo experiências. O meio foi trocado por meio de LC durante 3 dias ou meio DMEM com vários tratamentos: knockdown durante 5 dias, a sobreexpressão durante 1 dia, e tratamento de BCAA durante 30 minutos a 3 dias. Western blotting foi realizado da maneira usual. As células foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e lisadas em tampão RIPA contendo protease completo e cocktail de inibidores de fosfatase (Roche Applied Science, Indianapolis, INC). As membranas foram bloqueadas em Bloqueio Um-P (Nacalai Tesque, Japão). Os anticorpos incluídos coelho anti-Rictor (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), de coelho anti-rapina (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), de coelho anti-P-70S6 quinase, anti-P-total-70S6 quinase, de coelho anti-P -4EBP1 (T37 /46), de coelho anti-P-Akt (T308 ou S473), de coelho anti-p-GSK3β (S9), de coelho anti-β-catenina (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) e anti-rato a-tubulina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). A densitometria foi realizada directamente sobre a membrana manchada usando um sistema de câmara de dispositivo de carga acoplada (LAS-4000 Mini, Fujifilm, Tóquio, Japão).

Experimentos Knockdown

Huh-7 foram transfectadas com controle negativo (NC) ou de destino (mTORC1 ou mTOR2 regulamentar proteína associada de Raptor e Rictor) RNA pequeno hairpin (shRNA) usando Lipofectamine ™ LTX Reagent (Invitrogen Technology, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. foram seleccionados transfectantes estáveis, como descrito anteriormente [21], para a resistência a puromicina durante 2 dias e posteriormente cultivadas em DMEM contendo FBS a 10% durante 2 dias. Q-PCR e western blot confirmou a eficácia knockdown.

Os estudos em animais

Animals.

O protocolo experimental que se segue foi analisado e aprovado pelo Comitê de Cuidado Animal da Ajinomoto Co., Inc. ratinhos nus fêmea BALB /c ou ratinhos NOD /SCID com a idade de 6 semanas foram obtidos a partir de Charles River Japan (Yokohama, Japão). Eles foram mantidos em gaiolas individuais em uma sala limpa, ar-condicionado (24 ± 1 ° C), com um-12 h h ciclo claro-escuro de 12 (luzes acesas 0.700-1.900). Os animais foram alimentados com uma dieta pó estéril estoque (CRF-1, Oriental Yeast, Tóquio, Japão).

Quimioterapia.

Um milhão de células HAK-1B foram suspensos em 100 mL de RPMI1640 com FBS, e uma injecção subcutânea foi realizada. A incidência e o tamanho dos tumores subcutâneos foram registadas quando o volume médio tinha atingido 100 mm

3 como anteriormente descrito [7]. injecções de tumor de 50? L de DMSO a 10% /PBS (controlo) ou 5-FU (250 mg /tumor) foi dado duas vezes por semana e 3% suplementado com BCAA ou 3% dieta suplementada-caseína foi fornecida diariamente durante 2 semanas começando 7 dias após a injecção de células tumorais. Os volumes tumorais foram avaliados utilizando medições calibradas e calculadas com a fórmula V = 1/2 ×

a

2 ×

b

onde

um

é o eixo curto e

b

é o eixo longo do tumor. Nas

th os dias, todos os ratos foram sacrificados sob anestesia, os tumores isolados foram pesados, seus volumes calculados e tecido analisadas para a expressão do mRNA.

Tumorigênese.

Um milhão de células Huh7 14 transfectadas com partículas de NC lipofectal contendo, rapina, ou Rictor shRNA, ADNc de plasmídeo de controlo (pcDNA), ou plasmídeo bandeira caRheb foram colhidas e injectadas subcutaneamente em ratinhos NOD /SCID (n = 5 em cada grupo). Os volumes dos tumores foram avaliados como antes. Os ratinhos portadores da NC, knockdown (KD), ou mais de expressão xenoenxertos foram sacrificados após 4 semanas.

Métodos estatísticos.

Os resultados foram expressos como média ± SE. A significância foi determinada em EXSUS versão 7.7.1 (CAC Corporation, Tóquio, Japão) através da realização de teste de Dunnett, teste de Tukey e de Student

t

-teste, foram consideradas significativas para valores de P 0,05

Resultados

O efeito de BCAA em EpCAM-positividade em células HAK-1B

células HAK-1B foram de aproximadamente 10% EpCAM-positivo (Figura S1).; esta diminuiu significativamente de uma forma dependente da dose, na presença de 1-4 mM de BCAA (Figura 1A). BCAA 4 mM conduziu a um aumento na expressão de CYP3A4 ARNm, um marcador diferenciado, e por outro lado 1-4mm BCAA tenderam a diminuir na expressão de ARNm Bmi1, um marcador indiferenciado (Figura 1B). Estes resultados sugerem BCAA reduziu EpCAM-positividade através de diferenciação. Assim, avaliou-se a sensibilidade quimioterapêutico de HAK-1B contendo células EpCAM-positivos. Anexina V expressão, que foi utilizado para detectar o evento de apoptose primária, aumentou com o aumento das doses de 5-FU; Este aumento foi maior em células tratadas com BCAA combinação e 5-FU (Figura 1C). Além disso, a proliferação de HAK-1B foi mais fortemente inibido pela combinação de BCAA e 5-FU do que por 5-FU sozinho (Figura 1D).

teste de Dunnett, * p 0,05, ** p 0,01 n = 6, média ± SE.

A percentagem de células anexina V-positivas (C), o número de células viáveis ​​em relação (D) através de array digitalizar em células de HAK-1B cultivadas em RPMI 1640 contendo 10% de FBS com BCAA ou sem 2 mM na presença (1 ou 2 ug /ml) ou ausência de 5-FU durante 72 h, utilizando o protocolo de activação alvo de varrimento matriz. Estudante

t

-teste, * p 0,05, ** p 0,01, n = 7, média ± SE.

Os mesmos resultados foram obtidos com células Huh7 e são mostrados na figura S2 AB.

quimioterápico sensibilidade

in vivo

Para testar a hipótese de que o EpCAM positividade aumenta a sensibilidade quimioterapêutico na presença de BCAA, usamos combinado BCAA e tratamento com 5-FU em um /c nu modelo de ratinho transplantado com subcutânea BALB HAK-1B. eficácia

antitumoral foi significativa com 5-FU sozinho, e um efeito antitumoral mais forte foi conseguido com BCAA combinação e o tratamento com 5-FU. No entanto, o efeito antitumoral de BCAA não foi notável sozinho (Figura 2A, B, Figura S3). a expressão de ARNm de EpCAM foi significativamente diminuída em tumores de ratos tratados com BCAA (Figura 2C). FOXO ARNm (Figura 2D), relataram a ser expresso em CSCs [22], foi significativamente reduzida de um modo semelhante.

A expressão relativa de ARNm de várias moléculas de cada tumor foi associada com as propriedades CSC (C, D). Controlo: injecção de DMSO /solução salina /tumor de 10% + 3% de caseína contendo dieta, 5-FU: 250 mg /tumor injecção + 3% de caseína contendo dieta, dieta de BCAA: injecção de DMSO /solução salina /tumor de 10% + 3% BCAA contendo, 5-FU + dieta de BCAA: 250 ug /injecção do tumor + 3% BCAA contendo dieta durante 14 dias. teste de Tukey: * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 vs. controlo, #p 0,05 vs 5-FU, $$ p 0,01 vs. BCAA, n = 6, a média ± SE.

Mecanismo de efeitos BCAA em células Huh7 EpCAM-positivos

Considerando a eficiência de transfecção experimental de células Huh7, que usamos para avaliar o mecanismo de BCAA, assumindo que 40% do Huh7 foram EpCAM-positivos como descrito anteriormente [7]. Como em HAK-1B, as células-EpCAM positiva em Huh7 foram significativamente reduzidos em BCAA; Além disso, mTORC1 foi activada mediante tratamento de BCAA e inibida por rapamicina (Figura 3A, Figura S4A). A diminuição de células-EpCAM positiva devido a BCAA foi totalmente anulada pela pré-tratamento com rapamicina, um inibidor de mTORC1 (Figura 3A, Figura S4A). Além disso, o meio de LC, um meio de Fischer rácio baixo, inibiu a actividade de mTORC1 e aumentou a taxa de CSCs (Figura 3B). activação mTORC1 foi suprimida por meio de LC (Figura 3B, Figura S4B).

A alteração da taxa de células EpCAM-positivos em 5000 células com superexpressão de caRheb ou cDNA plasmídeo de controlo (DNA pc) no meio de controlo (DMEM contendo 10% de FBS) com e sem estimulação BCAA 4 mM durante 24 h em Huh7 (C).

a detecção de fosforilação p70S6 cinase, um membro de sinalização a jusante de mTOR, na presença de DMEM, tratamento de BCAA, o pré-tratamento com rapamicina e tratamento de BCAA, ou estimulação de LC durante 72 h em Huh7 ( A, B).

teste de Tukey ** p 0,01 vs. controlo, $$$ p 0,001 vs BCAA, n = 8, a média ± SE (A)

t de Student * p 0,05, **** p 0,0001, n = 8, a média ± SE (B, C).

Finalmente, as células EpCAM-positivos foram significativamente reduzidos pela ativação mTORC1 via superexpressão de caRheb, um fator ativador de mTORC1 sem estimulação BCAA ( Figura 3C). Assim, o efeito de BCAA em células-EpCAM positiva dependia activação mTORC1.

A associação entre o sinal de mTOR e EpCAM-positividade

Os sinais de mTOR incluem dois subtipos: mTORC1 e mTORC2 [23]. Em particular, tem mTORC1 rapina, uma proteína reguladora do complexo mTORC1, e é estimulada por BCAA, especialmente leucina. Em contraste, tem mTORC2 Rictor, uma proteína reguladora do complexo mTORC2, o que sinaliza a jusante de Akt.

A rapamicina inibe mTORC1 e mTORC2, dependendo da duração da estimulação [24,25]. Assim, pode-se determinar os efeitos de inibição mTORC1 sozinho ou inibição dupla de mTORC1 /2 em células EpCAM-positivos por pré-tratamento com rapamicina durante 1 h ou 24 h, respectivamente. Descobrimos que as células EpCAM-positivos aumentou significativamente com a inibição da mTORC1. Em contraste, as células-EpCAM positiva diminuiu com dupla inibição da mTORC1 /2, especialmente a inibição mTORC2, por pré-tratamento durante 72 h (Figura 4A).

teste de Dunnett, * p 0,05, *** p 0,001 vs. controlo, n = 6, a média ± SE

As expressões relativas de EpCAM, c-myc, e mRNA FOXO3a sobre Raptor e Rictor knockdown (BD)

teste de Dunnett, ** p 0,01, *** p 0,001 controle vs. n = 8, a média ± SE.

Estes achados sugerem a presença ou ausência de células EpCAM-positivos depende mTORC1 ou mTORC2, respectivamente. Em seguida, examinaram a expressão de ARNm de EpCAM na presença de mTORC1 mTORC2 ou perda da função de knockdown de rapina ou Rictor, respectivamente. A perda da função mTORC1 causou a expressão de ARNm de EpCAM para aumentar de forma semelhante a inibição mTORC1 por pré-tratamento com rapamicina durante 1 h. No entanto, a perda da função mTORC2 causou a expressão de ARNm de EpCAM para diminuir significativamente. Além disso, c-myc e a expressão de ARNm FOXO3a reagiam de maneira semelhante para a expressão do mRNA de EpCAM (Figura 4B-D).

Rictor, Raptor, e β-catenina também foram associados com mTOR e os sinais de Wnt /β-catenina (Figura 5A). Quando mTORC1 foi inibida por rapina knockdown, fosforilação de p70S6 cinase, o sinal a jusante de mTORC1, diminuiu, e a fosforilação da Akt (Ser473) aumentou. Isto sugere que a inibição da mTORC2 fosforilação por P70S6kinase foi revogada pela Raptor knockdown. Em contraste, quando mTORC2 foi inibida por Rictor knockdown, fosforilação de p70S6 cinase aumentada, e a fosforilação da Akt diminuiu.

Rictor ou rapina knockdown comparação com o controlo negativo (CN), caRheb comparado com o controlo de ADNc de plasmídeo (DNA PC), o tratamento com BCAA em comparação com DMEM (FBS a 10%) somente (Ctrl) (A). A razão tumor média volumes e tumorigénese na posição 4

th semana num modelo de xenoenxerto com células transplantadas com controlo negativo, knockdown de rapina, Rictor durante 5 dias, ou a sobre-expressão de ADN plasmídeo de controlo, caRheb durante 1 dia (C), e taxa de tumorigênese (B)

teste de Dunnett, * p . 0,05, *** p 0,001 vs. N.C. n = 5, média ± SE.

Quando mTORC1 foi activado por sobre-expressão ou tratamento caRheb BCAA 4 mM, a fosforilação de p70S6 cinase aumentada e fosforilação de Akt diminuiu. Além disso, a proteína β-catenina foi reduzida pela inibição da fosforilação de GSK3β através da activação mTORC1.

Além disso, GSK3β foi fosforilada por Akt (Ser473) em resposta a Raptor knockdown; No entanto, a fosforilação da proteína GSK3β e β-catenina não foi afectada por Rictor knockdown.

Tumorigênese da mTOR-knockdown e células activadas por mTORC1

A ativação do mTORC1 ou inibição de mTORC2 foi levantada a hipótese de reprimir células EpCAM-positivos. A capacidade tumorigénica de CSCs foi examinada utilizando um modelo de xenoenxerto subcutâneo implantado com Raptor ou Rictor knockdown, cDNA plasmídeo de controlo, ou caRheb superexpressão células Huh7 em ratos durante 4 semanas (Figura 5B e 5C).

BCAA activado mTORC1; No entanto, o BCAA tem duplo efeito sobre mTORC1. A estimulação com doses elevadas de BCAA diminuição das células-EpCAM positiva através da activação de mTORC1, enquanto que a estimulação com doses baixas de células aumentou-EpCAM positiva através da inibição da mTORC1 (Figura 3A e 3B). Altas doses de BCAA não poderia ser mantida através da implantação do tumor, e tumorigênese não foi estabelecida quando as células tratadas com altas doses de BCAA foram implantadas subcutaneamente. Em vez disso, utilizou-se células como as células de activação mTORC1 para o estudo tumorigénese susceptíveis de manter uma activação mTORC1 durante pelo menos uma semana caRheb que sobre-expressam.

Embora o tamanho do tumor foi menor no grupo implantado com células de rapina knockdown do que na o grupo de controlo negativo (Figura 5C), tumorigénese foi mantida em todos os 5 ratinhos, semelhante ao grupo implantadas células de controlo negativo transfecção (Figura 5B). No entanto, os dois grupos que consistem em células knockdown rictor e células que sobre-expressam caRheb tinha 0/5 ratinhos ou ratos apenas 1/5 retêm potencial tumorigénese, respectivamente. Além disso, o tamanho do tumor no grupo caRheb sobreexpressão foi menor do que no grupo de ADNc de plasmídeo de controlo.

Discussão

Uma das novas contribuições deste estudo foi a descoberta de que as células cancerosas experimentou aumento da sensibilidade a agentes de quimioterapia depois que as células EpCAM-positivos diferenciados por tratamento BCAA através da activação mTORC1 (Figura 1). Além disso, baixa estimulação de BCAA com meio de LC com um rácio baixo de Fischer (relação entre a concentração de BCAA em relação à concentração de ácido aromático), conduziu à activação mTORC1 suprimidos, resultando em células aumentou-EpCAM positiva (Figura 3B). Em pacientes com hepatite crônica ou cirrose, hipoalbuminemia e diminuição dos valores de plasma para o rácio Fischer de BCAA de ácidos aromáticos são comumente observados [26]. Estes pacientes podem desenvolver HCC ou ter uma recaída da HCC. suplementação de BCAA é conhecido para melhorar a relação de Fischer na cirrose do fígado [27]. Assim, uma proporção maior Fischer pode impedir a carcinogênese hepática ou recaída devido ao CSCs. No Japão, os grânulos de BCAA são indicados para cirrose descompensada em pacientes com hipoalbuminemia apesar da ingestão alimentar adequada, e a administração oral de grânulos BCAA eleva as concentrações de BCAA no plasma em cerca de 1 mM [20]. Após a administração oral de BCAA em ratos, a concentração no plasma de BCAA na veia porta foi várias vezes superior à concentração de BCAA no sangue periférico (dados não mostrados). Portanto, considerou-se que a concentração de BCAA usado

in vitro

(2

~ 4 mM) não foi significativamente diferente da concentração de BCAA

in vivo

.

Nós também descobriram que a ativação mTORC1 por tratamento BCAA suprimida células EpCAM-positivo e aumentou a sensibilidade de agentes quimioterapêuticos em tumores HCC (Figura 2). Examinámos ARNm EpCAM no fígado após a administração de BCAA em ratinhos normais para investigar se existe qualquer efeito sobre o fígado. Como resultado, o BCAA não mostrou qualquer efeito sobre a expressão de EpCAM no fígado (dados não mostrados).

O mecanismo dos efeitos do tratamento com BCAA em células-EpCAM positiva foi avaliada pela diferenciação acelerada ao cancro células através da activação de mTORC1. A fosforilação de GSK3β foi inibida pela activação mTORC1 e o sinal de Wnt /β-catenina a jusante, enquanto a fosforilação de β-catenina foi mantida, resultando em degradação β-catenina. Infere-se que este inibiu a translocação nuclear de β-catenina, e posteriormente inibido de transcrição, c-myc, EpCAM, e Bmi1. Além disso, os sinais a jusante de EpCAM foram determinados a ter um sinal de transcrição de c-myc [28], o que se correlacionou com a expressão de EpCAM e c-myc. Estes sugeriu que EpCAM, a expressão de c-myc diminuiu e activação mTORC1 aumentou a sensibilidade para a quimioterapia (Figura 2).

Além disso, verificou-se que a ativação mTORC1 diminuiu a expressão da proteína de Rictor via superexpressão de caRheb (Figura 5A). Estudos têm relatado anteriormente que a activação de realimentação p70S6 cinase Rictor inibiu a fosforilação, o que resulta na supressão da função Rictor [29]. No entanto, os nossos dados mostraram que a expressão da proteína de Rictor diminuiu. O mecanismo pelo qual a ativação mTORC1 diminuiu a expressão da proteína de Rictor ainda não está claro e é uma direção futura pesquisa em potencial.

A inibição da função mTORC2 por Rictor knockdown levou à activação de p70S6 cinase, um sinal de mTORC1, diminuiu EpCAM, c-myc, expressão e FOXO3a, e fosforilação de Akt, mas não teve efeito sobre GSK3β e a expressão da proteína de β-catenina. Não ficou claro se p70S6 quinase foi activada directamente por Rictor knockdown, embora seja possível que a ativação mTORC1 e inibição de sinais Akt levou à diminuição da expressão EpCAM. Vários estudos têm sugerido que a inibição da mTORC2, e não mTORC1, suprime a carcinogénese [19,30]. Em outros relatórios, a fosforilação de Akt (Ser473) correlacionou com stemness câncer [31,32]. A pesquisa clínica tem relatado que os pacientes com alta expressão de mRNA Rictor ou EpCAM em câncer de fígado isolado tiveram uma maior taxa de recidiva [33,34].

Neste estudo, os nossos resultados sugerem que o potencial CSC é fortemente associada com sinais mTORC. Além disso, mTORC2 tem um papel na manutenção do potencial de células estaminais enquanto que mTORC1 suprime este potencial (Figura 6).

desnutrição ou baixa relação de Fischer suprimida activação mTORC1 o que levou a um aumento da stemness cancro. Por outro lado, mTORC2 mantém stemness câncer. No entanto, mTORC1 inibe mTORC2. BCAA suprime stemness cancro por ativação de mTORC1, e aumenta os efeitos antitumorais de agentes quimioterápicos.

É possível que a ativação por si só de mTORC1 por tratamento BCAA levou à diminuição da expressão da proteína Rictor, que foi semelhante ao Rictor knockdown, inibindo assim mTORC2 e ativando mTORC1. Estes achados sugerem que mTORC2 pode ser um alvo terapêutico do cancro verdade, especialmente na carcinogénese relacionada com CSC e a activação de mTORC1 sozinho conduz a uma diminuição da EpCAM e c-myc. Assim, recomendamos que novas estratégias de terapia do câncer visam inibir mTORC2 e ativar mTORC1 simultaneamente.

Informações de Apoio

Figura S1.

A imagem representativa de EpCAM positiva de células que foi corado como um método descrito em Materiais Métodos

doi: 10.1371. /Journal.pone.0082346.s001

(TIF)

Figura S2.

A percentagem de células-anexina V positiva (A), o número de células viáveis ​​em relação (B) através de array digitalizar em células Huh7 cultivadas em DMEM contendo FBS a 10%, com ou sem BCAA 4 mM na presença (1 ou 2 ug /ml) ou ausência de 5-FU durante 72 horas usando o protocolo de activação de verificação alvo matriz. Estudante

t

-teste, * p 0,05, ** p 0,01, n = 7, média ± SE

doi:. 10.1371 /journal.pone.0082346.s002

(TIF)

Figura S3. O volume do tumor

no modelo de ratinho de xenoenxerto HAK-1B no 14º dia após a administração de BCAA e injecção de 5-FU. teste de Tukey: * p 0,05, ** p 0,01 vs. controlo, $$ p 0,01 vs. BCAA, n = 6, a média ± SE

doi:. 10.1371 /journal.pone.0082346.s003

(TIF)

Figura S4.

A detecção de um total de P-70S6-quinase na presença de DMEM, tratamento de BCAA, o pré-tratamento com rapamicina (A) e o tratamento de BCAA, ou estimulação LC (B) durante 72 h em Huh7

doi:. 10.1371 /journal.pone.0082346.s004

(TIF)