Abstract

Objetivo do estudo

Para avaliar a frequência de MRE11 /RAD50 /NBS1 (MRN) perda complexo n da expressão da proteína em cânceres de endométrio (CE) e para determinar se a perda de MRE11 torna as células cancerígenas sensíveis a poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) tratamento -inhibitory.

Métodos

MRN expressão foi examinada em 521 amostras de carcinomas endometriais e na célula 10 cancro linhas. Um ponto de acesso mutação putativa sob a forma de um alelo intrónica poli (T) na MRE11 foi sequenciado em casos seleccionados (n = 26). Sensibilidade ao inibidor de PARP-, BMN673 foi testado em ensaios de formação de colónias, antes e após o silenciamento MRE11 utilizando siARN. reparação de recombinação (HR) DNA homóloga foi avaliada por ensaio de formação de RAD51-focos após irradiação e tratamento medicamentoso.

Resultados

A perda de proteína MRE11 foi encontrado em 30,7% dos tumores CE e significativamente associada com perda de RAD50, NBS1 e expressão da proteína de reparo incompatível. Uma linha de células do endométrio mostrou uma expressão MRE11 marcadamente reduzida devido a uma mutação homozigótica poli (T) de MRE11, exibindo desse modo um aumento da sensibilidade à BMN673. esgotamento MRE11 sensibiliza MRE11 expressar linhas celulares da CE para o tratamento com BMN673. O aumento da sensibilidade à inibição de PARP-correlaciona-se com a formação de focos RAD51 reduzida sobre a radiação ionizante em células empobrecido-MRE11.

Conclusão

perda da proteína MRE11 prevê sensibilidade à sensibilidade de PARP-inibidor in vitro, definindo-a como um gene letal sintética adicional com PARP. A elevada incidência de perda MRE11 em ECs podem ser potencialmente explorados para a terapia de PARP-inibidor. Além disso, a expressão da proteína MRE11 utilizando imuno-histoquímica pode ser investigado como um biomarcador preditivo para o tratamento PARP-inibidor

Citation:. Koppensteiner R, Samartzis EP, Noske A, von Teichman A, Dedes I, Gwerder M, et al. (2014) Efeito da MRE11 Perda na PARP-Inhibitor Sensibilidade no câncer de endométrio

In Vitro

. PLoS ONE 9 (6): e100041. doi: 10.1371 /journal.pone.0100041

editor: Sue Cotterill, St. Georges University of London, Reino Unido

Recebido: 10 de novembro de 2013; Aceito: 21 de maio de 2014; Publicação: 13 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Koppensteiner et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi parcialmente financiado pela Fundação Müller Julius e Zurique Cancer League. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer endometrial (CE) é a quarta neoplasia maligna mais comum entre as mulheres. A maioria das células endoteliais são diagnosticados em fase inicial e está associada com o prognóstico em geral muito favorável [1]. As opções de tratamento, no entanto, para avançado, recorrente ou metastático ECs, são limitados e consistem principalmente de quimioterapia citotóxica [1]. tratamentos direcionados potenciais estão sob investigação clínica, mas ainda não foram incorporadas no uso clínico de rotina [2].

CE é uma doença heterogênea, com histológica distinta e características moleculares [2]. Até agora, CE foram classificados em tipos I e II. Isto baseia-se nas diferentes propriedades histológicos (endometrióides versus não-endometrióide) e no prognóstico clínico (favorável versus fraco) [2], [3]. Além disso, alterações moleculares distintas ocorrem preferencialmente em qualquer tipo I ou tipo II CE (revisto em [2]). Considerando que os tumores do tipo I são caracterizados por instabilidade microssatélite (MSI) e polymutations em diferentes tipos de genes, quase todos os tumores de tipo II abrigar as mutações do gene supressor de tumores

TP53

[4]. Recentemente, novos subgrupos moleculares têm sido descritos de uma maneira semelhante à do cancro da mama [5]. Com base no seu perfil de mutação e cópia-número muda ECs são classificados em:. A ultramutated, o hypermuted, o baixo número de cópias eo número de cópia de alta subgrupo [5]

O subgrupo hipermutada inclui principalmente endometrioid CE, todos instabilidade de microssatélites guarida (MSI). Estes tumores são conhecidos para desenvolver mutações em vários outros genes (genoma hipermutada), mas também aqueles que estão envolvidos no DNA dupla interrupção fio (DSB) maquinaria de reparo [6]. Um dos mutação recorrente mais comum é encontrado na

genes MRE11

, cujo produto é parte da MRE11-RAD50-NBS1 (NRM) – complexa que está envolvido na detecção e reparação do ADN de cadeia dupla quebras (LAP) [7], [8].

MRE11

mutações germinativas que causam um fenótipo letal em camundongos [9] são raramente encontrados em humanos e levar a um transtorno de Ataxia Telangiectasia-like (ATLD) [10]. mutações somáticas no

MRE11

, no entanto, são frequentemente detectada em cancro colorectal com MSI e também foram sugeridos para MSI-positiva ECs [11]. As mutações da sequência poli intrônica (T) de

MRE11

entre exons 4 e 5 são eventos frequentes em MSI positiva colorectal und ECs [11], [12]. Em CE, MSI está presente em mais de 20% de tumores e é causada principalmente por silenciamento do gene epigenético MMR

MLH1

[13]. Isto leva a alterações no número de repetições de nucleótidos encontradas em elementos de codificação e não codificantes de muitos genes, tais como

MRE11

[14].

letalidade sintético ocorre quando duas mutações que ocorrem individualmente não têm efeito na viabilidade celular, mas causam a morte celular em combinação [15], [16]. A inibição de um gene sintético parceiro letal em células de cancro apresentando uma mutação letal sintético pode ser uma estratégia atractiva para o desenvolvimento de drogas específicas anti-cancro com efeitos colaterais mínimos em tecido saudável. Estudos recentes revelaram que o câncer com perda de função

BRCA2

demonstram sensibilidade a Poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) -inhibitors [17], [18] BRCA1

ou. Dado que MRE11 está envolvida na reparação de DSB de ADN por meio da introdução do número-complexo, a perda de função deste complexo através de mutações de inactivação pode conduzir a sensibilidade a inibidores de PARP-[19]. PARP1, uma enzima de reparação de ADN, tem sido implicada na reparação de DSB. inibição de PARP leva a apoptose ou senescência em células em que a reparação do ADN por recombinação homóloga (RH) é prejudicada (letalidade sintética). Para este estudo foi utilizado um potente PARP1-inibidor selectivo BMN673, que tem mostrado resultados muito animadores na fase I /II de ensaios [20].

Aqui nós mostramos que a MRN é perdido freqüentemente na CE, o que leva a um aumento da sensibilidade inibidor de PARP. Isto pode ser explorado para o tratamento de pacientes com perda de abrigar CE do MRN-complexo. O objetivo deste estudo é mostrar a frequência da perda de MRE11 e MRN-complexo na CE e se isso leva a um aumento da sensibilidade à PARP inibidores explorando

MRE11

como um potencial gene letal sintética.

Materiais e Métodos

Tissue microarrays

Tissue microarrays (TMAs) com carcinomas do endométrio fixados em formalina e embebidos em parafina foram construídos anteriormente [21]. Duas coortes de Institutos de Patologia Cirúrgica, Universidade Hospitais Basel e Zurique (Suíça) contendo 339 (Basel-TMA) e 182 amostras de câncer (Zurich-TMA) foram incluídos neste estudo. As características clínicas e patológicas foram retirados dos bancos de dados clínicos e registros de patologia. secções hematoxilina e eosina de rotina foram realizados para avaliação histopatológica. O estágio do tumor foi avaliada de acordo com a Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO) e sistema de estadiamento TNM. subtipo histológico e grau do tumor foram definidos de acordo com a classificação da OMS 2003. dados de acompanhamento são conhecidos a partir de 480 pacientes. O tempo médio de acompanhamento foi de 31,5 meses (variação, 1-184) para a coorte de Basel, e 45 meses (variação, 1-124) para a coorte de Zurique. Os pacientes com doença localizada foram tratados por histerectomia e salpingectomy bilateral (com ou sem linfadenectomia pélvica e paraaórtico). terapia de radiação pós-operatório vaginais foi administrado quando a invasão do miométrio ou o grau do tumor 3 foi evidente. O estudo foi aprovado por ambas as coortes pelo comitê de ética científica local (KEK-ZH-NR: 2010-0358). As características basais dos pacientes com CE são resumidos na tabela 1.

Imunohistoquímica

Depois de recuperação antigênica, as lâminas foram incubadas com os seguintes anticorpos: MRE11 (clone 31H4, sinalização celular, sem . 4847, 1:500), RAD50 (13B3 /2C6, Abcam limitada, não. ab89, 1:500), NBS1 (sinalização celular, não. 3002, 01:50), MLH1 (G168-15, PharMingen, Becton Dickinson , 1:100), MSH2 (25D12, Novocastra Lab. Ltd, 1:100), PMS2 (A16-4, PharMingen, Becton Dickinson, 1:300) e MSH6 (44, BD Biosciences, 1:500). Após incubação durante 1 hora à temperatura ambiente, a coloração de MRE11, RAD50, e NBS1 foi ainda realizada com o sistema automatizado de Referência Ventana (Ventana Medical Systems, EUA), utilizando reagentes Ventana, bem como kit de detecção UltraMap DAB. Os anticorpos contra as proteínas de reparação de emparelhamentos incorrectos foram incubadas durante 30 minutos e o procedimento de coloração foi realizada com o sistema de ligação de Leica automatizado usando bond Polímero Refinar Detection Kit (Leica Biosystems). A análise da expressão foi realizada por dois patologistas (AN, Kl). A imunorreactividade nuclear de MRE11, RAD50, e NBS1 foi pontuado como: negativo (0), fraca (1), moderado (2) e forte (3). A expressão de proteínas dos genes de reparo foi considerado como positivo quando coloração nuclear foi evidente. células estromais que mostram coloração nuclear foram utilizados como controle positivo.

linhas celulares de cancro e condições de crescimento

As linhas celulares CEE Hec-108 [22] e Hec-116 [22] foram cultivadas em MEM, HEC 1A (ATCC) em meio de McCoy, EFE-184 (DSMZ) em meio RPMI, AN3CA (ATCC) em DMEM, ARK-II [23] em DMEM, SNG-II [24] em DMEM, ECC-1 [25] em RPMI 1640, e foram um presente de Uwe Schirmer, DKFZ. HEC6-ST3 [22], cultivadas em MEM, e KLE (ATCC), cultivadas em DMEM /F-12, eram um presente de Jaqueline Galeas, UCSF. Os meios foram suplementados com 10% (meio para ECC-1 com 5%) (v /v) de soro bovino fetal e quer com penicilina (100 U /ml) /estreptomicina (60 mg /ml) ou antibiótico-antimicótico e mantida a 37 ° C numa atmosfera humidificada a 5% de CO2. Todo o material da cultura celular foi comprado de Gibco pela Life Technologies.

Immunoblotting

extractos de proteínas de células inteiras foram preparados a partir de células lisadas com um tampão de lise SDS. Western blot foi realizada com anticorpos primários contra MRE11 (D151, presente de Steve Jackson, Cambridge), RAD51 (anticorpo policlonal de coelho, Santa Cruz Biotechnology), NBS1 (anticorpo monoclonal de ratinho, GeneTex), beta-tubulina (anticorpo monoclonal de murganho, Sigma) . A incubação com o anticorpo primário foi seguido de incubação com um anticorpo secundário conjugado com HRP (anti-ratinho e de HRP anti-coelho a partir de Sigma, anti-HRP de ovelha SantaCruz) e detecção quimioluminescente de proteínas (Amersham).

MRE11 análise de Mutantes

Treze MRE11 imuno-histoquímica (IHQ) amostras negativas e positivas 13 IHC foram escolhidos a partir da coorte de Zurique por

MRE11

análise de mutação. Três cilindros de tecido (diâmetro 0,6 mm) foram perfurados a partir de cada bloco de parafina para extração de DNA. O ADN genómico foi extraído utilizando o DNeasy Blood Kit de tecido (Qiagen, Hilden, Alemanha). As concentrações dos ácidos nucleicos obtidos foram medidos utilizando o Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). O PCR foi realizado como anteriormente descrito (Grannini et al., 2002) com uma ligeira modificação. Apenas 50 ng de ADN genómico foram amplificados por PCR. A sequenciação de ADN foi realizada utilizando o kit de sequenciação do ciclo BigDye Terminator v1.1 (Applied Biosystems). As sequências obtidas foram analisadas para mutações no poli (T) Região 11 repeat dentro do ser humano

MRE11

intron 4 (Tabela 2).

Colony ensaios de formação de

ensaios de sobrevivência a longo prazo foram realizados conforme descrito anteriormente [26]. Em resumo, as células foram semeadas em placas de seis poços em triplicado a uma concentração de 300-2000 células por cavidade e tratadas com o inibidor, após 24 horas, sendo continuamente expostas ao fármaco (10-11 a 10-6 M) dissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO) (controlo: DMSO). Mídia e drogas foram substituídas a cada 3 a 5 dias. Após 10 a 15 dias, as células foram fixadas com TCA a 10% e coradas com sulforrodamina B (SRB) (Sigma) e um ensaio colorimétrico foi realizado como descrito anteriormente [26]. O inibidor de PARP BMN673 foi um presente da BioMarin Pharmaceuticals, EUA. Mirin foi comprado de Calbiochem.

siRNA E Transfec�es

Para derrubar humana

MRE11

usamos três siRNAs diferentes (Microsynth, Suíça) usando RNAimax (Gibco pela Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. As sequências alvo (sentido) foram: GCUAAUGACUCUGAUGAUATT [27], GAGCAUAACUCCAUAAGUATT [28], e GAUGCCAUUGAGGAAUUAGTT [29]. Como um controlo, as células foram transfectadas com ARNsi contra luciferase (de sentido): CGUACGCGGAAUACUUCGATT. As células foram semeadas 48 horas após a transfecção e o tratamento começou 72 horas após a transfecção (inibidor de PARP, irradiação).

Análise de Formação de focos RAD51

focos Rad51 nuclear foram visualizados e quantificados como descrito anteriormente [26 ] e utilizados como marcadores substitutos para a indução de DSB de ADN e de reparação do ADN competente RH, respectivamente. Em resumo, as células foram cultivadas em lamelas (12 mm, Thermo Scientific) e expostas a 10 Gy de IR. Depois de 4-6 horas de recuperação, as células foram fixadas, permeabilizadas e imunocoradas com anticorpos primários contra RAD51 (anticorpo policlonal de coelho, Santa Cruz) e detectada com farinha Alexa 488 (Invitrogen). Os núcleos foram contrastadas com 4 ‘, 6-diamidino-2- fenilindol (DAPI). A presença de focos RAD51 foi avaliado em um mínimo de 100 células em três experimentos independentes com um microscópio invertido de fluorescência automatizado (LEICA-DMI6000 B).

Análise Estatística

A avaliação estatística foi realizada com o software SPSS 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Os dados de pontuação de MRE11, RAD50 e NBS1 foram dicotomizadas em “negativo” (sem expressão) e (expressão fraca, moderada ou forte) “positivo”. A significância estatística da associação entre essas moléculas, e a expressão da proteína de reparo incompatível, bem como os parâmetros clínico foi avaliada por Chi

2 de teste para as tendências e teste exato de Fisher. Além disso, a correlação de Spearman foi utilizado para avaliar a associação entre MRE11, RAD50, NBS1 e proteínas de reparo incompatível. A probabilidade de sobrevivência global como uma função do tempo foi determinada pelo método de Kaplan-Meier. As diferenças nas curvas de sobrevida foram comparadas pelo teste de log rank. curvas de sensibilidade foram calculados em GraphPad Prism versão 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, EUA) e diferenças estatísticas entre os valores de IC50 foram avaliados através de F-testes. Geralmente, os valores de p menores que 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

Expressão MRN-complexo e a associação com Incompatibilidade Estado Reparação de proteínas e clínicopatológicos Fatores

A análise imuno-histoquímica de MRE11 , RAD50, e NBS1 foi bem sucedido em 456, 466, 458 e carcinomas endometriais, respectivamente, devido à falta de tecido de tumor em alguns pontos do TMA. Todas as moléculas mostraram um padrão de coloração nuclear. Entre os 521 doentes carcinomas endometriais 30,7% (132/430) mostrou uma perda completa de MRE11 (Fig. 1A, e a Tabela 1). perda de expressão de MRE11 significativamente correlacionada com a perda de proteína dos outros membros da MRN-complexas RAD50 e NBS1. A perda de qualquer proteína-MRN complexo também foi significativamente associado com a expressão da proteína reparação de emparelhamentos incorrectos, bem como com o estágio FIGO e graduação histológica (Tabela 3). Na análise de Kaplan-Meier, estágio FIGO, subtipo histológico, classificação e idade do paciente foram fatores prognósticos (log rank, valor de p 0,0001 para todos os parâmetros). No entanto, a expressão da proteína de MRE11 (rank, p = 0,867 log), Rad50 (log rank, p = 0,986) e NBS1 (log rank, p = 0,991) não foi associado à sobrevida global. Além disso, a sequenciação do poli (T) 11 alelo do

MRE11

no ADN genómico de tumores CE (n = 26; Tabela 2) mostrou que as mutações foram mais frequentes nos tumores com perda de MRE11 do que naqueles MRE11 expressando , mas o estado de mutação não foi altamente preditiva para o status de proteína de MRE11

a, negativo (perda completa da expressão da proteína MRE11.); B, + (expressão nuclear fraca); C, ++ (expressão nuclear intermédio); D, +++ (expressão nuclear forte).

Perda de MRE11 está associada com alta sensibilidade ao PARP Inibição

Entre um painel de linhas celulares CE, AN3CA exibiram perda de proteína MRE11 quase completa, bem como os níveis marcadamente reduzidos de RAD50 e NBS1 (Fig. 2A). A sequenciação da região intrónica de MRE11 nesta linha celular confirmou a poli anteriormente descrito homozigótica (T) 9 mutação no AN3CA (Fig. 2B) [11]. Sob tratamento PARP-inibidor com BMN673, AN3CA mostra a maior sensibilidade entre o painel de linhas celulares de cancro endometrial testados (Fig. 3C)

A, Western blot demonstrando o status de MRE11, NBS1 e RAD50 expressão em 10. linhas celulares de carcinoma do endométrio. Só a linhagem de células AN3CA abriga uma mutação de MRE11, o que conduz a uma expressão dramaticamente reduzida do MRE11. Tubulina foi utilizada como controlo de carga. B, ensaios de formação de colónias que demonstram a sensibilidade ao inibidor de PARP (BMN673) em 10 linhas celulares de carcinoma do endométrio: todas as linhas celulares foram tratadas em triplicado durante 14 dias. A sobrevivência é representada em percentagem do controlo (tratado DMSO). As colónias de células foram quantificados utilizando um método colorimétrico (SRB).

A, Eficiência de ARNic em diferentes pontos de tempo após a transfecção mostrado por Western blotting. B, da sensibilidade do ensaio (com colorimétrico SRB): todas as linhas celulares foram tratadas com inibidor de PARP (BMN673) em triplicado durante 14 dias. A sobrevivência é representada em percentagem do controlo (tratado DMSO). Bater para baixo de MRE11 com três diferentes conjuntos de siRNAs levar a um aumento da sensibilidade em relação a inibição de PARP nas linhas celulares de carcinoma do endométrio HEC1A (aumento de 8 vezes, p 0,0001) e HEC-116 (aumento de 6 vezes, p = 0,0006). C, as linhas celulares foram tratadas com o MRE11 mirin-inibidor a uma concentração final de 30 uM em triplicado durante 10 dias. A sobrevivência foi avaliada por um ensaio de sensibilidade colorimétrico (SRB) e é mostrada em percentagem do controlo (tratado DMSO). O tratamento com o mirin chumbo MRE11-inibidor a um aumento da sensibilidade à inibição de PARP em ambos, HEC1A (aumento de 2,6 vezes, p = 0,001) e HEC-116 (aumento de 17 vezes, p 0,0001)

Knock-down e inibição da MRE11 sensibiliza células para BMN673 devido à prejudicada HR

Desde que a perda de expressão MRE11 em AN3CA foi associada com sensibilidade significativa à inibição PARP, perguntamos se o esgotamento dos MRE11 por siRNA, em geral, levam a um aumento da sensibilidade para o inibidor de PARP-BMN673. Para testar esta foi utilizado um painel de linhas celulares que expressavam CE níveis normais de MRE11 (Fig. 2A) e também eram resistentes à inibição de PARP (Fig. 2C). A eficácia do tratamento de siARN foi avaliada por Western blotting. Em ambas as linhas de células, transfecção com MRE11 siARN eficientemente empobrecido MRE11 endógeno (Fig. 3A). Nós próxima avaliada sensibilidade inibidor PARP nas células com depleção de MRE11 por formação de colónias. Após a depleção de MRE11, observou-se consistentemente um decréscimo significativo na viabilidade das células na presença de BMN673 (Fig. 3B). A fim de testar se a actividade de nuclease MRE11 é necessária para a resistência a inibidores de PARP, que cultivadas duas linhas de células na presença do inibidor mirin MRE11 e tratou-os com BMN673 (Fig. 3C). Em ambos os casos mirin teve um impacto negativo na viabilidade celular em resposta à inibição de PARP, sugerindo fortemente que a actividade de nuclease MRE11 é necessária para a resistência a inibidores de PARP. Para confirmar que derrubar de MRE11 leva a HR auditivos, determinou-se a capacidade das células para formar focos RAD51 em resposta à radiação ionizante (IR) (ver Fig. 4A). Na verdade, ao silenciamento de

MRE11,

menos focos RAD51 por célula pode ser observado (Fig. 4B). A linha de células de pâncreas Capan-1 conhecido por ser HR-deficiente devido a uma mutação de

BRCA2

serviu como controlo (dados não apresentados).

núcleos A, imagens de imunofluorescência mostrando DAPI-coradas (azul) e focos RAD51 (verde) em áreas representativas da HEC-116 células de carcinoma endometrial HEC-1A e. Ambas as linhas celulares que expressam MRE11 de tipo selvagem foram tratadas com três diferentes conjuntos de siRNAs para MRE11 ou com ARNsi de luciferase (siLuc) como um controlo. As células transfectadas foram então expostas a 10 Gy de irradiação ou não expostas, como indicado. B, RAD51 formação de focos mostrado como uma percentagem de células positivas focos RAD51 (mais do que 5 por focos de células foram avaliadas como positivas) sem tratamento e 6 horas após 10 Gy de irradiação. Um mínimo de 100 células foi contado para determinar a freqüência formação RAD51 focos em três experimentos independentes. ** P≤0.01, *** p≤0.001.

Discussão

Este é o primeiro estudo a demonstrar que não só a expressão da proteína de MRE11 mas também a expressão da outros membros da MRN complexo, RAD50 e NBS1, estão perdidos em uma proporção substancial do ECs. Além disso, observou-se uma associação significativa entre a perda de proteína de todos os membros da MRN, bem como o status de proteína de reparo incompatível neste grande conjunto de dados. A expressão da proteína do complexo-MRN ainda não foi estudada em tumores CE. No cancro da bexiga, MRE11 foi mostrado exibir propriedades preditivos para o tratamento de radioterapia [30]. Além disso, a perda completa da MRN-complexo no MSI cancros colo positivos é um evento freqüente [31], ao passo que a perda de MRE11 em tumores de mama é encontrado apenas em 9% dos casos [32]

.

Apesar de uma clara correlação entre o estado mutacional e a perda de expressão da proteína não pôde ser encontrado neste estudo, é notável que uma alta correlação da perda de proteínas de todos os membros da MRN bem como o estado MSI foi encontrado neste grande conjunto de dados. resultados de confusão sobre o estado mutacional do MRE11 poliT (11) alelo pode estar relacionado com as dificuldades conhecidas na sequenciação do MRE11 poliT (11) devido ao alelo pareado incorretamente da enzima polimerase [33].

Um estudo prévio revelou alta frequência de alterações de genes de reparação de DSB em MSI ECs positivo, onde MRE11 e RAD50 exibiu heterozigotos e homozigotos mutações em 51% e 17%, respectivamente, sem examinar o impacto da perda das proteínas [6]. Mutações do MRE11 poliT (11) alelo são mutações predominantemente heterozigotos e tem sido sugerido que apenas aqueles com mutações de dois ou mais nucleótidos, bem como mutações homozigotas têm um impacto funcional em termos de perda de função de [11], [12] [34], [35]. Neste relatório, não podemos confirmar a elevada frequência de mutações intrônicas mas fornecem evidências de que a proteína MRE11 está perdido em uma proporção substancial de ECs. Recentemente, tem sido mostrado que todo o exão de sequenciação MRE11 revelou mutações em 1,9% (duas de 107) dos tumores CE dentro dos exões [36]. No entanto, mutações intrônicas não foram avaliados, explicando por que a frequência de

MRE11

mutações é relatado para ser baixo, não só no estudo da Price et al. [36] mas também em uma recente um por The Cancer Genome Atlas Research Network [5].

inibidores de PARP têm mostrado notável sensibilidade em modelos de tumores BRCA1 /2 com deficiência

in vitro

bem como em ensaios clínicos envolvendo portadores de

BRCA1 /2

mutações germinativas. Além disso evoluindo provas, no entanto, sugere o potencial para um âmbito mais amplo para a atividade inibidor PARP [16]. Na verdade, para CE já anteriormente proposta a perda de expressão de PTEN como um biomarcador potencial para o tratamento com inibidores da PARP-com base em dados pré-clínicos [26], bem como no relato de um caso clínico [37]. Outros estudos no entanto, têm questionado o papel da

PTEN

em RH, sugerindo que este pode ser um fenômeno específico linha de células [38], [39]. No entanto, o mecanismo exacto do envolvimento de

PTEN

na reparação do ADN de RH continua por ser elucidado.

Perda de expressão MRE11 tem sido sugerido para sensibilizar colorrectal [35], [38], [ ,,,0],40], de mama [41] e hematológicas [linhas 42] células cancerosas para PARP inibidores devido ao reparo do DNA RH prejudicada. O nosso relatório sugere, pela primeira vez, o uso potencial de inibidores de PARP no tratamento de cancro do endométrio com base em resultados pré-clínicos. Há cada vez mais evidências de que pacientes que sofrem de cancro do endométrio e não expressam MRE11 poderiam ser tratados com BMN673. Isso suporta o uso de MRE11 como um biomarcador preditivo para o tratamento PARP.

Em conclusão, este estudo mostra que i) a perda completa do complexo de MRN é um evento frequente na CE, ii) perda de expressão MRE11 bem como silenciamento de genes e inibição farmacológica da atividade nuclease leva a sensibilidade à PARP-inibição

in vitro

, e iii) perda de MRE11 está associada com o reparo do DNA RH deficiente demonstrado após irradiação. Com base nestes resultados, propomos que a expressão MRE11 pode ser usado como um potencial biomarcador preditivo para a eficácia do tratamento inibidor de PARP em cancros do endométrio com a MSI.

Reconhecimentos

Agradecemos Martina Storz, André Fitsche e Sonja Brun-Schmid pela excelente assistência técnica e Markus Rechsteiner para discussões úteis. Agradecemos a Steve Jackson para fornecer reagentes publicados e BioMarin Pharmaceuticals pelo dom da sua PARP-inibidor BMN673.