Abstract
Introdução
O objetivo do presente estudo foi traçar o perfil do glicose-dependente e glutamine- metabolismo dependente em câncer pancreático
Métodos
Foi realizada coloração imuno-histoquímica de GLUT1, CAIX, BNIP3, p62, LC3, GLUD1 e GOT1. Com base na expressão de proteínas relacionadas com o metabolismo, os fenótipos metabólicos de tumores foram classificados em duas categorias, nomeadamente de glucose e metabolismo dependente de glutamina. Havia tipo Warburg, inverta tipo Warburg, tipo misto, e tipo nulo no metabolismo dependente de glicose e tipo canônica, o tipo não-canônico, tipo misto, tipo nulo no metabolismo dependente de glutamina.
Resultados
sobrevivência global mais longa foi associada com alta expressão de BNIP3 no tumor (p = 0,010). sobrevivência global mais curto que foi associado com expressão elevada de GLUT1 no tumor (P = 0,002) e GOT1 no tumor (p = 0,030). Warburg tipo de metabolismo dependente de glucose tinha uma maior percentagem de tumores com a infiltração do nervo (P = 0,0003), fase UICC (P = 0,0004), e o estado autophagic activado no tumor (P = 0,0167). tipo misto do metabolismo dependente de glicose composta a maior porcentagem de tumores com o status positivo marginal (P 0,0001), invasão linfática (P 0,0001) e status autofágica activado no estroma (P = 0,0002). tipo misto e tipo Warburg teve uma associação significativa com a sobrevida global mais curto (P = 0,018). Tipo de não-canônico e tipo misto do metabolismo dependente de glutamina composta a maior porcentagem de tumores com invasão vascular (p = 0,0073), maior percentual de autofagia activado em tumores (P = 0,0034). Além disso, estes dois tipos de metabolismo dependente de glutamina foram significativamente associados com a sobrevivência global mais curta (P 0,001). Uma análise mais aprofundada sugeriu que a maioria dos tumores eram dependentes tanto da glucose e metabolismo dependente de glutamina. Depois de dividir os tumores de acordo com o número de metabolismo, verificou-se que o aumento do número de subtipos do metabolismo inversamente associado com o desfecho sobrevivência.
Conclusão
tipo Warburg, do tipo não-canônico e mistos tipos de glicose-e metabolismo dependente de glutamina composta de tumores de prognóstico mais metabolicamente ativas, biologicamente agressivos e pobres. Além disso, o aumento dos subtipos e categorias do metabolismo de cada tumor significativamente associada com mau prognóstico
Citation:. Yu M, Zhou Q, Zhou Y, Z Fu, Tan L, Ye X, et al. (2015) Metabolic fenótipos no cancro do pâncreas. PLoS ONE 10 (2): e0115153. doi: 10.1371 /journal.pone.0115153
Editor do Academic: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Cancer Institute Mitchell, United States |
Recebido: 06 de fevereiro de 2014; Aceito: 18 de novembro de 2014; Publicação: 26 de fevereiro de 2015
Direitos de autor: © 2015 Yu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento: Este trabalho foi apoiado pela Fundação Natural Científico Nacional da China (no. 81000917 e não. 81370059). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
metabolismo aberrante é agora considerado como uma das marcas de cancro [1]. Notavelmente, as células tumorais exibem altos níveis de glicólise mesmo sob o fornecimento adequado de oxigénio, um fenómeno notável denominado efeito Warburg. O trabalho pioneiro de Otto Warburg tem sido apoiada por relatórios em vários tipos de tumores, e agora é explorada na clínica para fins de diagnóstico. No entanto, essa visão é contestada por evidências emergentes. Em sua teoria, Warburg suposto que as células cancerosas tendem a gerar ATP através da glicólise, em vez de phorsphorylation oxidativo após a disfunção mitocondrial [2]. No entanto, evidências crescentes indicam que defeitos primários em enzimas mitocondriais ou complexos em phorsphorylation oxidativo não foram frequentemente observadas em cânceres [3]. O número relativamente baixo de inibidores metabólicos foram introduzidos no tratamento do câncer e apenas alguns deles entraram desenvolvimento clínico [4], o que refletiu em parte a heterogeneidade ea complexidade do metabolismo do tumor. Além disso, estudo realizado por Zu e o seu colega mostrou que a quantidade de ATP derivado de glicólise não exceda 50-60% da produção total de ATP [5,6]. Um novo paradigma chamado “efeito Warburg reverso”, no qual glicólise aeróbica teve lugar em fibroblastos associados ao câncer, em vez de células tumorais, também surgiu no cancro da mama [7,8]. Dados recentes mostraram que as células de cancro do pâncreas glutamina utilizar de forma não usual, que é dependente da transaminase glutâmico-oxaloacética em vez de desidrogenase de glutamato [9]. Tais resultados colocam uma grande ênfase na heterogeneidade significativa no metabolismo do câncer sugerindo que cada câncer tem suas próprias características metabólicas, que precisa ser levado em consideração antes de explorar novos alvos de metabolismo do câncer.
O câncer de pâncreas é a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos e na Europa. Ainda é uma das doenças mais intratáveis e fatal por causa da sua fase final, quando diagnosticado, o fenótipo invasivo, resistente a terapias correntes [10,11]. Segmentação metabolismo do câncer é uma estratégia promissora para melhorar o tratamento do câncer pancreático. Para pavimentar o caminho para o desenvolvimento de tratamentos terapêuticos metabolismo, fenótipos metabolismo no pâncreas são necessários para ser elucidado. Para nosso melhor conhecimento, não existem estudos que investigam os fenótipos metabólicos em câncer pancreático. Portanto, o objetivo do nosso estudo foi realizado ao perfil do status de glicose-dependente e metabolismo, mitocondrial dependente de glutamina, e autofágica em câncer pancreático.
Materiais e Métodos
seleção dos pacientes
Amostras de 106 tecidos com cancro pancreático foram derivadas de pacientes submetidos a operações radicais em um estudo de coorte retrospectivo, entre janeiro 2000 e dezembro 2012 em Sun Yat-sen Memorial Hospital de Sun Yat-sen University e uma coorte prospectiva de junho .2012 a maio de 2013 (número de registo: ChiCTR-TRC-12002548). Este estudo cumpriu com a Declaração de Helsinki e foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional de Sun Yat-sen Memorial Hospital. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento, indicando a sua vontade de participar e sua compreensão do processo e objectivo geral do estudo. Todos os pacientes confirmados patológicos e histológicos incluídos com câncer pancreático cumpridos os seguintes critérios: sem história de qualquer outro tumor maligno, sem terapia neoadjuvante antes da cirurgia. Nenhum deles morreram durante o período perioperatório devido a complicações pós-operatórias. Todos os pacientes consentimento foi obtido antes da coleta de espécimes, e todos os procedimentos do estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética Sun Yat-sen Memorial Hospital de Sun Yat-sen University. Os itens de dados foram extraídos por meio de sistema de registro médico da seguinte forma: idade, sexo, estado do metabolismo da glicose, tamanho do tumor, localização do tumor, grau histológico, status marginal, a infiltração do nervo, invasão vascular, UICC Stage (Tumor patológica etapa foi classificada de acordo com a União de Controle do Câncer Internacional (UICC)) e invasão linfática. Sobrevida global (OS) foi definido como o intervalo de tempo entre a data de operação para a morte ou o último follow-up maio de 2013.
Imunohistoquímica
A análise imunohistoquímica foi realizada da seguinte forma: Tissue As amostras foram fixadas em formol neutro tamponado, e depois incorporado por parafina. A peroxidase endógena foi extinta com 3% de peróxido de hidrogénio durante 30 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram então lavadas em PBS e incubadas durante 30 min a 37 ° C com tampão de tripsina. Após lavagem em PBS adequado, recuperação de antigénio de 5 mm de espessura de 106 tecidos de cancro do pâncreas foi feita em tampão de citrato (pH 6,0). Quando as lâminas foram arrefecidos até à temperatura ambiente, a ligação não específica de proteína foram bloco durante 60 min em soro de cabra normal a à temperatura ambiente. Subsequentemente, aplicou-se o anticorpo primário (listados na Tabela 1 em Ficheiro S2) para imuno-histoquímica durante a noite a 4 ° C. Em seguida, Elivision Super DAB kit foi aplicado como instruções de manufatura. A incubação do anticorpo primário foi omitido como controlos negativos. Os controlos positivos foram escolhidos como sugerido nas instruções de anticorpos ou dados anteriores [12,13]: transportador de glicose 1 (GLUT1): carcinoma de esôfago; anidrase carbónica IX (CAIX): carcinoma renal; BCL2 /adenovirus E1B 19-kDa interagindo proteína 3 (BNIP3), tecido de rim; Beclin-1: tecido mamário; associada a microtúbulos de proteína 1 de cadeia leve 3 (MAPLC3): tecido nervoso em cada espécimes; p62: tecido do baço; -glutâmico oxaloacético transaminase (GOT1): tecido do rim; glutamato desidrogenase 1 (GLUD1): tecido cardíaco (Figura A no arquivo S1). sistema de pontuação Imunoreatividade (IRS) foi empregado para análise semi-quantitativa. Em resumo, a pontuação IRS para cada amostra foi obtida por dois patologistas independentes eo valor médio das pontuações foi o placar final foi utilizado para análise posterior. Quaisquer inconsistências entre os dados dos patologistas foram resolvidas por discussão com um terceiro patologista até a consistência foi alcançado. Pontuações para a expressão da proteína relacionada com o metabolismo foram avaliados de acordo com a intensidade e proporção. A pontuação foi determinada intensidade como 0 (sem coloração), 1 (coloração mais fraca do que o controlo positivo), 2 (coloração igual como controlo positivo), e 3 (de coloração mais forte do que o controlo positivo). A pontuação foi determinada como percentagem 0 (negativa), 1 ( 30% das células do tumor) e 2 (≧ 30% das células tumorais). A pontuação intensidade e pontuação proporção foram multiplicados juntos para uma pontuação total. Os escores totais foram classificados da seguinte forma: 0-1 (negativo) e 2-6 (positivo)
Classificação de fenótipos metabólicos tumorais
Nós classificou os casos em fenótipos de acordo com a coloração imuno-histoquímica para. estas proteínas relacionadas com o metabolismo como relatório anterior [12,13]: tipos Glicose: GLUT1- e /ou CAIX-positivos; Tipo nonglycolysis: GLUT1- e CAIX-negativo; Tipo mitocondrial disfuncional: BNIP3-positivos; Tipo mitocondrial funcional: BNIP3-negativo; tipos autofagia ativados: dois ou mais marcadores autofágicos de Beclin1, LC3, p62; inactivado tipo de autofagia: positivo para menos de dois marcadores autofágicos de Beclin1, LC3, p62; canônica tipo metabolismo da glutamina: GLUD1-positivas e GOT1 positiva; não-canônico tipo metabolismo da glutamina: GLUD1-negativo e GOT1 positivo. Metabolismo em câncer pancreático foi dividido em duas categorias principais: glicose-dependente do metabolismo e metabolismo dependente de glutamina [9,14]. dependente da glicose fenótipo metabolismo do indivíduo espécime câncer de pâncreas é classificada como segue de acordo com relatórios anteriores [12,13]: Tipo de Warburg: tumor (tipo glicólise), estroma (tipo não-glicólise, fosforilação oxidativa); Tipo de Warburg reverso: tumor (tipo não-glicólise, fosforilação oxidativa), estroma (tipo glicólise); tipo misto: tumor (tipo glicólise), estroma (glicólise); e tipo nulo: tumor (tipo não-glicólise, fosforilação oxidativa), estroma (tipo não-glicólise, fosforilação oxidativa). dependentes de glutamina fenótipo metabolismo do indivíduo espécime câncer de pâncreas é classificada como segue: tipo canônico (GLUD1-positivas e GOT1-negativo), tipo não-canônica (GOT1-positivas e GLUD1-negativo), tipo misto (GLUD1-positivas e GOT1- positivo), tipo nula (GLUD1-negativo e GOT1-negativo) do metabolismo de glutamina.
quantitativo em tempo real transcrição reversa-PCR Ensaio
Nós avaliamos a expressão de mRNA dos genes-alvo com qRT -PCR. O ARN total foi isolado a partir de tecidos e linhas celulares, utilizando o reagente Trizol (Invitrogen), e as concentrações foram medidas com um espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies). A primeira vertente do cDNA foi sintetizado com PrimeScript® primeiro Strand cDNA Synthesis Kit (Takara). QRT-PCR foi aplicado de acordo com as instruções do fabricante. QRT-PCR foi então realizada a 95 ° C durante 10 minutos, a 95 ° C durante 15 segundos, e a 60 ° C durante 15 segundos, com um total de 40 ciclos. Cada reacção foi realizada em triplicado e todos os iniciadores usados foram listados em dados adicionais. Os iniciadores foram concebidos com base na sequência de cada gene usando Premier 5.0. Os níveis de ARNm foram normalizados para ARNm de beta-actina de acordo com a seguinte fórmula: [2 – (C
T
Alvo – C
T
Actina)] x 100%, em que C
T é o ciclo limiar.
análise estatística
os dados foram analisados usando SPSS para Windows versão 16.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, EUA). As variáveis categóricas foram comparadas pelo teste exato de Fisher. Os tempos de sobrevivência médios foram avaliados por curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier e as diferenças foram ainda analisados com o teste log-rank. Quando o valor de P foi menor que 0,05, a significância foi assumido, a menos marcada. Quando o valor de P foi inferior a 0,1 na análise univariada e estas variáveis foram ainda analisados na análise multivariada através de cox modelos de riscos proporcionais.
Resultados
características clínicopatológicos de pacientes incluídos
A presente coorte consistiu de 106 pacientes, incluindo 57 homens e 49 mulheres. A idade média de operação foi 60,42 anos, com uma idade média de 61.00 anos e um intervalo de 31 anos para 77 anos. No momento da última acompanhamento clínico (maio de 2013), 29 (27,4%) pacientes estavam vivos. A sobrevida global mediana dos 106 pacientes foi de 21,9 meses, com 1, 3, e as taxas de sobrevida em 5 anos de 56,8%, 13,2% e 6,2%, respectivamente. A maioria dos pacientes (80,2%) tinham tumores localizados na cabeça do pâncreas e tamanhos de a maioria dos tumores (80,2%) tinham mais de 20 mm de maior diâmetro. A maioria dos tumores foram moderadamente diferenciado (37,7%), seguido por bem diferenciado (35,9%), e mal diferenciados (26,4%). Vinte e três (21,7%) pacientes com uma margem positiva. infiltração nervosa foi apresentado em 84 pacientes (79,2%), invasão vascular em 82 (77,4%) pacientes, e invasão linfática em 68 (64,2%) pacientes. A maioria dos pacientes (73,6%) apresentaram com a União de Controle do Câncer Internacional (UICC) doença em estágio IIB, eo restante (26,4%) pacientes apresentaram estágio UICC IA, IB e IIA doença. Nenhum paciente apresentou com o estágio UICC III e IV da doença.
Correlação entre a expressão de proteínas relacionadas com o metabolismo e os parâmetros clínico
A correlação entre as proteínas relacionadas com o metabolismo e os parâmetros clínico foram resumidos na Tabela 1 a Tabela 4. Verificou-se que o aumento da expressão do tumor de GLUT1 foi associado com a infiltração do nervo (P = 0,0180), invasão linfático (P 0,0001), fase UICC (P = 0,0044), enquanto que a expressão de estroma de GLUT1 foi associada com desdiferenciação do tumor ( P = 0,0155), o estado positivo marginal (P = 0,0063), a infiltração do nervo (P = 0,0005), invasão linfático (P = 0,0065) e fase UICC (P = 0,0010) (Tabela 1). expressão de tumor GLUD1 foi associada com o tamanho do tumor maior (P = 0,0086). expressão tumoral de GOT1 foi significativamente associada com a diferenciação do tumor (P = 0,0238), invasão vascular (P = 0,0384), invasão linfática (P = 0,0367). Houve uma associação significativa entre a expressão do estroma de GOT1 e infiltração do nervo (P = 0,0087) (Tabela 2). expressão de BNIP3 tumor foi associada com desdiferenciação do tumor (P = 0,0155), enquanto que a expressão de estroma de BNIP3 foi associado com o estado positivo marginal (P = 0,0010) (Tabela 3). expressão citoplasmática de p62 no tumor foi associado com o estado marginal positiva (P = 0,0132), enquanto que a expressão de p62 nuclear no estroma foi associada com tamanho maior do tumor (P = 0,0173) (Tabela 3). expressão tumoral de LC3 foi ligado com o metabolismo da glicose diminuída (P = 0,0205), o tamanho do tumor maior (P = 0,0453), desdiferenciação do tumor (P = 0,0040), invasão vascular (P = 0,0044), invasão linfático (P = 0,0385), enquanto expressão do estroma de LC3 associada com desdiferenciação do tumor (P 0,0001), condição marginal positiva (P = 0,0010), invasão vascular negativa (P = 0,0015) (Tabela 4). Houve uma associação significativa entre a expressão citoplasmática de beclin-1 em tumores e invasão linfático (P = 0,0175), ao passo que a expressão nuclear beclin-1 no estroma foi associado com o estado positivo marginal (P = 0,0379) (Tabela 4).
Correlação entre tumorais metabólica fenótipos e os parâmetros clínico, função mitocondrial e estado autofágica
Classificações do tumor fenótipos metabólicos foram resumidos de acordo com relatórios anteriores (Tabela 2 em ficheiro S2) e perfis representativos imunohistoquímica foram mostrados na Fig. 1 [13,14]. Warburg tipo refere-se a um fenótipo em que apenas as células de tumores apresentam aumento da glicólise e glicólise ocorre no estroma não tumoral em tipo Warburg inversa. Tanto as células tumorais e as células do estroma são em glicolítica tipo misto e nonglycolytic em tipo nulo. As correlações entre os fenótipos metabólicos de cancro do pâncreas e os parâmetros clínico foram resumidos na Tabela 5. O total de 106 amostras de tumor foram divididos em quatro tipos seguintes de acordo com as suas proteínas relacionadas com a glicólise expressão: Tipo de Warburg (n = 46, 43,4%), inversa tipo de Warburg (n = 15, 14,2%), de tipo misto (n = 16, 15,1%), tipo nulo (n = 29, 27,3%). Warburg tipo de metabolismo dependente de glucose tinha uma maior percentagem de tumores com a infiltração do nervo (P = 0,0003), fase UICC (P = 0,0004). tipo misto do metabolismo dependente de glucose compreendida a percentagem mais elevada de tumores localizados no corpo /cauda (P = 0,0041), com o estado positivo marginal (P 0,0001), e com invasão linfático (P 0,0001). Reverso tipo Warburg tinha uma percentagem mais elevada de tumores localizados na cabeça (P = 0,0041), com ausência de infiltração do nervo (P = 0,0003). Tipo Null do metabolismo dependente de glicose composta maior percentual de tumores com status marginal negativo (P 0,0001) e ausência de invasão linfática (P 0,0001).
O total de 106 amostras de tumor foram também dividida em quatro subtipos do metabolismo dependente de glutamina, incluindo o tipo canônico (n = 18, 17,0%), tipo não-canônica (n = 74, 69,8%), tipo misto (n = 5, 4,7%) e tipo nula ( n = 9, 8,5%) (Tabela 5). O tipo canónico refere-se a um fenótipo em que os tumores dependem de glutamato desidrogenase (GLUD1) para utilização glutamina; enquanto que o tipo não-canônico refere-se a um fenótipo tumoral em que dependem de aspartato transaminase (GOT1) para a utilização de glutamina [9,15]. O tipo misto do metabolismo dependente de glutamina refere-se a um fenótipo em que os tumores metabolizar glutamina através GLUD1 e GOT1 e tipo nulo refere-se a um fenótipo em que tumores metabolizar glutamina por não GLUD1 nem GOT1. Tipo Canonical tinha uma percentagem mais elevada de tumores com status marginal negativo (P 0,0001), enquanto que tipo misto do metabolismo dependente de glutamina composta a maior porcentagem de tumores com o status positivo marginal (P 0,0001), invasão vascular (p = 0,0073). Uma associação significativa foi encontrada entre o tipo nulo do metabolismo dependente de glutamina e tumores com tamanho maior ( 2,0 centímetros) (p = 0,0163). Além disso, os tumores do tipo não-canônico e tipo misto tinha um estatuto significativamente activado autofágica no tumor (P = 0,0034), e do tipo não-canônico composto o maior percentual de estroma com o estado funcional mitocondrial (P = 0,0046) (Tabela 6).
Impacto de parâmetros clínico e proteínas relacionadas com o metabolismo no prognóstico do paciente
a análise univariada foi realizada para explorar a relação dos parâmetros clínico /proteínas relacionadas com o metabolismo e sobreviventes gerais (Tabela 7 e a Figura B em ficheiro S1). Alto grau histológico (P = 0,041) foi significativamente associada à sobrevida global mais curto. Maior sobrevivência global foi associada com elevada expressão de BNIP3 no tumor (p = 0,010). sobrevivência global mais curto que foi associado com expressão elevada de GLUT1 no tumor (P = 0,002), em GOT1 do tumor (p = 0,030), e LC3 no tumor (p = 0,009). Houve diferenças significativas borderline da infiltração do nervo em relação à sobrevida global (P = 0,075).
Impacto de fenótipos metabólicos prognóstico do paciente
Os resultados da análise univariada usando log-rank testes dos fenótipos de metabolismo em relação à sobrevivência global estão apresentados na Tabela 8. estado metabolismo dependente da glicose foi significativamente associado com a sobrevivência global (P = 0,018) (Fig. 2A). Em seguida, foi realizada comparação pareada entre os subtipos do metabolismo dependente da glicose, e descobriu que tipo de Warburg e tipo misto do metabolismo da glicose-dependente foram significativamente associados com menor sobrevida global (Warburg tipo vs. tipo Warburg reverso, P = 0,0340; Warburg tipo vs. tipo nula, P = 0,0480; tipo misto vs. tipo Warburg reverso, P = 0,0060; tipo misto vs. tipo nulo, P = 0,0350). Não houve diferença entre os outros pares (tipo Warburg vs. tipo misto, P = 0,4880; tipo Warburg reverso vs. tipo null, P = 0,648) (Tabela 3 em Arquivo S2). Nós também descobrimos que o status metabolismo dependente de glutamina foi significativamente associada à sobrevida global (P 0,001) (Fig 2B e Tabela 8.). Após o teste de pares foi realizada, descobrimos que tipo canônica foi significativamente associada com a sobrevivência global mais longa (tipo Canonical vs tipo não-canônica, p = 0,009; tipo Canonical vs tipo misto, P 0,001). tipo não-canônica foi significativamente associada com a sobrevivência global mais longa do que tipo misto (P 0,001), mas menor do que o tipo nula (P = 0,028) eo tipo canônico (P = 0,0009). O tipo misto do metabolismo dependente de glutamina foi significativamente associada à sobrevida global mais curto do que o tipo nula (P 0,001). Não houve diferença entre o tipo canônico e tipo nula (P = 0,453) (Tabela 4 em Arquivo S2) (Fig. 3).
Assumiu-se que tipos mistos composto de dois tipos principais dentro de glucose e glutamine- metabolismo dependente (ou seja Warburg efeito e efeito Warburg reverso, tipo Canonical e do tipo não-canônica), e os tipos nulos não foram compostas de qualquer um dos dois tipos principais no metabolismo de glucose e dependentes de glutamina (ou seja, nem efeito Warburg nem Warburg reverso efeito, nenhum tipo Canonical nem tipo não-canônico.
a linha sólida com a seta significa categorias metabólicas ou subtipos têm a maior percentagem dos parâmetros associados específicos.
a fim de comparar as duas categorias de metabolismo em paralelo, classificamos os tumores em grupos seguintes de acordo com as duas categorias de metabolismo: tipo de dependentes de glicose (tumores só dependem de metabolismo dependente de glicose e não têm nenhum sinal de glutamina-dependentes metabolismo), dependentes de glutamina tipo (tumores só dependem de metabolismo dependente de glutamina e não mostram nenhum sinal do metabolismo dependente de glicose), tipo misto (tumores contar com o metabolismo da glucose e dependentes de glutamina), e tipo nula (tumores não mostram sinal do metabolismo da glucose ou dependentes de glutamina) (Tabela 8). A maioria (n = 71; 67,0%) dos tumores incluído no presente estudo eram do tipo misturado, seguido pelo metabolismo dependente de glutamina (n = 26, 24,5%), o metabolismo dependente de glucose (n = 6, 5,7%), e nulo tipo (n = 3, 2,8%). Ele sugeriu que a maioria dos tumores utilizados metabolismo tanto glicose e dependente de glutamina para sobreviver sob escassez de nutrientes e oxigênio. Em seguida, foi realizada a análise de sobrevivência de Kaplan-Meier e descobriu que as categorias de metabolismo foram significativamente associados com a sobrevida global dos pacientes (p = 0,021) (Fig. 2C). No entanto, após o teste de pares foi feito, apenas o tipo nulo significativamente associada à sobrevida global mais tempo do que o metabolismo glutamine- e dependente da glicose. Notavelmente, não houve diferença significativa na sobrevivência global entre o metabolismo dependente de glucose e metabolismo dependente de glutamina (P = 0,279). No entanto, a consideração cuidadosa deve ser dada a esses resultados devido à falta de dados no tipo nulo e tipo dependente de glicose (Tabela 5 em Arquivo S2). Nossa hipótese é que o tumor com tipo misto ou tipo de Warburg do metabolismo dependente de glicose são altamente glycolytic e tumores com tipo não-canônico e tipo misto do metabolismo dependente de glutamina são altamente glutaminolytic. Descobrimos que os tumores altamente glicolíticas também foram mais dependentes do metabolismo dependente de glutamina e vice-versa (P 0,0001).
Em seguida, a hipótese de que tipos mistos foram compostos de dois subtipos principais de glucose e glutamina-dependente metabolismo (ou seja, tipo de Warburg e tipo Warburg reverso, tipo Canonical e do tipo não-canônica), e os tipos nulos não foram compostas de qualquer um dos dois tipos principais no metabolismo de glucose e dependentes de glutamina (ou seja, nenhum tipo Warburg nem tipo Warburg reverso , nenhum tipo Canonical nem tipo não-canônica). Portanto, com base nos tipos de metabolismo da glicose-dependente e dependentes de glutamina, classificou-se os pacientes em 4 grupos: Zero tipo (n = 3, 2,8%), um tipo (n = 31, 29,2%), dois tipos (N = 53, 50,0%), três tipos (n = 18, 17,0%), quatro tipos (n = 1, 0,9%) (Tabela 8). Tal como indicado na análise de sobrevivência de Kaplan-Meier, a sobrevivência geral de um grupo de tipo foi significativamente mais longa do que o grupo de dois tipo (P = 0,039) e um terceiro grupo de tipo (P = 0,005) (Fig. 2D). Além disso, o grupo de dois tipo mostram uma sobrevida relativamente mais geral do que o grupo de três tipo (P = 0,024). A análise estatística comparando a zero tipo ou quatro tipo e outros tipos também foi realizado, mas os resultados necessários para ser feita cuidadosa consideração devido ao pequeno número de pacientes. Para resumir, os números crescentes dos tipos de metabolismo refletido robustamente grandes diferenças nos resultados de sobrevivência (Tabela 8 e Tabela 6 em Arquivo S2).
A análise multivariada da relação entre fatores prognósticos e sobrevida do paciente
Finalmente, a análise multivariada também foi realizada quando o valor P na análise univariada era inferior a 0,1. factores de prognóstico, incluindo diferenciação tumoral, a infiltração do nervo, a expressão de GLUT1 no tumor, GOT1 no tumor, a expressão de LC3 no tumor, a expressão de BNIP3 no tumor, o metabolismo dependente da glicose, metabolismo dependente de glutamina, categorias de metabolismo e do número de tipos de metabolismo em tumor foram analisados em modelos multivariados de Cox análise de riscos proporcionais. Os resultados mostraram que fatores independentes para a sobrevida global foram maiores grau histológico (perigo ração 1.734, P = 0,015), GLUT1 no tumor (ração perigo 1.781, P = 0,003), GOT1 no tumor (perigo ração 1.982, P = 0,001), LC3 no tumor (perigo ração 3.321, P = 0,001), o metabolismo dependente de glutamina (perigo ração 1.471, P = 0,041), o metabolismo dependente de glicose (perigo ração 1.689, P = 0,022), o número de tipo de metabolismo (taxa de risco 1,806, P – = 0,031). No entanto, a expressão de BNIP3 no tumor foi significativamente associada com melhor prognóstico (risco ração 0,049, P = 0,008) (Tabela 9).
nível de Transcrição de genes relacionados com o metabolismo no tumor de acordo com fenótipo tumoral
de modo a confirmar ainda mais os resultados de IHC acima, qRT-PCR foi realizada para investigar a expressão de genes relacionados com o metabolismo (Tabela 7 em ficheiro S2) em tumores de acordo com o fenótipo do tumor. A expressão do SLC2A1 (gene do GLUT1), BNIP3, BECN1 (gene de Beclin1) e MAP1LC3A (gene da LC3) foi maior nos tipos Warburg, ao passo que a expressão de GLUT1, CAIX, BNIP3, BECN1, MAP1LC3A e SQSTM1 (gene da p62 ) foram maiores no tipo misto de metabolismo dependente de glicose do que nos controlos. A expressão de GLUD1 foi maior no tipo canônica do que os controles, e expressão de GOT1 foi maior no tipo não-canônica e tipo misto (Figura C no arquivo S1).
Discussão
O prognóstico da pacientes com câncer pancreático ainda é sombrio, e que a doença é, obviamente, resistente à terapia atual [16]. Por conseguinte, existe uma necessidade crescente de novas estratégias para aumentar o efeito antitumoral de gemcitabina em cancro do pâncreas, que é o agente quimioterapêutico padrão no cancro pancreático. Recentemente, tem havido um interesse crescente na compreensão do câncer metabolismo alterado e segmentação metabolismo do câncer detém uma estratégia promissora para o tratamento do câncer [4,9,17-19]. Antes de tais drogas metabólicas eficazes entrar em uso, fenótipos de metabolismo em cada paciente com câncer no pâncreas precisam ser claramente identificados devido à heterogeneidade óbvia em câncer pancreático [20,21]. No entanto, pouco se sabe sobre os recursos metabólicos em câncer pancreático.
Portanto, o presente estudo foi realizado para traçar o perfil do metabolismo da glicose-dependente e dependentes de glutamina em pacientes com câncer de pâncreas. Para nosso melhor conhecimento, nosso estudo foi o primeiro estudo que incidiu sobre perfis de fenótipos do metabolismo em câncer pancreático. A fim de identificar o fenótipo metabolismo de espécime de tumor individuais, em primeiro lugar, investigou a expressão diferencial de proteínas marcadores relacionados com o metabolismo não só em células tumorais, mas também em células estromais. Além disso, também investigar o estado autofágica através de p62, LC3, expressão Beclin1 e função mitocondrial por BNIP3 expressão. Foi relatado que a p62 é transportado entre o núcleo e o citosol continuamente. p62 é necessária para recrutar o grande ALFY (proteína ligada ao autofagia Fyve, também conhecido como WDFY3) proteína de ligação a fosfoinositida, que está predominantemente localizada na nuclear, a p62 corpos citoplásmicos. ALFY, assim como p62, é necessária para a formação e degradação autophagic de inclusões citoplasmáticas ubiquitina-positivas [22,23]. BNIP3 é um membro pro-apoptótica da família Bcl-2 induzida em condições de hipoxia e foi utilizada para avaliar a função mitocondrial. Recentemente, foi demonstrado que medeia BNIP3 disfunção mitocondrial através da activação do Bax ou Bak, e induzida transição de permeabilidade mitocondrial através da sua cauda do terminal carboxilo. Portanto, a sobre-expressão de BNIP3 indica as mitocôndrias disfuncionais [24,25]. De nota, células estromais metabolizar através da glicólise devido à mitocôndrias disfuncionais e reforçada autofagia, enquanto as células tumorais metabolizar através da fosforilação oxidativa de acordo com a teoria do efeito Warburg reverso [7,26,27]. Como não há relatando o efeito Warburg reverso no câncer de pâncreas de dados, o presente estudo foi realizado para verificar a existência de efeito Warburg reverso em câncer pancreático, entretanto. Descobrimos que a expressão aumentada de tumores de GLUT1 foi associada com a infiltração do nervo, invasão linfática, estágio UICC, enquanto a expressão de estoma de GLUT1 foi associada com desdiferenciação tumor, status marginal positiva, a infiltração do nervo, invasão linfática e estágio UICC.