Abstract

Vários tipos de tumores são sensíveis a desativação de apenas um ou poucos genes que são constantemente ativo nas células cancerosas, um fenômeno que é denominado “vício oncogene ‘. Os fármacos que têm como alvo os produtos desses oncogenes pode produzir um alívio temporário, e até remissão completa. Infelizmente, muitos pacientes que recebem terapias alvo-oncogene recaída no tratamento. Isso muitas vezes acontece devido a mutações somáticas no oncogene ( “mutações de resistência”). “mutações compostos», que, no contexto do cancro da resistência aos fármacos são definidos como dois ou mais mutações do fármaco alvo no mesmo clone pode levar a uma maior resistência contra os inibidores mais selectivos. Aqui, mostra-se que a grande maioria das mutações de resistência que ocorrem em pacientes com cancro tratados com inibidores de tirosina-cinase que visam três proteínas diferentes seguir uma via evolutiva. Usando ferramentas de análise de bioinformática, verifica-se que as mutações de resistência a drogas nos domínios da tirosina quinase de ABL1, ALK e exons 20 e 21 do EGFR favorecer transformações para os resíduos que podem ser identificados em posições semelhantes em proteínas evolutivamente relacionadas. Os resultados demonstram que a pressão evolutiva molda a paisagem mutacional no caso de de resistência a drogas mutações somáticas. As restrições sobre a paisagem mutacional sugere que pode ser possível para contrariar as mutações pontuais individuais de resistência a drogas. A observação de relativamente muitas mutações de resistência em ABL1, mas não nos outros genes, é explicado pelo facto de que as mutações em ABL1 tendem a ser bioquimicamente conservador, enquanto que mutações em EGFR e ALK tendem a ser radical. Análise de mutações compostos ABL1 sugere que tais mutações são mais prevalente do que anteriormente relatados e podem ser mais difíceis de combater. Isto apoia a noção de que essas mutações podem fornecer uma rota de fuga para a resistência à droga contra o câncer alvo

Citation:. Friedman R (2013) Drogas Resistência missense mutações no câncer estão sujeitas a pressões evolucionárias. PLoS ONE 8 (12): e82059. doi: 10.1371 /journal.pone.0082059

editor: Raffaele A. Calogero, Universidade de Torino, Itália |

Recebido: 06 de setembro de 2013; Aceito: 29 de outubro de 2013; Publicação: 20 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ran Friedman. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Centro Universitário Linnaeus for Biomaterials Química. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. O autor já declarou que não existem interesses conflitantes

Introdução

O inibidor da quinase (KI) imatinib é prescrito desde 2001 para pacientes crônicos leucemia mielóide (LMC) [1]. Visando o domínio de tirosina cinase da proteína quimérica anormal BCR /ABL1, imatinib foi a primeira droga bem sucedido do cancro alvo. Na sequência da sua notável sucesso e relativa segurança, KIs adicionais agora são administrados para o tratamento de vários tipos de câncer, e muitos outros estão em desenvolvimento [2]. A especificidade do KIs varia, e alguns medicamentos são usados ​​para tratar vários tipos de cânceres. Imatinib, por exemplo, está registrado na Suécia, não só para o tratamento da LMC, mas também para o cromossoma Filadélfia positivo leucemia linfoblástica aguda (Ph

+ – ALL), várias síndromes de sangue, tumor estromal gastrointestinal (GIST) e dermatofibrossarcoma protuberante (DFSP) . O avanço das técnicas de seqüenciamento de genomas permite a identificação de pacientes que são mais susceptíveis de beneficiar de cuidados direcionados com base no perfil genético dos tumores. Além disso, novos alvos de medicamentos que são distintas das quinases estão sendo procurados. Os exemplos incluem inibidores de farnesiltransferase e antagonistas de proteína de choque térmico.

Infelizmente, muitos pacientes, eventualmente, tornar-se insensível ao tratamento devido a mutações somáticas no domínio de cinase de os alvos de drogas, que impedem que as drogas de inibir as enzimas [3], [4]. O surgimento de “mutações secundárias” tais limita a eficácia de drogas anti-câncer a longo prazo [5]. A descoberta de que mutações de resistência resultar em falha do tratamento levou ao desenvolvimento de segundo (dasatinib, nilotinib) e inibidores terceiros (bosutinibe, ponatinibe) geração ABL1. O mutante ABL1 clinicamente mais notório é T315I, que é resistente a todos KIs exceto ponatinibe (recentemente aprovado em os EUA e UE) e rebastinib (atualmente estudada em ensaios clínicos). Estudos com células Ba /F3, um sistema modelo conveniente para o desenvolvimento de KI, sugerem que a resistência no sentido ponatinibe e rebastinib pode desenvolver-se através de ‘mutações compostos “, ou seja, duas mutações resistentes que ocorrem no mesmo clone de células tumorais [6], [7 ].

não é possível acompanhar o desenvolvimento de mutações de resistência em clones individuais. Isto exigiria que a capacidade de seguir o aparecimento de mutações de forma dinâmica, o que não pode ser conseguido, porque as amostras tem de ser sequenciado, e porque muitas das mutações será inevitavelmente perdido, em vez de fixo na linha de células. Por esta razão, os modelos matemáticos de resistência aos medicamentos em câncer têm sido desenvolvidos e aplicados para estudar a resistência aos medicamentos em diferentes cenários. por exemplo, modificando a dose ou usando vários inibidores [8] – [12]. Esses modelos permitem o teste de várias hipóteses

in silico

, muitas vezes em relação aos achados clínicos, antes de avançar para celular ou estudos clínicos.

Contabilidade para as forças evolutivas que levam à resistência aos medicamentos é importante para o desenvolvimento de novos regimes de tratamento que será menos provável para se obter resistência. Se a paisagem evolutiva é limitado, as pequenas drogas moleculares que têm como alvo os mutantes conhecidos são propensos a ter sucesso. Por outro lado, se o alvo da droga pode adotar mutações adicionais sem uma pressão seletiva significativa, qualquer tratamento alvejado acabará por fracassar. O paradigma actual em estudos de mutações resistentes é que estas mutações ocorrem antes do tratamento. taxas de mutação em genes codificadores de proteínas está na ordem de 10

-9 substituições por ano por site. Mesmo que as taxas de mutação em células cancerosas são maiores por 3-4 ordens de grandeza, é improvável que as mutações desenvolvem-se durante um período de tratamento de vários anos, ao passo que a recaída ocorre muitas vezes dentro de meses. Assim, mutações de resistência deve ser tolerada antes do tratamento. Para este fim, dois cenários são possíveis. Em primeiro lugar, pode-se supor que todas as mutações somáticas de domínio quinase são seletivamente neutro ou ligeiramente prejudicial e, portanto, têm uma probabilidade não negligenciável a fixar na população [13]. Esta suposição pode ser justificada com o argumento de que o oncogene alvo já foi objecto de um “ganho de função” mutação que levam ao seu papel principal no tumor, e é agora relativamente insensíveis a novas mutações. Se isso for verdade, então a única limitação sobre o aparecimento de mutações de resistência é a taxa de substituição. Em contraste, pode-se supor que o oncogene activo tem uma função biológica que pode ser compensada por mutações, e sua paisagem evolutiva é limitada não só pela taxa de mutação, mas também por selecção de purificação. Neste caso, compreender a extensão de selecção pode conduzir ao desenvolvimento de tratamentos que vão ser

a priori

menos sensível a resistência aos medicamentos.

Aqui, eu uso análise bioinformática, a fim de estimar que de estes cenários é mais provável, ou seja, se as mutações de resistência no domínio de cinase são susceptíveis de ser tolerado. Para este fim, analisaram a prevalência de tais mutações em sequências que são homólogas a três tirosina-quinases que são importantes alvos da droga e em que a resistência do fármaco, devido a mutações missense apresenta um problema clínico aguda: epidérmico receptor do factor de crescimento (EGFR), cinase de linfoma anaplásico (ALK) e o domínio de quinase de Abelson da leucemia murina viral oncogene homolog 1 (ABL1).

do receptor do factor de crescimento epidérmico

EGFR é um receptor da superfície celular tirosina quinase (RTK) do família ErbB. expressão elevada de EGFR é observada em cancros de vários órgãos. inibidores de moléculas pequenas de EGFR, tais como gefitinib e erlotinib foram aprovados para o tratamento do cancro do pulmão de células não pequenas, (NSCLC). Estas moléculas são inibidores competitivos da ligação de ATP no local activo do receptor. A presença de várias mutações somáticas no EGFR, que parecem conferir um aumento de actividade de quinase (mutações de activação, também conhecidos como condutor ou mutações sensíveis), tem sido correlacionada com a sensibilidade a inibidores de EGFR [14] – [16]. No entanto, alguns dos doentes tratados com inibidores de cinase tirosina (TKI) não respondem ao tratamento, e apenas cerca de 5% apreciar remissão completa [17]. Em muitos casos, é a falha do tratamento devido a mutações de resistência TKI, que incluem inserções e seis mutações missense diferentes no domínio de tirosina-quinase [17], [18]. T790M é a mais comum destas mutações e confere independência ligando.

anaplásico linfoma cinase

Alk é um RTK que tem sido associado com o neuroblastoma e cancro do pulmão, através de diferentes mecanismos. No cancro do pulmão, a fusão da ALK e Echinoderm microtubule-associated protein-4 como (EML4) conduz à activação constitutiva da quinase [19]. Em neuroblastoma, por outro lado, o aumento da actividade ALK está associada a mutações amplificação do gene ALK, somáticos e da linha germinal [20] – [22]. inibidores ALK estão agora a ser desenvolvido como drogas; o crizotinib TKI está em uso em pacientes com câncer de pulmão que transportam a proteína de fusão EML4-ALK. Infelizmente, as mutações secundárias podem levar a resistência Crizotinibe [23].

ABL1

ABL1 é um proto-oncogene que codifica uma cinase de tirosina. A proteína de fusão BCR-Abl conduz a leucemia mielóide crónica (LMC), que pode ser tratada por TKI. 20 Mutações em Abl foram mostrados para conferir resistência aos fármacos (ou sensibilidade reduzida) a pelo menos um dos três medicamentos comerciais imatinib, dasatinib e nilotinib [24]. Outra meta-análise (ou seja, a análise dos resultados de vários experimentos relatados na literatura) identificou 34 tais mutações com base em

in vitro

estudos [25]. Aparentemente, Bcr-Abl exibe um fenótipo mutante, ou seja, conduz à aquisição de mutações [26]. TKI tratamento aparentemente leva a uma diminuição na frequência de mutação [25], o que indica que as mutações ocorrem principalmente antes do tratamento, ao passo que os clones mutantes tornar-se dominante, como resultado de tratamento de TKI

.

Os resultados revelam que as mutações de resistência a drogas em os domínios de tirosina-quinase de ABL1, ALK e exons 20 e 21 de EGFR favorecer transformações para os resíduos que podem ser encontrados em posições semelhantes em proteínas evolutivamente relacionadas. Assim, demonstra-se que a pressão evolutiva molda a paisagem mutacional no caso de de resistência a drogas mutações somáticas. Análise de mutações compostos revela uma maior proporção de tais mutações que não tenham sido até então observados em sequências relacionadas.

Resultados

crescimento epidérmico do receptor do factor

A resistência ao erlotinib e gefitinib tem sido associada a seis mutações de resistência [17], [18]. Análise de sequências em que o domínio de quinase é homóloga à do EGFR revela que em 4 dos 6 mutações de resistência missense, a mesma variação de aminoácidos é observada em outras sequências de proteínas relacionadas (Tabela 1 e Tabela S1). Estas quatro mutações de resistência são S768I, V769L, e T790M (no exão 20), e T854A (em exon21), enquanto que as duas mutações de resistência que não podem ser observados como SNVS no MSA (L747S e D761Y) estão localizados no exão 19. Esta pode ser explicado pelo exão 19 sendo um ponto quente mutacional, onde as mutações ocorrem em até 45% dos doentes com NSCLC [18]; pode ser que a taxa de mutação no exão 19 é elevada o suficiente para que as mutações surgem durante o tratamento.

Por outro lado, apenas em 5 de 12 mutações de activação são observados no alinhamento de sequências múltiplas (MSA ) de EGFR e proteínas homólogas. Esta descoberta pode ser explicado considerando que as mutações de activação pode ser descrito como “ganho de função ‘mutações. Estas mutações fazer a quinase constitutivamente activa, o que não é desejado fora do contexto do tumor. Por isso, muitos deles não pode ser observada como variações em sequências relacionadas.

Todas as mutações de sentido trocado estudados são devidas à variação de um único nucleótido (SNV), e é possível que um certo SNV é observado no MSA porque todos os possíveis SNVS são cobertos. Neste caso, a probabilidade de identificar esta mutação no MSA é 1. Com efeito, todos os SNVS não sinónimas de Ser768 tenham sido observados no MSA. Por outro lado, uma das seis substituições de aminoácidos possíveis, devido à SNVS não sinónimas na posição 790, apenas dois são observados no MSA: T790A, o que é observado apenas em uma única sequência; e T790M, que é observada em 87 sequências (31%). T790M é a mutação de resistência EGFR mais predominante [18]. Thr790 é chamado o resíduo gatekeeper de EGFR, porque está localizado na entrada para um bolso hidrofóbico KI onde se ligam, tornando-se importante para KI selectividade. A resistência KI devido à mutação T790M tinham, portanto, sido sugerido para ser devido a choques com estéricos Kis ligado. No entanto, foi descoberto mais tarde que os mutantes T790M são capazes de se ligar KIs, mas permanecer activa devido ao aumento da afinidade para o ATP [27]. A prevalência de Met na mesma posição como resíduo 790 nos homólogos MSA de EGFR está em linha com este achado. Como Thr790, Thr854 resíduo pode ser mutada para seis outros resíduos através SNVS, mas apenas três de tais alterações são observados: T854A (146 sequências, 52%), T854I (uma sequência) e T854S (51 sequências, 18%). Neste caso, a mutação pode efectivamente impedir a ligação da droga [28]. Ao contrário do T854A mutação radical, T854S é uma mutação conservador, e provavelmente não levaria a resistência aos medicamentos. T854I só está presente em uma seqüência. As outras mutações possíveis T854K, T854P, e T854R pode conduzir a resistência aos fármacos mas não são encontrados no MSA em tudo, o que sugere que eles são seleccionados contra mesmo se eles emergem.

A análise adicional da probabilidade de observar um dada resíduo no domínio de cinase pode ser obtido a partir do banco de dados de domínio conservado (CDD) [29], ncbi.nlm.nih.gov/cdd. O banco de dados Conservada Domínio é um recurso para a anotação de unidades funcionais em proteínas. Entre outros dados, que retrata a probabilidade de encontrar cada um dos 20 nucleótidos comum aminoácidos codificados em qualquer posição do alinhamento como uma pontuação baseada log2 posição específica matriz de pontuação (PSSM). Quanto maior a pontuação PSSM, o mais conservado é o resíduo na posição designada. Ao examinar as posições dos mutantes de resistência em EGFR verifica-se que Leu747, Asp761 e Ser768 são mutados para resíduos que são menos prováveis ​​de acordo com o domínio conservado. Por outro lado, Val769, Thr790 e Thr854 são mutados para resíduos que são mais comuns nas DDC. As mutações de activação mais comum (condutor) missense, G719A /C /S e L858R, não estão presentes no MSA, e a variante resultante é estimada como sendo muito menos comuns do que o peso no domínio TK conservada (Tabela S1). Na verdade, em apenas duas mutações de activação do mutante é mais comum no domínio conservado do que a percentagem em peso, e em ambos os casos (L861Q e G863D) a pontuação posição específica é 0, indicando que o resíduo não é conservada em peso. Isto está de acordo com o ponto de vista de que estas mutações conduzem a ganho de função.

quinase de linfoma anaplásico

De acordo com a nossa análise, cinco dos seis mutantes resistentes e Crizotinibe todos 11 mutações ALK-missense associada neuroblastoma levar a um resíduo que pode ser observado em proteínas relacionadas na mesma posição (na diferença marcante com mutações condutoras em EGFR). Todas as mutações associadas ao neuroblastoma envolver uma mudança a partir de um resíduo que é altamente conservada na CDD para uma que é incomum (Tabela S2), que é também o caso de três das seis mutações de resistência. Aparentemente, ambos resistência e mutações ativadoras em ALK estão sujeitos a restrições evolutivas que reduzem a paisagem mutacional.

Bcr-Abl

mutações individuais.

Eu analisei 43 ABL1 mutações transportadas por pacientes com LMC, onde a resistência aos medicamentos era evidente

in vitro

. Surpreendentemente, nenhum dos 43 SNVS é nova, isto é, variações do mesmo tipo são evidentes em proteínas associadas (Tabela 1 e Tabela S3), e em todos menos dois casos, os alteração resulta em um resíduo que é menos conservada no CDD ( na L387F e L387M o mutante tem uma pontuação de conservação similar), o que pode indicar pressão seletiva.

mutações compostos.

recentemente, Khorashad e colaboradores identificaram um conjunto de mutações duplas em pacientes com LMC tratados com TKI [30]. Cerca de 70% dessas mutações eram mutações compostos, em que os dois mutantes surgem no mesmo clone de células cancerosas. Algumas destas mutações compostos presumivelmente contribuir para o aumento de resistência a drogas. É interessante examinar as mutações compostos a partir de um ponto de vista evolutivo. A análise das mutações compostos relatados 21 [30], revela que cinco são completamente nova, isto é, uma (duas vezes) semelhante variação não pode ser observado em qualquer uma das sequências homólogas de 1282 a ABL1 (Figura 1 e Tabela S4). Alguns dos outros 16 variações são bastante comuns. Por exemplo, a resistência múltipla a droga mutante T315I foi observada no mesmo clone com M244V, G250E, E255K, F311L, F359V, F359C, L387M ou H396R. 56% das sequências que, de acordo com o MSA, tem isoleucina na posição correspondente ao resíduo 315 de ABL1, também têm lisina na posição correspondente ao resíduo 255 – ou seja, que se alinham com a mutação composto T315I /E255K (Figura 1, inferior). Note que a ordem de ocorrência de mutações pode ser importante, uma vez que apenas 8% das sequências que correspondem ao transporte E255K isoleucina na posição correspondente a T315 em ABL1 (em comparação com 56% no caso T315I é considerado em primeiro lugar). Curiosamente, quando se examina todas as possíveis combinações dos mutantes resistentes 43 (veja folha de dados S8) observamos sete variações que são sempre observados juntos em sequências naturais: (K247N /F317L, E292V /F311I, E292V /F359I, Y253F /T315A, Y253F /F317I, T351A /V379I e Y253F /H375P). Estas mutações não foram relatados até à data, mas esta pode ser devida à falta de sensibilidade na sequenciação e o pequeno número de pacientes que foram rastreados. métodos de sequenciação melhores [31] são susceptíveis de revelar mutações compostos adicionais em ABL1 e outros alvos de drogas câncer.

(Top) mutações compostos são duplos mutantes que surgem no mesmo clone e são detectados em pacientes tratados. Usando MSA da proteína ABL1, sequências em que uma das mutações identificadas é observado como uma variação foram identificados relacionados. Cada sequência foi em seguida analisada a fim de determinar se qualquer uma das outras variações é observado juntamente com a primeira variante. Os resultados desta análise são apresentados aqui como percentagem. Por exemplo, 50% das sequências em que um resíduo His está localizado numa posição que é o mesmo que Tyr253 de ABL1 (correspondente à mutação Y253H) o resíduo que corresponde à posição 250 é Glu (similar ao mutante G250E). Note-se que a matriz não é simétrica. Tomando o mesmo exemplo, apenas 0,8% das sequências quando Glu está localizado na posição correspondendo a Gly250 em ABL1 (G250E) também possuem Sua na posição correspondente ao Tyr253. Esta diferença resulta da relativa raridade da mutação Y250H (0,3%, Tabela S3) e a abundância relativa da mutação G250E (21%). mutações composto identificado pelo Khorashad e colegas de trabalho [30] são mostrados dentro de um quadro em negrito. mutantes Só duplos, onde ambas as mutações individuais são conhecidos por conferir resistência a drogas são analisados, e apenas os resíduos que estão envolvidos nas mutações compostos relatados por Khorashad

et al

são exibidos aqui.; Para uma lista completa, veja folha de dados S8. 102 de 240 possíveis mutações não são observados no MSA. As células da matriz são coloridas de acordo com a abundância da variação condicional: menos do que 10%, branco; 10-19%, amarelo; 19-50%, cor de laranja; mais de 50%, vermelho. Alinhamento de sequências (Inferior) entre ABL1 humana e STK10 humano. Parte do alinhamento par a par entre ABL1 humana e STK10 humana com a localização dos resíduos de ABL1 Glu255 e Thr315 indicado (rectângulos vermelhos). O alinhamento para STK10 humana é dada como um exemplo, para esclarecer os resultados apresentados acima. Os dois resíduos de lisina e alinhar com isoleucina, respectivamente, correspondendo à mutação composto E255K /T315I. 56% das sequências que, de acordo com o MSA, tem isoleucina na posição correspondente ao resíduo 315 de ABL1, também têm lisina na posição correspondente ao resíduo 255.

Discussão

a maioria das mutações de resistência não são novos

Análise dos SNVS que conduzem a resistência a drogas em EGFR, ALK e ABL1 revela que, na grande maioria destes SNVS não sinónimas (52 de 55, Tabela 1), um determinado resíduo é modificado para uma que pode ser observada em sequências homólogas. Isto pode indicar que as mutações de resistência são sujeitos a selecção de purificação, em certa medida. Caso contrário, seria de esperar que novas mutações será mais prevalente.

mutações ativadoras tendem a favorecer uma mudança para um resíduo menos conservada

Quando se trata de mutações ativadoras, há uma diferença marcante entre as proteínas. No EGFR, a maioria das mutações são novos, o que está de acordo com eles, sendo as mutações de ganho-de-função. Em ALK, as mutações não são novos. Em ambos os casos, no entanto, a análise dos domínios conservados revela que a nova variante é quase sempre menos conservada dentro do domínio (Tabelas S1 e S2). Isto está em linha com a hipótese de que tais mutações envolvem ganho de função.

Variabilidade dos resíduos mutados

Nos três proteínas pesquisadas aqui, algumas posições não têm limitações evolutivas para SNVS, ao passo que outras posições são restritas. Por exemplo, seis SNVS não sinónimas são possíveis ao nível da proteína para Ser768 do EGFR. Todos estes são observados em sequências homólogas a EGFR na posição 768 (em que a mutação de Ser para Ile confere resistência à droga). Por outro lado, a treonina na posição 790 da sequência mesmo só pode ser mutada para alanina ou metionina, e o último é observado apenas em uma sequência. Pode concluir-se que, no primeiro caso, a descoberta de que a mutação de resistência já é observado na evolução é meramente uma coincidência: depois de tudo, todos os SNVS são possíveis; ao passo que no segundo caso, é significativo de um ponto de vista evolutivo. Uma explicação alternativa é de que todas as variações de posição 768 são possíveis porque não conduzem a uma redução significativa na actividade biológica da proteína. Este raciocínio é plausível com base em teorias evolutivas, [33] [32]. Para este fim, a proporção de

todas SNVS não sinónimas

que ocorrem nas três sequências deve ser considerado, e pode ser comparado com a proporção de mutações de resistência em que SNVS não sinónimas são observados no MSA. Se SNVS não sinónimas que levam a mutações resistentes estão sujeitos apenas à restrição de que eles levam a resistência aos medicamentos e são de outra maneira evolutiva neutra, seria de esperar que os SNVS correspondentes cair fora da MSA, que descreve proteínas evolutivamente relacionadas. Se, por outro lado, estas SNVS estão sujeitos a restrições evolutivos, a vasta maioria de tais SNVS deve corresponder a resíduos que também podem ser identificadas em outras proteínas. Como mostrado na Tabela 2, na ausência de quaisquer restrições evolutivas, 1508 SNVS não sinónimas

poderia ser

observado para o domínio de cinase de EGFR. Os 1038 SNVS que

são

observados são 31% menos do que aqueles possível. Apenas 5% das mutações de resistência envolvem SNVS que não são observados no domínio de cinase – muito menos do que 31%, como seria esperado para SNVS aleatórios. Esta é uma forte indicação de que mutações de resistência estão sujeitos a restrições evolutivas. O valor esperado para obter o mesmo número de mutações de resistência observado em aleatório (ou seja, que 52 dos 55 mutações de resistência são observados no MSA devido ao acaso, assumindo que todas as SNVS não sinónimas são igualmente provável) é 5.6E-05 .

Preservação dos resíduos mutados ao nível da proteína

Dado que mutações de resistência, ao contrário de mutações condutoras, não deve interferir com a actividade biológica da proteína, pode-se supor que evolutiva resíduos conservados terá uma menor tendência para ser afectado (note que a conservação dos resíduos ao nível da proteína é diferente do que a sua probabilidade de ser observado no CDD e é não só uma função do número de possíveis alternâncias [32]). No entanto, a análise de conservação evolutiva no nível de resíduos de proteína [34] – [36] revela que os resíduos mutados são relativamente conservadas (Figura 2, Tabelas S5, S6, S7). Isto pode ser explicado pelo raciocínio de que estes resíduos estão localizados no local de ligação do substrato, afectar a sua estrutura ou modificar dinâmica conformacional da proteína; caso contrário, as mutações não pode conduzir a resistência aos fármacos. As grandes diferenças entre os resíduos individuais são observadas, no entanto. Alguns resíduos são altamente conservadas (por exemplo, os resíduos de gatekeeper Thr854 em EGFR, Leu1196 em ALK e Thr315 em ABL1), enquanto outras são um tanto variável. Curiosamente, a variabilidade pontuação média é maior para as mutações de activação em EGFR e ALK do que para as mutações resistentes, indicando que a mutação de um resíduo conservado é mais provável para produzir um mutante de resistência a drogas. Este achado é um tanto contra-intuitiva porque são esperadas mutações condutoras para se obter funções que são importantes para o crescimento do tumor ou proliferação [37], e é, por conseguinte, razoável esperar que eles tendem a ocorrer em locais conservados e não será tão sensíveis à restrições evolutivas.

as estruturas de EGFR [68] ALK [69], e ABL1 [70] são mostrados em uma representação fita, cor de acordo com a conservação evolutiva no nível de resíduos. Coloração é na escala BWR, isto é, resíduos altamente conservados são mostrados em azul escuro, moderadamente conservados em azul claro, levemente conservada ou levemente variável de branco, moderadamente variável no rosa e altamente variável em vermelho. Resíduos sempre que mutações levam à resistência aos medicamentos são representados por esferas e indicou (apenas para EGFR e ALK, note que EGFR resíduo Leu747 não foi resolvido na estrutura de raios-X e não é exibido).

Dada que, de modo geral, as mutações de resistência ocorrem em locais conservados, como é a proteína capaz de manter a sua função? Uma possível explicação é que as mutações de resistência são conservativas, isto é, eles envolvem modificações de resíduos de aminoácidos que não alteram as suas propriedades bioquímicas. quantificação empírica da distância bioquímica entre os resíduos foi sugerido por Grantham [38], que inventou uma métrica conhecida como a ‘Grantham distância “. O mais radical a substituição, quanto maior é a distância Grantham. Assim, a distância entre Grantham isoleucina e leucina é 5, enquanto que a cisteína e fenilalanina são 205 unidades Grantham longe um do outro. A distância média é Grantham 100, que corresponde à diferença entre bioquímica fenilalanina e histidina, indicando que a maioria das alternâncias possíveis são radicais em vez de conservador. O exame das distâncias Grantham (Tabela S5, S6 tabela e Tabela S7) revela que as mutações tanto radicais e conservadoras são observados. A distância média Grantham, no entanto, é maior do que para as mutações de resistência para activação de mutações em EGFR e ALK. Curiosamente, a distância média Grantham para mutações de resistência em ABL1 é bastante pequena (51). Isso indica que mudanças relativamente pequenas no sítio de ligação já levar à resistência aos medicamentos, e explica por que a resistência aos medicamentos devido a mutações pontuais é tão comum na CML.

As mutações de resistência estão sujeitos a restrições evolutiva

análise bioinformática de mutações de resistência em EGFR, ALK e ABL1 revela que, embora muitos SNVS não sinónimas são possíveis, algumas das mutações de resistência são novos no sentido de que variações semelhantes não foram observados na evolução. Isto limita o número potencial de SNVS por 19-35%, dependendo da proteína (Tabela 2). Outra limitação vem do facto de mutações de resistência são mais prováveis ​​de ocorrer em resíduos conservados, embora eles também podem envolver-resíduos conservados suavemente. Comparação entre as mutações resistentes e de activação em EGFR e ALK indica que as mutações resistentes são mais susceptíveis de ser radical a partir de um ponto de vista bioquímico. Isto pode ter implicações, por exemplo, quando genomas inteiros de pacientes com câncer tratados são analisados ​​para mutações desconhecidas e há uma necessidade de separar entre as mutações motorista, mutações de passageiros e mutações de resistência.

mutações compostos

Composto mutações que conduzem a resistência a drogas envolvem, tipicamente, uma combinação de duas mutações de resistência individuais que em conjunto levam a uma melhor resistência ao fármaco e podem resultar na recidiva ao longo do tratamento. A análise de mutações compostos levam a duas conclusões. Em primeiro lugar, 24% das mutações compostos conhecidos não são observadas

em conjunto

em qualquer homólogo ABL1, enquanto que foram observadas todas as mutações individuais. Isto pode indicar que múltiplas mutações que não prejudiquem significativamente a função da enzima não estão sujeitos a pressão evolutiva adicional que iria impedir a sua acumulação. Alternativamente, a acumulação de múltiplas mutações pode ser um pouco prejudicial o que não impede que eles sejam fixos [39]. Em segundo lugar, várias alternâncias parecem ocorrer em conjunto em sequências homólogas, mas, até agora, não foram identificadas em pacientes, quer devido a limitações experimentais, tamanhos de amostra pequenos, ou porque são menos benéfica para a resistência. Ambas as descobertas sugerem que as mutações de resistência composto adicional será relatado no futuro, em ABL1 e de outros genes, e será difícil de atingir. Além disso, as mutações compostos têm recentemente sido observado também no contexto da activação de mutações de EGFR [40], [41], indicando ainda que tais mutações deve ser esperada em outros genes.

nossa compreensão da evolução do cancro está a tornar-se melhor devido a melhores métodos de sequenciação [42], novas ferramentas de análise para redes do gene do cancro [43] e desenvolvimento de modelos evolutivos [44] – [47].