Abstract
Fundo
quimioterapia à base de platina é uma estratégia padrão para cancro do pulmão de não pequenas (NSCLC), enquanto quimiorresistência permanece um desafio terapêutico na prática clínica corrente. Nosso objetivo deste estudo foi determinar se a inibição da via NF-kB /miR-21 /PTEN poderia aumentar a sensibilidade das NSCLC à cisplatina.
Métodos
A expressão de miR-21 em NSCLC tecidos foi determinada utilizando hibridação in situ. Em seguida, o efeito de miR-21 sobre a sensibilidade das células A549 a cisplatina foi determinada in vitro. Se o miR-21 PTEN expressão regulada foi avaliada pelo ensaio de luciferase. Além disso, se o NF-kB seus elementos de ligação alvo no promotor do gene miR-21 foi determinada por ensaio de luciferase e chip. Finalmente, medimos a viabilidade celular e apoptose sob tratamento com cisplatina, quando NF-kB foi inibida.
Resultados
Um nível elevado de miR-21 foi observada em tecidos do pulmão NSCLC e foi relacionado a um curto tempo de sobrevivência. Exógeno miR-21 promoveu a sobrevivência das células quando expostas a cisplatina, enquanto que a inibição de miR-21 poderia inverter este processo. Os níveis de proteína e ARN de PTEN foram significativamente diminuído por exógeno miR-21, e a região 3 ‘não traduzida de PTEN foi demonstrado ser um alvo de miR-21. A expressão de miR-21 foi regulada por NF-kB da ligação ao seu elemento no promotor, uma constatação que foi verificado pelo ensaio de luciferase e chip. Assim, a inibição da NF-kB pelo silenciamento RNA protege as células contra a cisplatina via diminuindo miR-21 expressão.
Conclusão
A modulação do /miR-21 via /PTEN NF-kB em NSCLC mostrou que a inibição desta via pode aumentar a sensibilidade cisplatina
citação:. Yang Z, fang S, Di Y, Ying W, Y Tan, Gu W (2015) Modulação de NF-kB /miR-21 /PTEN pathway sensibiliza Non-Small Cell Lung Cancer a cisplatina. PLoS ONE 10 (3): e0121547. doi: 10.1371 /journal.pone.0121547
Editor do Academic: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, França |
Recebido: 14 Outubro, 2014; Aceito: 02 de fevereiro de 2015; Publicação: 23 de março de 2015
Direitos de autor: © 2015 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo Programa de Departamento de Saúde de Jiangsu (H201341). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), compreendendo carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma e grande carcinoma indiferenciado de células, é o tipo mais comum de câncer de pulmão [1,2]. A genética desempenha um papel essencial no mecanismo fisiopatológico da NSCLC [3,4], e isso leva a não-sensibilidade de CPNPC à quimioterapia à base de platina [5], resultando em NSCLC sendo a causa mais comum de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo [ ,,,0],1]. Assim, é necessário desenvolver novos alvos de fármacos baseados em genética molecular.
MicroRNAs (miARN) têm sido implicadas como moduladores chave de múltiplos genes alvo através da interferência endógena máquinas ARN [6]. Contribuem para a biologia do cancro através da alteração da expressão dos genes-alvo [7]. miR-21 é um tipo de miARN que funciona como um modulador potente do comportamento das células do tumor e transformação maligna [8]. Verificou-se para aumentar o crescimento celular em cancro do fígado e demonstrou propriedades anti-apoptóticas em glioblastoma [9]. Em NSCLC, o miR-21 também desempenha um papel fundamental na proliferação celular, invasão e apoptose [10]. Estudos anteriores demonstraram que o miR-21 regula a expressão de fosfatase e tensina homólogo (
PTEN
) através de direccionamento directamente sua extremidade 3 ‘não traduzida (3’UTR) [8].
PTEN, um gene supressor de tumor, desempenha um papel essencial na regulação do ciclo celular, apoptose e formação de muitos tipos de tumores sólidos, incluindo NSCLC [10]. Ela regula negativamente os níveis intracelulares de fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PI3K) em células e funciona como um supressor de tumor, que regula negativamente por a via de sinalização de Akt [11]. Sob condições normais, a expressão e activação de
PTEN
é rigorosamente controlada, ao passo que as expressões de miARNs estão desreguladas em NSCLC. Alteração do
miR-21 /PTEN
foi encontrada em pacientes com NSCLC com resistência gefitinib [12].
Dado o papel essencial da via miR-21 /PTEN em NSCLC, resta uma pergunta a respeito de porque a expressão de
miR-21
é aumentada em NSCLC. Foi realizada uma pesquisa de bioinformática (https://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promo.cgi) e encontrou quatro elementos de ligação de NF-kB no promotor do
miR-21
gene. Além disso, um grupo de pesquisa demonstrou que os danos ao DNA induzidos
miR-21
regulação positiva e promoveu a invasão de células do cancro da mama de uma forma NF-kB-dependente [13]. Por isso, assumimos que o NF-kB aumentou o nível de
miR-21
, o que reduziu
PTEN
expressão pós-transcricional para promover a sobrevivência celular sob tratamento com cisplatina em NSCLC; Portanto, a inibição da via de NF-kB /miR-21 /PTEN pode ser um potencial alvo da droga para o NSCLC.
Métodos
Tissue microarrays
micromatriz de tecido (TMA) foi preparado a partir de tecidos derivados de 34 pacientes com NSCLC e 10 pacientes sem NSCLC entre janeiro de 1999 e agosto de 2007. o estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsínquia (1989) e foi aprovado pelo Comitê de Ética local (Nanjing primeiro Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing, China). consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente. A área representativa foi cuidadosamente seleccionado a partir de um hematoxilina e eosina (HE) -stained secção, e em seguida, um núcleo de tecido de 1,5 milímetros foi obtido a partir dos correspondentes blocos de parafina. Depois disso, o material embebido em parafina foi cortada em secções de 5 | iM e colocada sobre uma lâmina, seguido por coloração com HE ou hibridação in situ (ISH). As secções foram observadas ao microscópio óptico (Olympus, Japão). NSCLC foi diagnosticado por dois patologistas independentes de acordo com a União Internacional de sistema de classificação de Controle do Câncer (UICC), 7ª edição. A intensidade da coloração foi pontuada como se segue: 0, sem coloração de células; 1, coloração fraca; e 2, de coloração forte. A percentagem de células coradas foi classificada utilizando uma escala de 3 graus: 0, não há células positivas; 1, 50% de células positivas; e 2, . células positivas 50%
ISH
ISH de
miR-21
foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (MK10013, Boster, China). Resumidamente, após desparafinização de lâminas em xileno e etanol, as lâminas foram incubadas com 3% H
2O
2 durante 10 min à temperatura ambiente e, em seguida, digerido com pepsina durante 10 min a 37 ° C. Depois de enxaguar em água, as lâminas foram fixadas com 1% de PFA em DEPC (Generay, China) durante 10 min. As secções foram então lavadas em água três vezes e incubadas com tampão de pré-hibridação durante 4 h a 42 ° C e tampão de hibridação durante a noite a 42 ° C com uma sonda de miR-21 (5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3 ‘). As lâminas foram lavadas como se segue: 2 x SSC durante 5 min a 37 ° C, duas vezes; 0,5 × SSC durante 15 min a 37 ° C, uma vez; e 0,2 × SSC durante 15 min a 37 ° C, uma vez. O tecido foi incubado em tampão de bloqueio a 37 ° C durante 30 min e, em seguida, foi incubada com o complexo de estreptavidina-biotina (SABC). Após lavagem três vezes com PBS, as lâminas foram incubadas com conjugado de peroxidase de rábano de polímero por mais 30 min à temperatura ambiente. Subsequentemente, eles foram coradas com 3,3-diaminobenzidina e contrastadas com hematoxilina (Sigma-Aldrich, EUA).
cultura celular
HEK293 células e células A549 foram cultivadas e mantidas em Dulbecco modificado Eagle meio (DMEM, Invitrogen, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco, EUA), penicilina 100 U /ml e estreptomicina 100 ug /ml (Gibco).
Construção de plasmídeo recombinante e lentivírus
o humana
NF-kB
fragmento (p65) do gene amplificado por PCR foi clonado em pcDNA3 e a inserção foi confirmada por sequenciação. Em seguida, o plasmídeo pcDNA-NF-kB foi digerido com EcoRI /Xbal. Os produtos digeridos foram sujeitos a electroforese num gel de agarose. O
NF-kB
fragmento do gene foi purificado por extração de gel e subsequentemente clonado em pLVX-IRWS-ZsGreen1. Um construto shRNA segmentação de NF-kB também foi clonado em pLVX-IRWS-ZsGreen1. lentivírus recombinantes Lenti-shNF-kB e Lenti-NF-kB foram produzidos e titulada de acordo com um relatório anterior [14]. Toda a estrutura de leitura aberta de
PTEN
com ou sem o
miR-21
sequência de direccionamento na 3 ‘UTR foi clonado no vector pcCS2 com um marcador myc para construir pcCS2-3-PTEN ‘UTR e pcCS2-PTEN, respectivamente.
A transfecção de
miR-21
imita e inibidor
Os 2′-O-Me-oligonucleótidos modificados-FAM foram sintetizados quimicamente e purificou-se por cromatografia líquida de alta eficiência (GenePharma, China). A 2′-O-Me-miR-21 mímico foi composta de duplexes de ARN com a sequência seguinte: 5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3 ‘; as sequências de 2′-O-Me-miR-21 inibidor e oligonucleótidos 2′-O-Me-mexidos foram como se segue: 5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3 ‘; e 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 ‘. As células foram semeadas numa placa de 24 poços a uma densidade de 5 x 10
4 células por poço e cultivadas a 80% de confluência. Os imitadores de inibidor de miR-21 ou o miR-21 a uma concentração de 50 nM de cada foi transfectado em células utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, EUA), por incubação em meio Opti-MEM I (Invitrogen) durante 4 h. As células foram então transferidas para meio de cultura fresco. Após incubação durante 24 h, o meio de cultura foi substituído e as imagens fluorescentes foram adquiridas para monitorar a eficácia de transfecção. Após 48 h, as células foram colhidas para análise.
-PCR em tempo real
O ARN total foi isolado a partir de células utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) seguindo as recomendações do fabricante. Para
miR-21
qRT-PCR, o ARN total foi transcrito de forma inversa utilizando um iniciador específico do miARN e o kit miScript Transcrição Reversa (Qiagen, Alemanha). Haste-laçada qRT-PCR foi realizada utilizando o SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. A expressão relativa foi avaliada pelo método comparativo Ct e normalizadas para a expressão de ARN nuclear pequeno U6. Para a detecção de
PTEN
, transcrição reversa foi realizada utilizando o kit de síntese de ADNc de primeira cadeia (Promega, EUA) seguindo as recomendações do fabricante. qRT-PCR foi realizado usando o kit de QuantiFast SYBR Green PCR (Qiagen). O
GAPDH
nível de mRNA foi utilizado como um controlo interno. Todas as amostras foram analisadas em triplicado, em três experiências independentes. Reações sem cDNA foram utilizados como controle sem modelo, e não-RT controles também foram criados para excluir a contaminação do DNA genômico. A quantificação relativa da expressão de ARNm foi determinada usando o método comparativo Ct.
Western Blotting
As células foram homogeneizadas em tampão de RIPA (Cell Signaling-Tech., EUA). As concentrações de proteína foram determinadas usando um kit BCA (Beyotime, China). Quantidades iguais de proteína foram separados em SDS-PAGE e depois transferida para 0,45 uM membranas de PVDF (Bio-Rad, EUA). As membranas foram bloqueadas em 5% de albumina de soro bovino (BSA) em soro fisiológico tamponado com Tris com Tween 20 (TBST) durante 2 h e, em seguida, incubadas durante a noite a 4 ° C com os seguintes anticorpos primários: anti-PTEN (1: 1000, tech. sinalização celular), anti-Akt total (1: 1000, Abcam), anti-fósforo Ser473 Akt (1: 1000, Abcam) e anti-GAPDH (1: 1000, Cell tech-sinalização), que serviu como. um controlo de carga. Em seguida, as membranas foram lavadas três vezes com TBST e incubadas com o anticorpo secundário de rábano silvestre conjugado com peroxidase (IgG de cabra anti-coelho (1: 5000) ou de cabra anti-IgG de ratinho (1:. 5000); Cell Tech-sinalização) para dois h à temperatura ambiente. As manchas foram desenvolvidas utilizando um kit de quimioluminescência (Millipore, EUA) e exposto a filme de raios-X. As bandas sobre o filme foram escaneados e analisados utilizando Imagem J.
luciferase vector construção
O humano
PTEN
3’UTR contendo a sequência de semente da
miR -21
sítios de ligação foi amplificado por PCR e foi clonado no vector PMIR-REPORT (Ambion, EUA) entre os locais HindIII e SpeI para desenvolver o vector de luciferase PMIR-PTEN-3′-UTR. sequências de sementes foram mutado por PCR de extensão de sobreposição. O fragmento de PTEN-3′-UTR mutado foi clonado no vector PMIR-REPORT para desenvolver o-3′-UTR-PMIR-PTEN mut vetor. Uma série de construções repórter com o mesmo terminal 3 ‘mas diferente terminal 5’ do promotor de miR-21 foram amplificados por PCR. Todos os produtos de PCR foram clonados no plasmídeo pGL4-Mínimo (Promega) para gerar pGL4-miR-21. O sítio mutante foi introduzido no plasmídeo por extensão de sobreposição PCR. O produto de PCR foi clonado subsequente para gerar pGL4-MUT-miR-21. Todas as construções foram confirmadas por sequenciação de ADN.
A actividade de luciferase
células a uma densidade de 2 × 10
5 por poço foram semeadas em placas de 24 poços e cultivadas durante a noite. Para o ensaio
miR-21
, as células foram co-transfectadas com 0,8 ug de PMIR-PTEN-3′-UTR ou PMIR-PTEN-MUT-3′-UTR, 50 nM de miR-21 mímica ou inibidor ou mexidos oligonucleótido juntamente com 50 ng de vector pRL-TK como um controlo interno utilizando Lipofectamina 2000 reagente (Invitrogen). Para o ensaio de promotor, as células foram co-transf ectadas com 1 ^ g de pcNF-kB ou pcDNA, 20 ng de um plasmídeo repórter de luciferase e 10 ng do plasmídeo repórter de luciferase de Renilla (Promega). Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram colhidas e a actividade de luciferase foi determinada utilizando um ensaio de repórter de luciferase duplo (Promega, EUA). Os resultados foram expressos como a actividade de luciferase relativa como relatado anteriormente [15]. Todas as experiências foram repetidas três vezes em triplicado.
ensaio ChIP
O ensaio ChIP foi realizada utilizando o kit Magna ChIP A /G (Millipore) de acordo com a recomendação do fabricante. Resumidamente, as células A549 foram reticuladas com formaldeído a 1% (Sigma-Aldrich) durante 10 min e extinta pela glicina. As células reticuladas foram recolhidas em PBS frio e sonicada durante seis 15-S pulsos a intervalos de 50 s para reduzir o tamanho total do ADN de 200-1000 pb. A cromatina tosquiada e pérolas magnéticas foram imunoprecipitados com anticorpo anti-NF-kB (ab7970; Abcam, EUA) ou de IgG de coelho normal durante a noite a 4 ° C num rotor. complexos de talão-anticorpo-cromatina magnéticas foram lavadas uma vez com um tampão de baixo teor de sal, seguida sequencialmente pela alta sal, LiCl e TE buffers. Os complexos de cromatina foram eluidas e incubadas a 62 ° C durante 2 h. As amostras de DNA foram recuperados utilizando colunas de centrifugação. Para amostras de aparas, PCR em tempo real foi realizado utilizando o método de SYBR como descrito acima.
3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) brometo (MTT) -2,5-difeniltetrazólio
As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5000 células por poço. Após 24 h, as células foram transfectadas com 100 nM de miR-21 mímico, miR-21 ou inibidor oligonucleótido mexidos. Para as experiências de combinação com o miR-21 mímico e pcDNA-PTEN, as células foram co-transfectadas com pcDNA-PTEN (0,2 ug). O meio foi substituído com meio completo fresco, com ou sem cisplatina (5 uM), às 24 h pós-transfecção de acordo com um relatório anterior [16]. Após um adicional de 24 h, 20 pi de 5 mg /ml de MTT (tetrazólio difenil dimetil tiazolilo; Sigma-Aldrich) foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 4 h numa incubadora humidif içada. O sobrenadante foi em seguida descartado, e 200 mL de DMSO foi adicionado a cada cavidade para dissolver o formazano. A densidade óptica (OD) foi medida a 490 nm. A viabilidade das células, sem qualquer tratamento foi definida como 100%, e a viabilidade de outros grupos foi calculada separadamente a partir das células que sham.
Estatísticas
variáveis contínuas foram apresentados como a média ± SD e determinado pela análise de variância (ANOVA) seguido de um post-hoc
t
-test usando SPSS 13.0. A associação entre a taxa de sobrevivência e
miR-21
expressão foi determinada usando análise de regressão logística múltipla, incluindo os seguintes fatores: idade, sexo, fumantes e histologia. A análise de Kaplan-Meier foi utilizado para avaliar a taxa de sobrevida livre de eventos e da permeabilidade primária. A significância estatística foi definida como um
P
valor inferior a 0,05.
Resultados
miR-21
é abundante nos tecidos do pulmão NSCLC
tecidos pulmonares de 34 pacientes com NSCLC e 10 pacientes sem NSCLC foram usados para fazer o TMA. As características clínicas dos pacientes são mostradas na Tabela 1. A expressão de
miR-21 foi detectado por
ISH. A intensidade de
miR-21
coloração foi significativamente aumentado nas células NSCLC. A pontuação foi significativamente aumentada em pacientes com NSCLC (Fig 1A e B;.
P Art 0,05). Além disso, o tempo de sobrevivência foi reduzida em pacientes com NSCLC que tinham um alto nível de
miR-21
em comparação com aqueles que tinham um baixo nível de
miR-21
(Fig 1C;.
P
. 0,05)
(a) ISH foi utilizado para detectar o miR-21 em uma TMA com NSCLC 34 e 10 amostras de pulmão normal. Painel esquerdo foi ISH e painel direito foi coloração HE. (B) A pontuação intensidade da coloração foi maior em pacientes com NSCLC em comparação com indivíduos normais. (C) O tempo de sobrevida de pacientes com alto nível de miR-21 foi menor do que com o baixo nível de miR-21. *
P Art 0,05 diferença tão significativa
miR-21
modula a sobrevivência de células A549
O
miR-21
imita foram usados para representar exógena
miR-21
, eo
miR-21
inibidor foi utilizada para inibir endógena
miR-21
. O nível de
miR-21
nas células A549 foi detectado por PCR em tempo real (Fig. 2B). Em seguida, utilizou-se o ensaio de MTT para avaliar a viabilidade celular de células A549 quando expostos a tratamento com cisplatina. Como mostrado na Fig. 2C, a viabilidade celular foi significativamente aumentado nas células tratadas por
miR-21 imita
em comparação com o grupo de controlo. A inibição de
miR-21
pelo seu inibidor diminuiu a viabilidade celular em comparação com o grupo de controlo.
As células de controlo, em miR-21 imita e miR-21 inibidor foram transfectadas com 100 nM mexidos oligonucleótido, o miR-21 mímico e inibidor de miR-21, respectivamente. (A) do eixo do tempo da experiência. O oligonucleótido mexidos, miR-21 mímica ou inibidor foi dado 4H antes do tratamento com cisplatina (5 uM). E 48 h após o tratamento com cisplatina, as células foram colhidas para análise posterior. (B) A expressão de mRNA de PTEN foi inversamente relacionada com o miR-21. (C) o miR-21 imita o aumento da viabilidade celular enquanto o miR-21 inibidor diminuiu quando as células expostas a tratamento com cisplatina. (D) Western blot de PTEN, Akt total (t-Akt) e fósforo Ser473 Akt. (E) a representação gráfica de PTEN, t-Akt e fósforo-Akt. miR-21 diminuiu a expressão de PTEN e aumentou a razão de fósforo-Akt. * Comparado com o grupo controle, # comparação com miR-21 grupo mímica.
P
. 0,05 diferença tão significativa
miR-21
regula
expressão de PTEN
através da ligação à sua 3′-UTR
bioinformática uma pesquisa demonstrou que
PTEN
, um gene supressor de tumor, foi um alvo potencial para
miR-21
porque havia uma putativa
miR-21
sequência de sementes liga�o ao dentro da 3’UTR do
PTEN
mRNA (Fig. 3A). Medimos a ARNm (Fig. 2B) e os níveis de proteína de PTEN (Fig. 2D) nas células A549 com um alto ou baixo nível de miR-21. Uma correlação inversa entre
miR-21
expressão e
PTEN
expressão de mRNA foi detectado.
Akt
é a jusante da
PTEN
, e eu também afetou a ativação de
Akt
(Fig. 2D e E). Em comparação com o grupo de controlo,
miR-21 imita
diminuiu a actividade da luciferase, enquanto que o
miR-21
inibidor mostraram um aumento significativo na actividade de luciferase relativa. Quando a sequência de semente da
miR-21
sítios de ligação foi mutada, o efeito de
miR-21
sobre a actividade da luciferase não foi detectada (Fig. 3B). Em seguida, todo o quadro de leitura aberta de
PTEN
com ou sem o
miR-21
sequência alvo na 3’UTR foi clonado pcCS2. O
Myc
nível, o que representou exógena
PTEN
, foi diminuída pela
miR-21
imita nas células transfectadas com pcCS2-PTEN-3’UTR, enquanto não houve uma redução significativa na
Myc
expressão por
miR-21 imita
nas células transfectadas com pcCS2-PTEN (Fig. 3C e D). Estes resultados sugeriam que
miR-21
regulada a expressão de
PTEN
em células A549 via visando a sequência da PTEN 3’UTR.
(A) Construção de 3 ‘UTR e mutado 3’UTR de PTEN em vector PMIR-REPORT. (B) Nas células transfectadas com PMIR-report-PTEN-3 ‘UTR, a actividade de luciferase foi aumentada por miR-21 e diminuiu o miR-21 inibidor. Nas células transfectadas com PMIR-report-PTEN-MUT-3 ‘UTR, a actividade de luciferase manteve-se nenhuma diferença significativa entre os três grupos. (C) A estrutura de leitura aberta de PTEN com ou sem 3’UTR foi clonado no vector de pCS2. Um marcador myc foi ligado a PTEN para distinguir a PTEN endógeno ou exógeno. (D) a representação gráfica de Myc mostrou que a sobre-expressão de miR-21 reduziu Myc expressão enquanto miR-21 inibidor aumentou a sua expressão. Enquanto o PTEN 3’UTR foi nocauteado, a expressão de PTEN não foi influenciada pelo miR-21. * Comparado com o grupo controle, # comparação com miR-21 grupo mímica.
P
. 0,05 diferença tão significativa
NF-kB regula a expressão de miR-21 através da ligação do seu promotor
Dado o papel da
miR-21
em NSCLC, que teve como objetivo investigar o mecanismo da superexpressão de
miR-21
em NSCLC. A análise bioinformática sugeriu quatro elementos de ligação potenciais de NF-kB na região promotora de
miR-21
gene (Fig. 4A). O ensaio ChIP em tempo real mostraram que o nível de anticorpos de ligação de NF-kB para o
miR-21
promotor foi mais do que a de IgG (Figura 4C,
P
. 0,05) , indicando que o NF-kB poderia ligar-se directamente a todos os quatro elementos na região promotora de
miR-21
gene. Em seguida, nós subclonado diferentes comprimentos da
miR-21
promotor e sua mutação em pGL4 e cotransfectadas as construções com Renilla com ou sem pcNF-kB em células A549. Como mostrado na Fig. 4B, pcNF-kB aumentou significativamente a actividade de luciferase em comparação com pcDNA. Quando o primeiro elemento de ligação (-2837) foi eliminado ou mutado, não houve redução da actividade de luciferase em comparação com o promotor de comprimento completo. Quando o segundo elemento (-1211) foi eliminado ou mutado, houve redução significativa na atividade da luciferase. Quando o terceiro elemento foi eliminado ou mutado, não houve nenhuma redução significativa na actividade da luciferase comparado com quando o segundo elemento foi removido. No entanto, quando as sequências de ligação de NF-kB foram todos eliminado ou mutado, houve também uma redução significativa na actividade da luciferase comparado com quando o segundo elemento foi eliminado ou mutado. Estes resultados indicaram que o segundo e quarto elementos de ligação pode contribuir para a regulação da
miR-21
transcrição por NF-kB.
(A) O comprimento cheio de miR-21 tem quatro NF -κB elementos de ligação. Diferentes comprimentos de miR-21 promotor foram clonadas para pGL4 vetor. Os quatro elementos foram mutados individualmente e os promotores mutantes foram também clonados para pGL4 vector. (B) A actividade de luciferase relativa em células A549 cotransfectadas com pcNF-kB e pGL4 relatando vector. (C) Ensaio ChIP em tempo real mostraram que o anticorpo se ligar de NF-kB mais ADN do que a IgG normal. Iniciador 1 para 4 significa que o iniciador continha os quatro elementos de ligação de NF-kB de montante para jusante. *
P
. 0,05 diferença tão significativa
A via NF-kB /miR-21 /PTEN modula a sensibilidade das células A549 à cisplatina
A nível de
miR-21
foi induzida pela sobre-expressão de NF-kB e inibida por Lenti-shNF-kB, que diminuiu a expressão de NF-kB (Fig. 5A).
PTEN
expressão foi inversamente correlacionada com a expressão de NF-kB (Fig. 5A). A viabilidade celular das células A549 foi significativamente aumentada por Lenti-NF-kB quando expostos a tratamento com cisplatina (Fig. 5B). Nas células transfectadas com pcCS2-PTEN para sobre-expressar
PTEN
, os efeitos da sobre-expressão de NF-kB ou
miR-21
sobre a viabilidade celular de células A549 foi inibida (Fig. 5C) .
(a) expressões de mRNA de NF-kB, miR-21 e PTEN em células transduzidas com Lenti-controle, Lenti-NF-kB e Lenti-shNF-kB. O nível de miR-21 foi significativamente aumentada enquanto a PTEN foi reduzida nas células transduzidas com Lenti-NF-kB em comparação com o vector de controlo. O nível de miR-21 foi significativamente reduzida, enquanto o PTEN foi reduzida nas células transduzidas com Lenti-NF-kB. viabilidade (B) celular foi aumentada por Lenti-NF-kB, enquanto diminuiu Lenti-shNF-kB. (C) A sobre-expressão de PTEN restaurou a sensibilidade de células A549 para o tratamento com cisplatina em comparação com a sobre-expressão de NF-kB ou o miR-21. * Comparado com o grupo controle, # comparado com o grupo Lenti-NF-kB.
P
. 0,05 diferença tão significativa
Discussão
No presente estudo, demonstramos que
miR-21
foi regulada em pacientes com NSCLC, indicando um prognóstico pobre. Além disso, verificou-se que
miR-21
induzida a resistência da linha de células NSCLC de cisplatina através de segmentação da 3’UTR de
PTEN
para diminuir a sua expressão pós-transcricionalmente. Além disso, NF-kB transloca para o núcleo e se liga aos seus elementos específicos no
miR-21
promotor do gene para induzir
miR-21
expressão. Finalmente, a modulação da via /miR-21 /PTEN NF-kB aumentou a sensibilidade das células NSCLC para o tratamento com cisplatina. Nossos dados pode fornecer novos insights sobre o mecanismo fisiopatológico de NSCLC e sugere um alvo novo medicamento para NSCLC.
miR-21
foi encontrado para ser sobre-expresso em muitos tipos de tumores sólidos, incluindo cancro do fígado, cancro da próstata e cancro colorectal. Em nosso estudo, foram extraídas de tecidos de pacientes com NSCLC e controles para executar TMA. O resultado ISH detectou um nível mais elevado de
miR-21
em pacientes com NSCLC em comparação aos controles. Além disso, o elevado nível de
miR-21
indicou um mau prognóstico para pacientes com NSCLC. Esta é suportada por muitos estudos anteriores. No Markou et ai. estudo, 48 NSCLC amostras de tecido fresco congelado foram colhidas para detectar
miR-21
expressão por PCR em tempo real, e verificou-se que
miR-21
foi regulada em 16 dos 29 ( 55,2%) pacientes recaíram e 15 de 23 (65,2%) pacientes falecidos [17]. Adicionalmente, em não fumadores, a expressão anormalmente aumentada de
miR-21
foi encontrada para contribuir para a carcinogénese pulmonar [18]. Duas meta-análises resumiu os dados de diferentes estudos e concluíram que a sobre-expressão de
miR-21
foi um fator prognóstico independente para NSCLC [19], particularmente em pessoas asiáticos [20].
Para compreender o efeito de
miR-21
em NSCLC,
foram usadas miR-21 imita
e do seu inibidor, respectivamente, para aumentar e inibir a sua função biológica na linha celular A549 NSCLC. Verificou-se que exógeno
miR-21
promovido a sobrevivência das células quando expostos ao tratamento com cisplatina, ao passo que
miR-21
inibição levou à função oposta. Estes resultados foram validados por um estudo, que mostrou que a elevada
miR-21
aumentou a resistência das células A549 para a platina, enquanto que reduziu
miR-21
diminuição desta resistência [21]. Com base nas conclusões acima,
miR-21
pode ser um potencial alvo terapêutico para NSCLC. O mecanismo subjacente de resistência a cisplatina de NSCLC é complicado, e
miR-21
também tem múltiplos alvos de acordo com a análise bioinformática. Para explorar o efeito da I em NSCLC antes que avança ainda mais na fase de aplicação clínica, duas questões essenciais persistem:. Como eu afeta o resultado do NSCLC, e como eu é regulada em NSCLC
estudos
Bioinformática sugerem um alvo local de
miR-21
na 3’UTR de
PTEN
mRNA. I é um gene supressor de tumor ubíqua, e os seus resultados de desregulação em muitos tumores sólidos. Em NSCLC, I tem sido apontada como um dos principais contribuintes para a patogênese e tumor de crescimento [22].
PTEN
perda tem sido reconhecido como o mecanismo de resistência a gefitinib em NSCLC [23]. eliminação sistemática de
PTEN
leva ao desenvolvimento de NSCLC [24]. Assim, assumiu-se que
miR-21
, que inibe a
PTEN
, visando a sua 3’UTR, afetaria o processo patológico NSCLC. Nós inicialmente identificado uma relação inversa entre
miR-21
e
PTEN
em células A549. Nós, então, clonaram o 3’UTR de
PTEN
para o repórter PMIR-REPORT luciferase e descobriu que
miR-21 diminuiu
imita significativamente a atividade da luciferase quando co-transfectado com PMIR-REPORT-PTEN-3 ‘ UTR, enquanto nenhuma mudança na atividade de luciferase foi notada quando
miR-21
imita foram cotransfectadas com PMIR-REPORT-PTEN sem a 3’UTR. Estudos anteriores também apoiaram esta conclusão [25,26]
Por um lado,
miR-21
regulada a expressão de
PTEN
.; Por outro lado, era regulada por outros factores. Alguns miARNs têm os seus próprios promotores, enquanto que outros compartilham um promotor com outras miARNs para o gene miARN localizado no intrão do gene do hospedeiro. Se miARNs têm os seus próprios promotores ou que partilham promotores, a sua expressão pode ser regulada por determinados factores de transcrição, incluindo p53 e NF-kB, que têm como alvo os seus promotores. Há quatro elementos de ligação de NF-kB no
miR-21 promotor
gene [27]. Por isso, é possível que
miR-21
pode ser regulada por NF-kB de centrar os seus elementos de ligação. O nosso ensaio ChIP confirmou que NF-kB poderia ligar-se directamente a todos os quatro elementos do promotor da
miR-21
gene. No entanto, apenas os elementos situados no -1211 e -404 do promotor
miR-21
gene tinha função biológica de acordo com o ensaio de actividade de luciferase. Nossos dados foram parcialmente apoiada por outros estudos. Em células de câncer de próstata, a induzida por interferon
miR-21
expressão necessária NF-kB de recrutamento /p65 para o
miR-21
promotor [27]. No mama humano MDA-MB-231 e linhas celulares tumorais HCT116 colorrectais, NF-kB também se verificou ligar-se ao
miR-21
gene promotor [28]. Em NSCLC, NF-kB foi identificado pela primeira vez para regular a expressão de
miR-21
por ligação aos seus elementos no
21 miR-
promotor do gene.