Abstract

Purpose

A ablação térmica (RFA) de hepática e tumores renais podem ser acompanhadas por não tumorigénese desejado no tumor residual, não tratada. Aqui, nós estudamos o uso de siRNA encapsulado em micelas para suprimir IL-6 mediada efeitos secundários locais e sistêmicas da RFA.

Métodos

Nós comparamos hepática padronizado ou renal RFA (laparotomia, 1 cm da ponta ativa a 70 ± 2 ° C durante 5 min) e sham procedimentos sem e com administração de 150nm de nanopartículas de micelas-like (MNP) anti-IL6 siRNA (conjugados DOPE-PEI, único IP dose de 15 min pós-RFA, C57Bl rato : 3,5 ug /100ml, Fisher 344 ratazana: 20 ug /200 ul), RFA /mexidos siRNA, e RFA /vazia MNPs. As medidas de avaliação: infiltração local periablational celular (α-SMA + células estreladas), a proliferação de hepatócitos regional, soro /tecido níveis de VEGF de IL-6 e na 6-72hr, e o crescimento do tumor distante, a proliferação do tumor (Ki-67) e a densidade microvascular ( MVD, CD34) em modelos de adenocarcinoma de mama subcutâneos R3230 e MATBIII aos 7 dias.

resultados

Para fígado RFA, adjuvante MNP anti-IL6 siRNA reduziu os aumentos induzidos RFA no tecido IL-6 níveis , a infiltração α-SMA + de células estreladas, e proliferação de hepatócitos regional para a linha de base (p 0,04, todas as comparações). Além disso, o adjuvante MNP anti-IL6- siARN suprimido o aumento do crescimento do tumor distante e Ki-67 observada em tumores R3230 e MATBIII poste RFA hepática (p 0,01). Anti-IL6 siRNA também reduziu a elevação induzida por RFA em VEGF e MVD do tumor (p 0,01). Da mesma forma, os aumentos renais induzidas RFA no soro IL-6 níveis e crescimento distante tumor R3230 foi suprimida com anti-IL6 siRNA (p 0,01).

Conclusões

adjuvante encapsulados em nanopartículas siRNA contra IL-6 pode ser usado para modular os efeitos locais e regionais da RFA hepática para bloquear potenciais efeitos pró-oncogênicos indesejadas de RFA hepática ou renal no tumor distante

Citation:. Ahmed M, Kumar G, Navarro G, Wang Y, Gourevitch S, Moussa MH, et al. (2015) Drugs Systemic siRNA nanopartículas com base em Combinados com Ablação por Radiofreqüência para terapia do câncer. PLoS ONE 10 (7): e0128910. doi: 10.1371 /journal.pone.0128910

editor: Yi-Hsiang Huang, da Universidade Nacional Yang-Ming, TAIWAN

Recebido: 19 Março, 2015; Aceito: 01 de maio de 2015; Publicação: 08 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Ahmed et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do manuscrito

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional do Câncer (CCNE 1U54CA151881-01 VPT, SNG, MA, TL), Sociedade Radiológica da América do Norte Pesquisa e Education Foundation (RSD1215, MA), Harvard Medical Faculdade Médicos Faculdade Radiologia Foundation (MA), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SF8841, EG), o Centro israelense de Excelência I-CORE (EG), ea Israel Science Foundation (por exemplo, SNG). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

tem havido muito interesse recente no uso de RNA de interferência ( “gene silenciamento pós-transcricional ‘) e, particularmente, pequenos RNAs de interferência (siRNA) em terapias contra o câncer. Esta concentrou-se principalmente em qualquer modulação das respostas de proteínas celulares para melhorar a eficácia de farmacológico primário terapias /oncológicas [1,2], aumentando a imunidade anti-tumor através de knockdown selectiva da resposta imune suprimindo proteínas, ou quimio-sensibilização por meio de silenciamento de genes do receptor do factor de crescimento [3-6]. Para superar as limitações na entrega com siRNA livre em

in vivo

sistemas, siRNAs têm sido comumente administrado utilizando portadores de nanopartículas (como lipossomas, micelas, ou ligado a partículas) para maximizar essencialmente

passiva

tecido entrega (embora em concentrações mais elevadas) para os órgãos e tumores primários alvo [7-11]. No entanto, mesmo auxiliado por entrega nanocarrier, os desafios para a entrega intra-tumoral e alvo da droga persistem [1,3]. Além disso, alguns estudos têm utilizado adjuvante siRNA em conjunto com paradigmas não farmacológicas, como a modulação tecido ou respostas fisiológicas após a cirurgia, intervencionista, ou tratamentos de radiação.

guiada por imagem ablação do tecido térmica por radiofreqüência, microondas ou energia laser para criar a alta temperatura local (60-100 ° C) de aquecimento em torno de um aplicador percutâneos está agora em uso clínico generalizado para tratar tumores focal do fígado, pulmão, rim e osso ( 100.000 casos /ano no mundo) [ ,,,0],12]. Bem sucedido de ablação completa do tumor também exige a inclusão de um aro de 5-10 mm de parênquima normal como uma “margem ablativo ‘para assegurar a erradicação completa do tumor [13]. Na tentativa de assegurar a completude de tratamento, que mostraram que a administração de mesmo uma única dose de carregadas com droga de quimioterapia de nanopartículas simultaneamente com a ablação por RF pode conduzir a um aumento na entrega de drogas periablational local (até 10 vezes), com o resultante aumento destruição do tumor, aumento da sobrevivência extremidade animal, e maiores quantidades de destruição do tumor em pacientes com tumores hepáticos [14-16]. Recentemente, temos alavancado ainda mais com sucesso esta entrega focal melhorada para direcionar respostas teciduais induzidas RFA específicas (tais como aumento da intercalação de ADN ou suprimir a produção de HSP) [16,17].

Uma série de estudos têm demonstrado que a sub- letal aquecimento tecido inferior (40-47 ° C) em torno da zona de ablação incita múltiplas reacções tecidual secundária [18], incluindo o aumento da citocina inflamatória (tal como IL-6 e IL-10) [19] e do factor de crescimento (tais como HGF, HIF-1α e VEGF) [20-22] de produção; infiltração de sequestrante e células imunogénicas para o tecido periablational [23]; e hipertermia induzida por aumentos na permeabilidade vascular e leakiness endotelial [24]. Em particular, estudos recentes têm demonstrado que o aumento da produção de interleucina-6 sérica após a ablação térmica de fígado normal (simulando o endpoint clínico de ablação de todo o tumor no fígado e sua “margem de ablativo ‘de fígado circundante normal) é um motor importante da infiltração periablational de células inflamatórias e imunogênica, tais como macrófagos e actina de músculo (SMA), as células alfa-suave positivos hepáticas estreladas [23,25]. Estes, por sua vez, pode produzir a activação adicional de vias pró-crescimento a jusante, tais como citocinas no HGF /c-Met via, e aumento da proliferação de hepatócitos no fígado-processos não tratadas que são marcadamente reduzidas nos níveis de IL-6 ratinhos knockout [25]. Dado que o sucesso da ablação completa do tumor também exige a inclusão de um aro de 5-10 mm de parênquima normal como uma “margem ablativo ‘para assegurar a erradicação completa do tumor [13], estudando esses efeitos sistémicos secundários de ablação por RF no tecido do órgão normal é imperativo . A necessidade de um estudo mais aprofundado é suportada por recentes estudos demonstrando experimental, ‘off-target’ estimulação do crescimento do tumor distante após a ablação térmica de fígado e tecido renal e estudos clínicos que sugerem uma maior incidência de nova HCC após a ablação por RF hepática (aproximando-se 80 % em 5 anos) em comparação com pacientes comparativos tratados com un cirróticos (22-50%) [26-29]. Aqui, construímos na nossa experiência anterior, utilizando entrega de drogas mediada por nanopartículas preferencialmente orientada para o rebordo periablational para estudar se poliméricos micelas como nanopartículas (MnPs) carregados com anti IL6-siARN pode ser utilizado para suprimir a produção térmica induzida por ablação de IL-6 , IL-6 mediado por infiltração periablational de células, proliferação de hepatócitos no fígado não tratado, e RF jusante estimulação induzida por ablação de IL-6-mediada do crescimento do tumor distante.

instrução Ética Materiais e Métodos

Todos os estudos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética em Beth Israel Deaconess Medical Center animal Care Institucional e Comitê de Uso e Universidade hebraica Hadassah Medical School Cuidado Institucional animal.

modelos

animais

Para todos os experimentos e procedimentos, a anestesia foi induzida com injeção IP de uma mistura de cetamina (50 mg /kg, Ketaject; Phoenix Pharmaceutical, St. Joseph, MO) e xilazina (5 mg /kg, Bayer, Shawnee Mission, KS). Os animais foram sacrificados com uma overdose de dióxido de carbono, usando SMARTBOX CO

System 2 Câmara (sistemas EZ, Palmer, PA), seguido por punção cardíaca.

Os experimentos foram realizados em camundongos C57Bl normais (40 ± 10 g), ou duas linhas de células de adenocarcinoma de mama (R3230 ou MATBIII) implantado por via subcutânea em mulheres ratos Fisher 344 (150 ± 20g; 14-16 semanas de idade, Charles River, Wilmington, MA) [30]. A linha de tumor adenocarcinoma de mama R3230 é uma linha bem caracterizado que temos vindo a utilizar durante mais de 10 anos [30]. A linha de tumor MATBIII foi obtido a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). implante, a avaliação, e técnicas de preparação dos tumores foram realizados como previamente descrito [30]. Resumidamente, um tumor foi implantado em cada animal por injecção lentamente 0,3-0,4 ml de suspensão de tumor para a almofada de gordura mamaria de cada animal através de uma agulha de calibre 18. Os tumores foram medidos a cada 1-2d até atingirem 6-7 mm altura em que eles foram incluídos nos estudos.

Aplicação de ablação por RF

Convencional monopolar RFA foi aplicado usando um 500-kHz RFA gerador (modelo 3E; Radiónica, Burlington, MA), como foi anteriormente descrito [30]. Resumidamente, o órgão-alvo foi exposto por laparotomia usando um subcostal (fígado) ou incisão (rim) lateral, em condições estéreis, enquanto o animal foi anestesiado. A ponta de 1 cm de um calibre 21 eletrodo isolados eletricamente (eletrodo SMK; Cosman Medical Inc, Burlington, MA) foi colocado no fígado e no rim. Para os animais tratados com ablação térmica, a energia RF foi aplicada durante 5 minutos com a saída do gerador titulada para manter uma temperatura da ponta designado (70 ± 2 ° C). Este método normalizado de aplicação de RF tenha sido demonstrado anteriormente para proporcionar volumes de coagulação reprodutíveis com a utilização deste sistema RFA convencional [30,31]. Para completar o circuito de RF, o animal foi colocado sobre uma almofada de terra metálica normalizada (Radiónica). Para os animais tratados com sham ou um agente sozinho, o eletrodo foi colocado, mas nenhuma energia foi administrada.

nanopartículas siRNA formulação

Todos os materiais foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) a menos que indicado de outra forma. polietilenimina ramificada (PEI) com um peso molecular de 1,8 kDa foi adquirido na Polysciences, Inc (Warrington, PA). 1,2-disrearoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi (polietileno glicol) -2000] (PEG-PE de 2 kDa) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- (glutaril ) (glutaril-PE) foram adquiridos a Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). água isenta de nuclease foi adquirido de Qiagen (Germantown, MD). Todos os ARNic em cadeia dupla são da Dharmacon (Lafayette, CO). As sequências sintetizadas de ARNsi de segmentação de IL-6 foram: 5′-AGUCGGAGGCUUAAUUACAdTdT-3 ‘(sentido), 5′-CAGGAAAUUUGCCUAUUGAdTdT-3′ (sentido) e 5’-UAAGGACCAAGACCAUCCAdTdT-3 ‘(sentido) [32,33]. Um siRNA corrida foi utilizado como controle negativo. A seqüência de controle não-targeting siRNA foi (sentido) 5’-AGUACUGCUUACGAUACGGdTdT-3 ‘[34].

nanopartículas de micelas-like foram selecionados como o veículo de entrega com base em trabalhos anteriores demonstrando a cinética de entrega temporais benéficos (6 -12hr) e uma maior penetração intersticial nos tecidos que rodeiam a zona de ablação [35]. Construímos nanopartículas micelares-like (MNPS) com base em fosfolipídios conjugados-polietilenoimina modificada (DOPE-PEI). O conjugado de DOPE-PEI e os complexos de DOPE-PEI /siRNA foram preparados como anteriormente descrito [34]. Temos demonstrado anteriormente que conjuga DOPE-PEI com base no baixo peso molecular PEI auto-montadas dentro de estruturas micelares que condensados ​​siRNA, mostraram alta eficiência de transfecção e tinha um perfil de toxicidade melhor do PEI 25 kDa e Lipofectamine (DNA comumente usado /reagentes de transfecção siRNA) [11]. Nós incorporamos PEG-PE nos portadores de alcançar um melhor desempenho

in vivo

. As interacções hidrofóbicas entre as porções lipídicas em DOPE-PEI e aqueles em PEG-PE resultou na sua auto-montagem em partículas de micelas, como com um tamanho médio de 150 nm e proporcionar alguma estabilização estérica de complexos, formando uma barreira protectora e promover o aumento estabilidade

in vivo

. Os complexos /siRNA DOPE-PEI foram preparadas por mistura de volumes iguais de DOPE-PEI com ARNsi-IL-6 (piscina equimolar de 3 sequências) ou precipitação siRNA para uma razão E /P final de N de 16. A solução siARN foi transferido para o solução de polímero, misturou-se por pipetagem vigorosa e incubou-se durante 15 min. A proporção de polímero /siARN foi expressa como o azoto /fosfato (N /P), e calculada assumindo que 43 g /mol corresponde a cada unidade de repetição de PEI contendo uma amina e 316 g /mol corresponde a cada unidade de repetição de siRNA contendo um fosfato. Então, uma película de lípido previamente liofilizada de PEG-PE foi hidratado com os complexos e deixada em repouso à temperatura ambiente durante 1 h com intermitente agitando o PEG-PE2kDa: proporção em peso de DOPE-PEI foi de 2: 1 [36]. formulações vazios foram preparadas pela hidratação do filme com apenas solução de polímero. Cada rato recebeu uma dose de 3,5? G de siRNA em um volume de formulação final de 100 uL. Cada rato recebeu uma dose de 20? G de siRNA em um volume de formulação final de 200 uL. Cada dose foi administrada por injecção intraperitoneal (IP) em pontos de tempo seleccionados conforme especificado acima.

colheita Tumor

Os animais foram sacrificados em horários especificados acima descritos utilizando a eutanásia dióxido de carbono. O tecido-alvo (sítio primário de ablação, lobo do fígado não tratado, ou tumor distante) foi colhida, e seccionados perpendicularmente à direcção de inserção do eléctrodo [17,30]. tumores distantes foram também colhidas e seccionados. Todas as amostras foram fixadas em formalina a 10% durante a noite a 4 ° C, embebidos em parafina e seccionados a uma espessura de 5 um. Os tecidos foram coradas com H . E para a patologia grave

quantificação dos níveis de IL-6 e VEGF

soro e tecido níveis de IL-6 (Mouse /M