Abstract

Objectivo

rica em leucina-repetir contendo receptores acoplados à proteína G 5 (lgr5 ) é um marcador candidato para as células-tronco do câncer colorretal (CSC). No presente estudo, investigamos o estado de metilação dentro thelgr5 promotor e avaliada sua relação com a diferenciação CSC, o prognóstico para o cancro colorectal, e suas características clínico-patológicas.

Métodos

O estado de metilação dentro promotor Lgr5 foi detectada com um PCR específico da metilação em seis linhas celulares de cancro colorrectal, bem como 169 tecidos de tumor colorectais primários. Diferenciação de CSC foi analisada com imunofluorescência e imunocitoquímica. A sub-regulação de lgr5 foi conseguida com ARNsi específico do gene. As associações entre metilação lgr5 e as características clínico-patológicas, bem como a sobrevivência dos pacientes foram analisados ​​com métodos estatísticos.

Resultados

O promotor lgr5 foi metilado em graus diferentes para as seis linhas de células colorretal examinados, com metilação completa observada em células HCT116 na qual a expressão lgr5 foi parcialmente recuperada após o tratamento de DAC. A formação esfera de células estaminais a partir de células HCT116 foi acompanhado por aumento da metilação do promotor dentro lgr5 e diminuindo a expressão dos lgr5. Derrubando lgr5 por siRNA também levou a células-tronco formação de esferas. Entre os tumores colorectais primários, 40% (67/169) foram positivos para a metilação lgr5, enquanto que nenhum dos tecidos normais de cólon foi positivo para a metilação lgr5. Além disso, a metilação lgr5 significativamente associada com maior grau tumoral e metástases à distância negativo (p 0,05), bem como melhor prognóstico (p = 0,001) em pacientes com câncer colorretal

Conclusões

Nossos dados sugerem que lgr5 metilação, através da regulação da expressão lgr5 e diferenciação CSC colorretal, pode constituir um novo marcador de prognóstico para pacientes com câncer colorretal

Citation:. Su S, Hong F, Liang Y, Zhou J, Liang Y, Chen K et al. (2015) Lgr5 metilação em Câncer Stem Diferenciação Celular e Prognóstico de previsão no câncer colorretal. PLoS ONE 10 (11): e0143513. doi: 10.1371 /journal.pone.0143513

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha

Recebido: 20 Março, 2015; Aceito: 05 de novembro de 2015; Publicação: 24 de novembro de 2015

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho está disponível sob a licença Creative Commons CC0 domínio público dedicação

Disponibilidade de dados: Dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este projecto foi em parte apoiada pela National Fundação de Ciência Natural da China (NSFC. NO. 81302156), Guangzhou Projeto piloto de clínica e Translational Research Center (cancros gastrointestinais iniciais, No.7415696196402), Guangdong Provincial Bio-engenharia Research Center for Diseases Gastroenterologia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

provas Accumulative suporta a hipótese de que um pequeno número de células-tronco indiferenciadas ou células-tronco semelhantes, os chamados células-tronco cancerosas (CSC), são responsáveis ​​pela iniciação do tumor, desenvolvimento, manutenção, disseminação, regeneração e resistência terapêutica . Posteriormente, a presença de CSC foi confirmada numa variedade de cancros sólidos, tais como cancro da mama [1, 2], glioblastomas [3], carcinomas hepatocelulares [4], e assim por diante, a qual foi conseguida com a ajuda de, e por sua vez, promoveu a identificação de diversos antigénios da superfície celular específicos de tumores, também conhecido como marcadores CSC. No caso do cancro colorrectal, vários marcadores de CSC foram identificadas, incluindo CD133 [5, 6], EpCAM /CD44 /CD166 [7], de CD24 /CD29 [8] e lgr5 [9, 10]. No entanto, pouco se sabe sobre o significado biológico destes marcadores, o qual pode ter fortes implicações na capacidade de diferenciação de multilinhagens CSC [8].

Entre os marcadores CSC colorrectais, lgr5, também conhecido como GPR49, é um orphan G-receptor acoplado a proteína (GPCR) que pertence à rica em leucina contendo repetição de GPCR [11]. Recentemente, foi relatado que lgr5 é positiva em células estaminais do intestino delgado, cólon e do folículo piloso [9, 12, 13], sugerindo potencial significado de lgr5 na biologia das células estaminais. Consistentemente, as células estaminais que expressam lgr5 eram capazes de construir estruturas organ�de in vitro, o que foi demonstrada experimentalmente no intestino [14-16], estômago [17] e no fígado [18]. Além disso, os ratos receptores com dois pontos superficialmente danificadas foram transplantados com Organóides derivadas de uma única célula-tronco Lgr5

+ cólon após extensa expansão in vitro, consequentemente formado criptas auto-renovação que eram funcionalmente e histologicamente normal, [15]. Pelo contrário, os ratinhos exibiram lgr5-nulo letalidade neonatal por anquiloglossia e distensão gastrointestinal [19]. A sobre-regulação de lgr5 tem sido relatada em muitos tumores sólidos humanos, tais como os carcinomas hepatocelulares [20, 21], do cólon [22], tumores do ovário [22], carcinoma das células basais [23] e do cancro gástrico [24]. Funcionalmente, a expressão aumentada lgr5 promoveu a proliferação de células de cancro e tumorigenicidade [23], enquanto que o silenciamento de lgr5 reduziu a proliferação, a migração e a formação de colónias, tumorigenicidade [25] e a apoptose celular induzida por [22]. Lgr5 é um alvo a jusante na via de sinalização Wnt-β-catenina [26]. Em animais intactos, lgr5 era uma parte de um ciclo de feedback negativo afinar a sinalização de Wnt durante a morfogênese intestinal. Lgr5 deficiência induzida a diferenciação precoce das células de Paneth, que é concomitante com a sobre-regulação de actividade de Wnt, implicando lgr5 é um regulador negativo da sinalização de Wnt em células progenitoras do intestino em desenvolvimento [27]. Além disso, os homólogos lgr5 são componentes facultativos do receptor de Wnt que medeiam o aumento do sinal de Wnt por proteínas solúveis de R-espondina [28].

O aumento evidências apontam para a importância de lgr5, em diferentes níveis Expressional, em vários paradigmas de doenças e estágios de desenvolvimento. No entanto, os mecanismos subjacentes à regulação expressional sobre lgr5 ainda permanecem ainda desconhecidos.

metilação do DNA tem sido demonstrada como um importante mecanismo epigenético para inativar genes durante a tumorigénese [29, 30]. Recentemente, existem pesquisas crescentes que revelam que a metilação de alguns genes regulam o desenvolvimento, progressão e a recorrência de tumores [31-33], de que incluem o cancro colorrectal [34]. No presente estudo, examinou-se o estado de metilação de ilhas de CpG dentro da região do promotor imediato do gene lgr5 em linhas celulares de cancro colo-rectal e tecidos tumorais, e analisada a sua associação com a diferenciação CSC, características clinicopatológicas, bem como o prognóstico dos doentes com colorrectal cancros.

Materiais e Métodos

cultura celular e tratamento

linhas celulares de cancro colorrectal (HCT116, SW480, HT29, LoVo, Colo205, SW620, SW1116) foram obtidas de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino a 10% (Sijiqing, Pequim, China). Para o tratamento de desmetilação, as células cultivadas foram incubadas com 3? M de 5-aza-2′-desoxicitidina (DAC, Sigma, St. Louis, MO) durante 72 h com meio mudado todos os dias. tratamentos com medicamentos simulados foram realizados em paralelo com PBS (pH 7,4).

amostras de tecidos humanos e as informações do paciente

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Southern Medical (Guangzhou, China) e consentimento por escrito foi obtido de todos os participantes. 169 pacientes (idade média de 57 ± 22,3 anos) foram diagnosticados com câncer colorretal esporádico no Departamento de Patologia (Nanfang Hospital, Southern University Medical) entre 1999 e 2001. Todos os diagnósticos foram estabelecidos com base em exames histológicos de secções padrão em HE, de acordo com as orientações da OMS. Os tumores foram encenado com base no sistema de estadiamento Dukes. Estes pacientes não receberam neoadjuvante radio-quimioterapia nem eles tem nenhum complicattions com outras doenças malignas conhecidas no momento do diagnóstico. Os pacientes morreram dentro de seis meses após a ressecção cirúrgica foram excluídos.

análise de transferência de Western

25 ug de proteína total foram incubados com tampão desnaturante (0,3 M de Tris pH 6,8, 10% de 2-mercaptoetanol, 40% de glicerol, 20% de SDS, 0,02% de azul de bromofenol) durante 5 min a 95 ° C, carregado num gel de 10% SDS-poliacrilamida para electroforese, transferidos para membranas de PVDF, bloqueadas em 5% de leite magro /TBS-Tween durante 1 h à temperatura ambiente e incubadas durante a noite a 4 ° C em anticorpo primário contra lgr5 (1: 500, Abcam, Cambridge, MA) ou um anticorpo de ratinho de alfa-tubulina (controlo interno, 1: 1000, Cell Signaling, Danvers, MA). As membranas foram depois incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano durante 1 h à temperatura ambiente. A imunorreactividade foi detectada por quimioluminescência (Pierce, Rockford, IL).

RT-PCR

O ARN total foi extraído com Trizol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 2 ug de ARN total foram submetidos ao a síntese de ADNc de primeira cadeia (Fermentas, Ontário, Canadá) de acordo com as instruções do fabricante. As sequências dos iniciadores de RT-PCR foram listadas na Tabela 1, com GAPDH usado como um controlo interno.

extração de DNA, metilação específicas de PCR (MSP) e seqüenciamento bissulfito PCR (BSP)

O ADN genómico foi extraído de linhas de células de tumores primários ou na sequência de um método de extracção com fenol-clorofórmio padrão (Qiagen, Valencia, CA). modificação bissulfito de ADN genómico foi realizada utilizando o kit EZ metilação do DNA (Zymo Research, Orange, CA). O padrão de metilação das ilhas de CpG dentro lgr5 promotor foi determinada por MSP usando ADN tratado com bissulfito como o modelo e os iniciadores de MSP listados na Tabela 1. Os iniciadores de MSP foram concebidos segundo o princípio de como descrito anteriormente [35] e testado para amplificar não não- DNA bisulfited. MSP foi conduzida a 95 ° C durante 10 min, seguido de 38 ciclos a 94 ° C durante 30s e 72 ° C durante 30 s, em seguida, por uma extensão de 5 min a 72 ° C. Os produtos de MSP foram então separadas em geles de agarose a 1,5% corado com brometo de ethiium e visualizados sob espectrofotómetro de UV. esboços de água foram utilizados como controlo negativo.

Para a sequenciação bissulfito, os iniciadores BSP (Tabela 1) foram usadas para amplificar um fragmento de 428 pb que cobre o promotor-exão 1 (-362 a +96) da região de lgr5 gene. Os primers BSP foram concebidos para não cobrir sites CpG. Os produtos de PCR foram então subclonados em pCR2.1-TOPO (Invitrogen) plasmídeos e o ADN de plasmídeo a partir de cinco clones bacterianos foram seleccionados para sequenciação de DNA de acordo com a anterior descrito [36].

Stem formação esfera e diferenciação celular

Para examinar a formação de esfera de células estaminais, 5 × 10

5 células HCT116 foram cultivadas em placa de cultura de 60 mm em suspensão em MEMD isento de soro /F12 (Gibco, Carlsbad, CA), suplementado com B27 ( 01:50, Invitrogen), 40 ng /ml de EGF (Sigma) e 20 ng /ml de FGF-2 (Chemicon, Billerica, MA), 100 U /ml de penicilina G, 100 ug /ml de estreptomicina (Gibco, Austrália). esferas CSC começou a formar cerca de duas semanas mais tarde. Para induzir a diferenciação CSC, as esferas CSC foram lavadas com PBS, três vezes e, em seguida, cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U /ml de penicilina G, 100 ug /ml de estreptomicina. ácido nuclear e proteína foram extraídos a partir destas células no dia 0, 1, 3 e 7, respectivamente, como descrito [37-39]. Todas as células foram cultivadas a 37 0C em uma atmosfera de umidade contendo 5% de CO2.

imunofluorescência (IF) e imuno-histoquímica (IHQ)

Para IF, esferas CSC foram fixadas com 4% de formaldeído em PBS durante 10 min à temperatura ambiente e depois permeabilizadas com PBS contendo 0,1% de Triton X-100. Depois de bloquear com 1% de albumina de soro de bovino durante 20 min à temperatura ambiente, as esferas CSC foram incubadas com rato primária CK20 anticorpo monoclonal (1: 300, Santa Cruz, CA) a 4 ° C durante a noite e, em seguida, com FITC-conjugado anti-coelho IgG (Santa Cruz).

Para IHC descrito como nossos métodos anteriores [40], cortes de tecido embebidos em parafina fixadas em formalina foram desparafinados em xileno e reidratadas com água destilada., e foi realizada a recuperação antigênica calor mediada com citrato pH 6.0 e o bloco com 3% de BSA. As lâminas foram subsequentemente incubados com o anticorpo lgr5 (1: 300, # 137484, Abcam) a 4 ° C durante a noite, com o sinal amplificado e desenvolvidos usando o sistema ABC e cromogénio substrato DAB (Maixin Bio, China), respectivamente, na sequência de contracoloração hematoxilina. A expressão foi considerada “positiva” quando 10% mais células cancerosas ou foram corados.

A transfecção de pequeno ARN interferente (siRNA)

A sequência de direccionamento para os nucleótidos específicos do siRNA lgr5 era 5 ‘ -GATCTGTCTTACAACCTAT-3 ‘e o siRNA mexidos sequência 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’ foi utilizado como controlo. Ambos os ARNic em cadeia dupla foram sintetizados por GenePharma (Xangai, China). A transfecção foi realizada utilizando o reagente de transfecção de Lipofectamina (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

A análise estatística

Para avaliar a correlação independente de metilação lgr5 com outras variáveis, análise de regressão logística foi realizada. Para análise de sobrevivência, método de Kaplan-Meier foi utilizado para avaliar a distribuição do tempo de sobrevivência em relação à metilação lgr5.

valor p

inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Lgr5 foi diferencialmente metilado em linhas celulares de cancro colorrectal

Para testar o potencial de a metilação do DNA na regulação da expressão lgr5, primeiro examinaram a expressão de lgr5 em sete linhas celulares de cancro colorrectal e a sua alteração em resposta a 5-aza-2′-desoxicitidina (DAC), o inibidor de metilação clássica. Como mostrado na Fig 1A e 1B, para HCT116, células SW480 e SW620, expressão lgr5 em ambos os ARNm de estado estacionário e os níveis de proteína foram regulados positivamente em resposta ao tratamento com DAC, sugerindo expressão lgr5 pode ser inibida nestas células através de metilação do ADN. Em contraste, a expressão em SW1116, LoVo, HT29 e células Colo205 não foi dramaticamente alterada após o tratamento DAC, o que implica uma irrelevância para os mecanismos envolvidos-metilação. Consistente com estas observações, foram detectados metilação completa da região do promotor de ilhas de CpG em células HCT116, metilação parcial em SW480 e SW620 e células sem a metilação em HT29, Colo205, células SW1116 ou LoVo (Figura 1C), por análise de MSP. A precisão do ensaio de MSP foi ainda confirmada com bissulfito de sequenciação (Figura 1D). Portanto, a expressão de lgr5 nestas linhas celulares de cancro bem correlacionada com o estado de metilação do promotor de ilhas de CpG, apoiando a metilação do DNA, como um mecanismo de regulação de nível lgr5.

. O ARN total foi extraído a partir de células indicados sem (-) ou com (+) tratamento de DAC e RT-PCR foi realizado para examinar o nível de ARNm em estado estacionário lgr5, com GAPDH como um controlo interno. B. O nível de proteína de lgr5 foi medido em todos os sete células de cancro colorrectal tratados como em A com a análise de Western blot. α-tubulina foi utilizada como um controlo interno. C. estado de metilação do ADN de uma ilha de CpG dentro da região proximal do promotor do gene lgr5 foi determinado com a análise de MSP. H, sinal de metilação; U, sinal unmethylation.

dd

H2O, a água que não contém DNA genômico. D. Densidade A metilação dentro da região proximal do promotor do gene lgr5 em sete linhas celulares de cancro colo-rectal foi determinada por análise de BSP. Painel superior, diagrama da distribuição dos locais de CpG dentro da UTR 5 ‘do gene lgr5. Cada barra vertical representa um site de CpG. painel inferior, a BSP de 14 locais de CpG dentro de -150 a 42 região relativamente ao local de estrela transcrição (TSS) em sete linhas celulares de cancro colorrectal. Cada linha representa um alelo clonado individual que foi sequenciado seguinte modificação DNA bissulfito. Os círculos representam locais CPG e seu espaçamento reflete com precisão a densidade CpG da região. círculo preto, local de CpG metilado; círculo branco, local CpG não metilado.

Lgr5 metilação correlacionado com diferenciação CSC- in vitro

Como relatado anteriormente, expressão lgr5 foi maior em células indiferenciadas, em comparação com células diferenciadas em câncer colorretal [9]. Para investigar o envolvimento de metilação do DNA lgr5 na diferenciação CSC, que deriva de haste do cancro ou células de linhagem de células HCT116 seguindo um modelo esferas como caule, como descrito [41] onde as células-tronco de câncer de mama foram enriquecidos por cultura em suspensão como esferas não aderentes. Duas semanas após a cultura em meio isento de soro contendo EGF e FGF-2, obteve-se esferas CSC a partir da linha de células HCT116 (Figura 2A, primeiro painel). Nenhuma expressão de citoqueratina 20 (CK20), um marcador para a diferenciação das células epiteliais, foi detectável nas esferas CSC por IF (Fig 2B, primeiro painel). Então, essas esferas CSC pode crescer em condição de suspensão, e gradualmente tornou-se apertado e mesclados (Fig 2, painel superior). Mas estas esferas foram incubadas com a Fig de soro contendo o meio em que eles gradualmente aderida à superfície da placa de cultura, que foi a característica de differenation cellsby dissociação de células a partir das esferas (Fig 2A, para baixo o painel), e a sobre-regulação de CK20 ( 2B) do dia 0 ao dia 7. concomitante com o processo de diferenciação, expressão lgr5 também foi reduzida por qPCR e western blot (Fig 2C e 2D). A infra-regulação da expressão lgr5 também bem correlacionada com um aumento significativo na densidade de metilação do promotor (Figura 2E).

. esferas CSC de linhas de células HCT116 cresceu com meio CSC sem soro (painel superior); Ou, esferas CSC mudado para meio normal com 10% FBS (para baixo do painel). Observação ponto de tempo: 1 dia, 3 dias. E 7 dias e fotografados em microscópio de luz. coloração B. imunofluorescência de CK20 nas esferas CSC; Verde indicaram coloração CK20. C. RNA foi coletado em diferentes ponto de tempo e foi analisada por qPCR em meio com 10% do grupo FBS. D. A proteína foi recolhido no ponto de tempo diferente, em meio com FBS a 10% do grupo, lgr5 foi detectado com a Western blot.westernblot α-tubulina foi utilizada como controlo interno. análise de E. BSP da densidade de metilação do promotor lgr5 nas esferas CSC e ponto de tempo em em meio com grupo FBS 10%. círculo preto, local de CpG metilado; círculo branco, local CpG não metilado.

Derrubar lgr5 induzida diferenciação das esferas CSC

Para examinar a relação causal entre a diminuição da expressão lgr5 e diferenciação das esferas CSC, nós transfectadas esferas CSC com -lgr5 específica siRNA. Em comparação com o controlo scrambled siRNA, ARNsi específicos de lgr5 reduziu significativamente a expressão lgr5 (Fig 3A, p 0,001). O tratamento de siARN também levou a sobre-regulação de CK20, bem como a dissociação das esferas CSC (Fig 3B). Isto é consistente com os fenótipos relacionados com a diferenciação CSC, o que sugere que a sub-regulação de lgr5 foi suficiente para induzir a diferenciação de esferas CSC.

. B.Expression de mRNA lgr5 e proteína nas esferas CSC transfectadas com siRNAwas quer mexidos ou específicos de lgr5 examinados por qPCR e Western blot (painel superior) coloração C. imunofluorescência de CK20 (verde) nas esferas CSC transfectadas como em A. Blue: DAPI mancha nuclear.

Lgr5 metilação foi detectável no câncer colorretal, mas não tecidos de cólon normais

em seguida, investigamos metilação do promotor do gene lgr5 em tecidos normais do cólon contra tecidos de cancro colorrectal. Como mostrado na Fig 4A e 4B, a metilação positivo foi apenas detectável em tecidos de cancro colorectal, mas não tecidos normais do cólon. análise de MSP no total de 169 cânceres colorretais revelou que 67 amostras (40%) foram positivos para metilação do promotor lgr5. Além disso, nós também examinaram a expressão lgr5 por expressão IHC.Lgr5 negativo foi associado com a metilação lgr5 no mesmo tecido pacientes com câncer pelo MSP. E baixa metilação ou expressão lgr5 unmethlation era, obviamente, superior a baixa metilação ou grupo unmethlation pelo MSP (Fig 4C). Há dados sugerem que a metilação lgr5 foi fechada à sua expressão.

A. MSP foi realizada sobre os tecidos normais de cólon (A) ou cancros colorectais primários. H, sinal de metilação; U, sinal unmethylation. B. expressão Lgr5 foi em tecidos de tecidos de cancro e normais, setas escuras representada a célula positiva em lgr5 por coloração imuno-histoquímica. N1 representada a um dos tecidos normais do cólon; T5 e T22 representados, respectivamente, os pacientes com câncer de cólon.

Lgr5 metilação negativamente correlacionada com o grau do tumor, metástase de tumor e positivamente com bom prognóstico do câncer colorretal

Para avaliar o significado clínico da lgr5 metilação, analisamos a associação entre o estado de metilação do promotor lgr5, conforme determinado pelo MSP, com uma variedade de características clínico-patológicas de pacientes com câncer colorretal (Tabela 2). Nós identificamos uma correlação inversa significativa entre a metilação positiva lgr5 e grau do tumor maior (p 0,001), envolvimento ganglionar positiva (p = 0,04) e metástases à distância positiva (p = 0,024), No entanto, conseguimos identificar nem outras características tais como a idade do paciente , sexo, posição tumor ou Dukes teste. As correlações reversas sugeriu que a metilação lgr5 foi relacionado ao câncer de um fenótipo menos invasiva,

i

.

e

., Maior o grau do tumor, linfonodo negativo e metástases à distância, que foi ainda apoiada por a análise de sobrevivência de Kaplan-Meier (Fig 5). Entre os 169 pacientes analisados, a taxa de sobrevivência de 100 meses foi significativamente maior nos casos com metilação lgr5 do que aqueles unmethylation (

p =

0,001). Estes resultados indicaram que lgr5 metilação foi um biomarcador preditivo independente para o bom prognóstico do câncer colorretal.

curvas de sobrevida de Kaplan-Meier para os pacientes agrupados com base no estado de metilação lgr5. linha sólida: câncer colorretal positivo para metilação lgr5, n = 67; linha pontilhada: câncer colorretal negativo para metilação lgr5, n = 102. HR: Rácio de perigo; IC 95%: 95% de intervalo de confiança

Discussão

Tissue auto-renovação é mantido por nichos de células-tronco.. O padrão de metilação dentro dos nichos regula-tronco renovação celular, afetando destino celular, a heterogeneidade, e assim por diante. Quando o equilíbrio desse padrão é perturbado, as células com fenotípica caule e alterações genéticas podem sofrer tumorigênese. Uma grande quantidade de evidências têm demonstrado que mudanças epigenéticas, como a hipermetilação de ilhas CpG dentro de regiões promotoras de vários genes, são prováveis ​​grandes contribuintes para a tumorigênese em uma ampla gama de tipos de câncer [42] e as costas da ilha de CpG nas sequências de até 2 kb distante foi fortemente associada com a expressão do gene no câncer de cólon [43]. Além disso, vários marcadores de superfície de células-tronco do câncer, também foram regulamentadas por metilação do gene. Furhtermore, estado hipermetilação foi relacionada com baixa ou nenhuma expressão e diferenciação celular, por exemplo, CD133 em cancro colo-rectal e glioma [44, 45], e EpCAM no cancro da mama [36]. No estudo atual, a hipótese de que a expressão lgr5 silenciados ou reduzida foi relacionada com CpG ilha metilação. Em apoio a esta hipótese, o tratamento com 5-aza-2′-desoxicitidina restaurado expressão lgr5 em um par de linhas celulares de tumores colorretais, com dramática sobre-regulação em células HCT116 que contêm lgr5 completamente metilado, e média ou nenhuma regulação positiva em outra célula linhas contendo lgr5 parcialmente ou quase não metilado. Além disso, o tratamento da DAC não alterou a expressão lgr5 em Melo publicou estudo [34] na linha de células SW620, mas um pouco aumento em nosso estudo atual. Analisamos lgr5 metilação em cerca de ~ promotor 1kb de lgr5, e pode haver algumas ilhas CpG em outras fragmento de 1 kb. Então, nós não podemos detectar a metilação lgr5 na linha de células SW620, mas a expressão lgr5 foi um pouco aumento após o tratamento DAC ou outra causa clara. Estes dados sugerem que a metilação do ADN desempenhou um papel importante na regulação da expressão lgr5.

Estudos anteriores mostraram que lgr5 desempenhou um papel fundamental na manutenção das propriedades de células-tronco intestinais e do cólon. Pouca ou nenhuma lgr5 expressão foi detectada em células diferenciadas. Em contraste, uma elevada expressão de CK20, um marcador de célula diferenciada, foi também encontrada em cancros diferentes [38, 46]. Consistente com estes resultados, os nossos resultados indicaram que a expressão lgr5 era alta em CSC-rectal, e reduzida diferenciação, que foi acompanhada por metilação de DNA aumentada e CK20 sobre-regulação. Além disso, derrubando lgr5 nas esferas CSC induzida diferenciação CSC. Estes resultados sugerem que a regulação negativa da lgr5, que resultou de metilação do DNA, foi responsável pelo fenótipo diferenciado da CSC.

Além disso, investigamos o significado clínico da metilação lgr5 no câncer colorretal esporádico. Percebemos que este não foi o primeiro estudo que olha em modificação epigenética de marcadores CSC. Tem sido relatado que a hipermetilação das ilhas de CpG localizados na região promotora do CD44 marcador de células estaminais /precursoras, um dos marcadores colorrectais e outra superfície de células estaminais do cancro, pode prever recorrência bioquímica em pacientes com cancro da próstata submetidos a prostatectomia radical [47] . A hipometilação de locais CpG em três promotores proximais determinada expressão CD133 em glioblastomas [42, 48] (delet: e hipermetilação de CD133 em HCT116 levou à formação de tumores de xenoenxerto em ratinhos nus, em comparação com células CD133 sem metilação). Curiosamente, observamos também que lgr5 foi mais frequentemente metilado em dois pontos cancro colorectal do que em dois pontos normais, e que a expressão lgr5 foi estritamente regulada por metilação. análise clínico-patológica desvendado a associação inversa da metilação lgr5 positiva com maior grau tumoral e invasão, de acordo com a noção de que a sobre-expressão de lgr5 foi associada com os cancros mais malignos e invasivos. Além disso, também descobrimos que a metilação lgr5 foi significativamente associada com melhor prognóstico entre os pacientes com câncer colorretal.

Foi relatado anteriormente que a perda de expressão lgr5 é visto em cerca de 40% câncer colorretal [22]. Em nosso estudo, observamos também metilação do promotor lgr5 positivo em aproximadamente 40% dos casos de câncer colorretal, e verificou-se que a expressão lgr5 negativo foi significativamente associada com a metilação do DNA promotor. Estes resultados implicam que lgr5 proporciona um equilíbrio entre a proliferação de células de cancro e diferenciação CSC. Portanto, a expressão lgr5 desregulado pode pender a balança para um mais transformado e fenótipo oncogénico, como observado em outros marcadores de células-tronco, Oct4 [49] De forma semelhante, a deficiência lgr5 no intestino delgado normal, leva a prematura diferenciação células de Paneth no intestino delgado [ ,,,0],27]. Neste estudo, identificamos um novo mecanismo para controlar a expressão de lgr5,

i

.

e

. através de metilação do promotor. Foi demonstrado que a regulação negativa da lgr5, como resultado de qualquer um dos tratamentos siRNA ou metilação do promotor, foi suficiente para induzir a diferenciação CSC. regulamentos semelhantes foram observados em outros marcadores de células estaminais, como Oct4 [49]. Tem sido sugerido que a metilação do ADN é eficaz no lugar para assegurar silenciamento deste gene durante o desenvolvimento do cancro potente. Hipermetilação dos resultados lgr5 na diferenciação de células-tronco do câncer. Como sabemos, as células diferenciadas não são capazes de potente auto-renovação e aresensitive à quimioterapia tradicional, de modo lgr5 metilação pode melhorar a quimioterapia, que é sensível à célula de cancro colorectal. No entanto, é de salientar que a metilação do DNA não é o único a heterogeneidade de células-tronco do câncer mecanismo regulador molecular. Outros mecanismos, tais como modificações das histonas, microRNA, remodelers cromatina e assim por diante [50], também pode funcionar durante a carcinogênese, que estão além do escopo deste estudo. O que é mais é que a metilação do DNA pode ter um crosstalk com outros caminhos ou regulamentação dos outros expressão gênica de sinalização. Melo [34]

et al

. relataram que a metilação do promotor de genes alvo Wnt é um forte indicador de recorrência de cancro colorectal, e que uma altamente mecanismo possível é que a inibição desses genes resultaram de metilação pode factual aumentar os níveis de actividade de Wnt e levar a progressão da doença e a recidiva através da activação de contudo alvos positivos desconhecidos. Por outro lado, a alta expressão Lgr5 estava relacionado com o mau prognóstico no câncer de cólon [51, 52]. Silenciamento expressão lgr5 poderia promover a apoptose de células de cancro do cólon e reduziram a metástase [22]. A metilação do promotor reduziu a expressão lgr5 em tecido de cancro do cólon e linhas celulares humanas em Melo et ai. relatório e em nosso estudo. Parecia que lgr5 metilação indicou o bom prognóstico e menor invasão, e os nossos resultados foi semelhante a esta. Houve um tanto diferente com Melo et ai. os resultados, que podem ser o enviesamento das nossas amostras. As amostras de metástase é de 31 (apenas 18,3%, 31/169) em nosso estudo, mas as amostras foram quase fase II no artigo Melo`s.

No geral, nosso estudo mostrou que espécie é responsável lgr5 metilação para o silenciamento do gene lgr5 e diferenciação de células-tronco do câncer no câncer colorretal. Além disso, a metilação lgr5 também é inversamente associado com alto grau do tumor e metástases à distância positiva. Além disso, pode servir como um marcador para prever melhor sobrevida em pacientes com câncer colorretal primário. Estes dados sugerem que o gene lgr5 silencingof através de CpG island methylation podem estar envolvidos na progressão da CRC e pode potencialmente servir como um alvo terapêutico (complementar à quimioterapia tradicional para o cancro colo-rectal). Mais estudos são necessários para elucidar os mecanismos regulatórios detalhados in vivo.

Informações de Apoio

S1 Data. Os dados para análise de sobrevivência (extended Fig 5)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0143513.s001

(XLSX)

Reconhecimentos

Nós gostaríamos de agradecer ao Dr. Shunhua Jin (Departamento de Gastroenterologia, Nanfang Hospital, Southern Medical University) para a assistência técnica MSP.