Abstract
linhas celulares de cancro padrão não modelar a situação heterogeneidade intratumoral suficientemente. selecção clonal conduz a uma população homogénea de células por desvio genético. Heterogeneidade das células de tumor, no entanto, é particularmente crítico para os estudos terapeuticamente relevantes, uma vez que é um pré-requisito para a aquisição de resistência ao fármaco e a recorrência de tumores. Aqui, nós relatamos o isolamento de uma linha de células de câncer pancreático principal altamente cancerígeno, chamado JoPaca-1 e sua caracterização detalhada em vários níveis. Implantação de tão pouco quanto 100 células JoPaca-1 em ratinhos imunodeficientes deu origem a tumores que estavam histologicamente muito semelhante ao tumor primário. A grande heterogeneidade de JoPaca-1 foi reflectida pela morfologia celular diversa e um número substancial de aberrações cromossómicas. Comparativa sequenciação de todo o genoma de JoPaca-1 e BxPC-3 revelou mutações em genes frequentemente alterada no cancro pancreático. alta expressão excepcionalmente de marcadores de células-tronco do câncer e um elevado potencial clonogênica
in vitro
e
in vivo
foi observada. Todos estes atributos fazem esta linha de células de um modelo extremamente valioso para estudar a biologia de e efeitos farmacêuticas sobre o câncer de pâncreas
Citation:. Fredebohm J, Boettcher M, Eisen C, Gaida MM, Heller A, Keleg S, et ai. (2012) Criação e Caracterização de um altamente cancerígeno e Cancer Stem Cell Enriquecido linha celular do cancro do pâncreas como um sistema modelo bem definido. PLoS ONE 7 (11): e48503. doi: 10.1371 /journal.pone.0048503
editor: Nathan A. Ellis, da Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América
Recebido: 05 de julho de 2012; Aceito: 26 de setembro de 2012; Publicação: 12 de novembro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Fredebohm et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O trabalho foi apoiado financeiramente pelo Ministério Alemão de Educação e Pesquisa (BMBF) como parte do consórcio NGFN PaCaNet (BMBF-01GS08117). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:. Jörg Hoheisel e Jörg Tost servir como editores para PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais ..
Introdução
O câncer de pâncreas é um dos tipos mais agressivos de câncer de compartilhamento. A mortalidade é quase idêntica à incidência. Com uma taxa de sobrevivência de cinco anos de menos de 5%, que é a quarta causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer nos países desenvolvidos [1]. As razões para o mau prognóstico são o diagnóstico clínico final [2] e a resistência do tumor à quimioterapia padrão [3]. Com cerca de 90% dos casos, o adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é a forma mais comum e responsável pela elevada taxa de mortalidade; outros, subtipos de câncer raros, tais como tumores císticos, são menos letal. PDAC é assumido como surgem a partir de células epiteliais do sistema ductal pancreático [4]. Distribuição das células tumorais no tecido maligno é geralmente difusa e contém áreas com diferentes graus de diferenciação histológica. Caracteriza-se também por uma população de células tumorais heterogéneas geral (heterogeneidade intratumoral) [5], [6].
Um número substancial de linhas celulares PDAC de características diferentes têm sido estabelecidos e proporcionar uma fonte celular para investigar molecular aspectos desta doença devastadora (totalmente revisto por Ulrich et al. [7]). No entanto, a cultura de linhas de células sob condições bem definidas inevitavelmente conduz à selecção de subpopulações ao longo do tempo. Assim, as linhas celulares padrão não modelar a situação de heterogeneidade intratumoral, desde selecção clonal tem ocorrido ao longo de muitas passagens
in vitro
. Isto leva a uma população homogénea de células por desvio genético [8]. Pelo contrário, as linhas de células primárias assemelham muito de perto a heterogeneidade do tumor primário e, portanto, fornecer um bom recurso para experiências de cultura de células.
O
in vivo
heterogeneidade das células tumorais é especialmente crítico para experimentos testando os efeitos da quimioterapia, devido heterogeneidade fornece a base para a selecção de sub-populações resistentes, que por sua vez constitui a base para a resistência adquirida aos fármacos e recorrência do tumor [3], [9]. Entre a população de células resistentes, cancro de células estaminais desempenhar um papel particularmente crucial uma vez que possuem a capacidade de se auto-renovar [3] e é capaz de repovoar o tumor no sítio primário ou levar à formação de metástases em locais distantes [10].
câncer de células estaminais ou células iniciar tumorais que estão impulsionando a progressão do tumor têm recebido muita atenção nas últimas décadas [11], [12], [13]. Para o câncer de pâncreas, vários marcadores moleculares têm sido sugeridos para ser característica de células-tronco do câncer. Entre estes estão a expressão do tripleto CD44, CD24 e ESA [14], a proteína da superfície celular CD133 (prominin I) [15], [16], [17], e – mais recentemente – o aumento da atividade da aldeído desidrogenase 1 (ALDH1 ) [18]. Expressão de ALDH1 também tem sido correlacionado com a invasão e migração, bem como características mesenquimais do tumor [19]. Além disso, tem sido associada com a sobrevivência global fraca. Curiosamente, no entanto, dois estudos conflitantes mostram que a alta [19] ou baixa [20] expressão de ALDH1, tem um efeito adverso sobre a sobrevida do paciente. Outra característica da iniciação do tumor é a capacidade para formar esferóides ou esferas de tumor em suspensão [21], [22]. cancro de células estaminais também são acreditados para contribuir para o desenvolvimento de resistência ao fármaco. Simultaneamente, demonstrou-se que o teor de células que expressam CD133 podem ser enriquecidas por tratamento gemcitabina [23], [24], [25], sugerindo um papel fundamental deste marcador CSC na resistência gemcitabina.
Aqui, relatamos o isolamento e caracterização de uma nova linha de células primárias derivadas diretamente de uma amostra de tumor humano de um paciente com adenocarcinoma ductal pancreático. Esta linha de células, chamado JoPaca-1, apresenta uma alta variedade na morfologia e carrega muitas aberrações cromossómicas. Patologicamente, Rato-xenoenxertos de tumor primário e a ter um elevado grau de similaridade, em termos de diferenciação difusivo e a infiltração do tecido circundante do pâncreas e não-pancreática. células JoPaca-1 expressam o marcador tumoral mesotelina e várias citoqueratinas. Para além da sua grande heterogeneidade, provavelmente a característica mais importante desta nova linha celular é seu alto teor de tumor células, como demonstrado, iniciando
in vivo
limitando ensaio de diluição e elevados níveis de expressão de marcadores de células-tronco do câncer. Tendo em vista sua estreita semelhança com o tumor original e em combinação com a caracterização molecular completa, a linha de células fornece um excelente recurso para qualquer tipo de célula com base em vez de análise baseada em tecido.
Materiais e Métodos
consentimento por escrito
Ética declaração
informado foi obtido do paciente. A aprovação ética foi obtida a partir da comissão de ética da Faculdade de Medicina do Hospital Universitário de Heidelberg, Alemanha. Todos os cuidados e procedimentos animais seguiu as normas legais alemãs e foram previamente aprovados pelo conselho de revisão governamental do estado de Baden-Wuerttemberg, Alemanha.
isolamento celular
O tecido fresco foi obtido a partir de um 46- ano paciente do sexo masculino de idade sofrendo de câncer pancreático, que passou por uma pancreatecto-duodenectomia de preservação do piloro. Durante a operação, foi retirada uma amostra do tumor removido e directamente armazenados em solução de sais equilibrada de Hank (HBSS, H6648, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemanha) a 4 ° C durante 12 horas antes do processamento adicional. A amostra de tecido foi então cortado em pedaços de cerca de 5 mm de diâmetro e transferidos para um frasco de cultura contendo de Ham /meio F-12 (21765-029, Life Technologies, Darmstadt, Alemanha), suplementado com soro reagente de substituição (S0638, Sigma Aldrich) . Os pedaços de tecido aderido ao substrato e células cresceram para fora depois de uma semana, formando aglomerados em torno dos fragmentos de tecido. Fibroblastos e células estreladas foram removidos por duas rodadas de descolamento enzimática de série com 0,05% de tripsina /EDTA (25.300.054, Life Technologies). A população resultante de células tumorais foi congelada a passagem número quatro e armazenado em alíquotas. Para as experiências aqui descritas, JoPaca-1 As células foram usadas em passagens 6 a 19. Imortalidade dos células isoladas não foi necessária.
cultura celular
As linhas celulares de cancro pancreático bem estabelecidos MiaPaCa -2, MDAPanc-28, BxPC-3, AsPC-1, Capan-1 e foram obtidas de ATCC (Rockville, MD, EUA). Além disso, FamPAC foram gentilmente cedidas pelo Professor Eisold [26] e as células HPDE c7 pelo professor Francisco Real (Espanhol Cancer Research Centre National, CNIO) [27]. BxPC-3 foi autenticado pelo Colecção Alemã de Microrganismos e Culturas Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemanha). Todas as linhas celulares eram livres de micoplasmas, vírus e contaminação linha celular como testado por PCR [28]
As células foram cultivadas em meio e suplementos padrão, que foram obtidos a partir de Life Technologies, Darmstadt, Alemanha, a menos que especificado de outra forma.: JoPaca-1 em Isocove de Meio de Dulbecco Modificado (IMDM), 10% de soro de bezerro fetal (FCS), e 1% de penicilina-estreptomicina (P /S) (Cat No. 21056.); BxPC-3 no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, FCS a 10%, e 1% PS (Cat No. 21875.); C7 HPDE em queratinócitos meio sem soro (KSFM), 0,15 ml ng de receptor /factor de crescimento epidérmico, e 25 ug /ml de extracto de pituitária bovina (Cat. No. 17005075) [29]. Para a formação de esfera do tumor, JoPaca-1 As células foram cultivadas em meio F12 de médio /de Ham suplementado com 20 ng /de factor de crescimento básico de fibroblastos ml (bFGF, F0291, Sigma Aldrich, Munique, Alemanha), 1 x B-27 de suplementos (Cat. N . 0080085-SA), 2 mM de L-glutamina (Cat. No. 25030024), e 1% de P /S em placas de baixo de fixação (No. Cat. 3473, Corning, Amsterdão, Países baixos). As células foram divididas numa proporção de 1 a 10, a menos que indicado de outra forma. A viabilidade das células após o tratamento com gemcitabina (G6423, Sigma Aldrich) foi determinada por ensaio de resazurina [30]. Para tratamento a longo prazo com gemcitabina, células JoPaca-1 na passagem 10 foram submetidos, durante um período de 72 h, para concentrações crescentes do fármaco: 10, 15, 20 e 25 nM. As células foram divididas 1/3 após cada ciclo de tratamento e comparado com um controlo na passagem 13 para a expressão de CD133. Imagens de parentais JoPaca-1 e sub clones em cultura foram tiradas em um microscópio invertido (DM Irbe, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) equipado com uma câmera CCD (Progressive Scan CV-M1, JAI, Frankfurt, Alemanha). Barras de escala foram adicionados em ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EUA), mediante cálculo tamanhos de pixel medidos
Citogenética -. multicolor de fluorescência
in situ
hibridação (mFISH)
JoPaca -1 células foram tratadas com 10 ng /ml de vinblastina, a 37 ° C, 5% de CO
2 durante 4 h para prendê-los em metafase. metáfase foram preparados de acordo com protocolos convencionais [31]. Em resumo, as células em suspensão foram tratadas com 75 mM de KCl durante 20 min a 37 ° C e fixado com uma solução gelada de Carnoy (ácido methanol:acetic = 3:01) em três passos de lavagem. A solução de células fixadas foi deixada cair a partir de 1 metro sobre uma corrediça inclinada, que tinha sido previamente humedecido com 70% de etanol. mFISH foi realizada utilizando o kit de sonda multi-cor 24XCyte (MetaSystems, Altlussheim, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. os spreads metáfase hibridizadas foram analisados utilizando um microscópio de fluorescência assistida por computador (Axioplan 2, Zeiss, Göttingen, Alemanha) equipado com filtros adequados. As imagens foram gravadas com uma câmera CCD (fotométricos, Tucson, AZ, EUA) e analisados utilizando Quips Software SpectraVysion ™ (Vysis, agora distribuídos através de Imagiologia Aplicada).
clonogênica potencial e tumourgeneity
In vitro
-limiting ensaio de diluição.
JoPaca-1 foram semeadas numa placa de 96 poços numa série de diluições de um-para-um a partir de 125 células por poço, em 16 cada diluição replica. O meio foi mudado para não permitir que a sinalização autócrina. Após 10 dias, os poços distintos que mostram colónias foram contadas. Após 15 dias, as colônias que mostram diversos fenótipos morfológicas foram fotografados.
In vivo
-limiting ensaio de diluição.
experimentos de xenotransplante iniciais foram realizadas por injecção de 1 células Mio em NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl (NOD /SCID /γ ou NSG) camundongos. Para avaliar a tumorigenicidade in vivo de JoPaca-1, 104, 103 e 102 células, respectivamente, foram injectadas em 70 ul de Matrigel (2 mg /ml) (BD, Heidelberg, Alemanha) para dentro do corpo do pâncreas de ratos NSG. enxerto com sucesso de tumores e o crescimento subsequente foi monitorizado por palpação normal do local de implantação.
Para quantificar frequência e potencial de iniciação do tumor clonogénicas, os dados foram analisados por um algoritmo de regressão de ajuste (ELDA) [32].
H e coloração e imuno-histoquímica de xenoenxertos e tumores primários
tumores explantados foram embutidos em blocos de parafina e secções foram cortadas em 4 mm de espessura utilizando um micrótomo. Hematoxilina e eosina (H E), bem como a coloração imuno-histoquímica (IHC) foram efectuados de acordo com procedimentos padrão. Resumidamente, as amostras de tecido foram deparaffinised usando Roticlear (A538, Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha) e hidratadas em etanol graduado uma série. A recuperação de antígenos foi atingida por meio de aquecimento em 10 mM de tampão de citrato (pH 6,1). As lâminas foram bloqueadas usando a energia do bloco (Biogenex, Fremont, CA, EUA) e incubados com o anticorpo primário: anti-ALDH1 (Mat. No. 611194, BD Biosciences) utilizados no 1:1000; anti-citoqueratina 19 utilizado em 1:50; anti-citoqueratina AE1 /AE3 (código M3515, DakoCytomation) usado em 1:300; anti-CD133 /1 (AC133) (130-090-422, Miltenyi Biotech) usado em 1:50; e um universal de controle contendo IgG negativos rato (IS750, DakoCytomation) usado em 1:02 diluição. As lâminas foram incubadas a 4 ° C durante 16 h. Para a detecção do anticorpo primário, um anticorpo secundário anti-ratinho conjugado com peroxidase (K4001, DakoCytomation) foi aplicado de acordo com as instruções do fabricante. A reacção colorida com diaminobenzodine (DAB) foi contrastado com hematoxilina. Finalmente, as lâminas foram visualizados usando um microscópio Axioplan 2 e imagens tiradas por uma câmera AxioCam HRc CCD (Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Alemanha). Barras de escala foram adicionados no software AxioVision 4 de acompanhamento.
Imunofluorescência
Para imunofluorescência de mesothelin e citoqueratina 19, JoPaca-1, células BxPC-3 e C7 HPDE foram cultivadas em lâminas de cultura (Cat . 354559, BD Biosciences), fixadas com 2% paraf ormaldeido e permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 durante 5 min. As lâminas foram bloqueadas em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) com albumina 10% de soro de bovino (BSA) e epítopos recuperado com PBS suplementado com 10% de proteinase K. anticorpos IgG1 contra K1 mesotelina (Cat. SC-33672, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemanha ) e citoqueratina 19 (clone RCK108, Code-Nr. M 0888, DakoCytomation, Hamburgo, Alemanha) bem como IgG1 de ratinho (MCA928, Serotec, Puchheim, Alemanha) como um controlo negativo foram utilizados a uma diluição de 1:50. O anticorpo secundário Alexa Fluor 488 anticorpo de cabra anti-IgG1 de ratinho (A-11001, Life Technologies) foi usado a uma diluição de 1:500. As lâminas foram montadas com meio aquoso contendo 4 ‘, 6-diamidin-2-fenilindol (DAPI) para núcleos contra-coloração (SC-24941, Santa Cruz Biotechnology). As imagens foram tiradas em um microscópio de campo amplo equipado com uma câmera CCD AxioCam (Zeiss celular Observer, Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Alemanha).
fluorescente de células assistida (FACS)
A expressão de CD133 foi detectada por FACS (FACS Canto II, BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) usando ficoeritrina conjugada CD133 /2 (293C3) e anticorpos CD133 /1 (AC133) (Milteny Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha). Atividade de ALDH1 foi medido utilizando Aldefluor inibidor de substrato +/- DEAB (stemcell Technologies, Grenoble, França). células ALDH-brilhante (ALDH
br) foram detectadas no canal FITC e compensados contra ficoeritrina e vice-versa, usando células marcadas individualmente como controlos. Expressão do tripleto CD44 /CD24 /ESA foi testado utilizando os seguintes anticorpos da BD Biosciences: (Cat. 347200) (Cat. 560533) EpCAM (ESA) -APC, CD44-PE-Cy7, CD24-FITC (Cat 555.427). . A incubação de células com os anticorpos e os substratos, FcR de bloqueio e os passos de lavagem foram efectuados de acordo com as instruções do fabricante.
Total de sequenciamento do genoma
O ADN genómico de linhas celulares JoPaca-1 (passagem 8) e BxPC-3 foi extraído utilizando protocolos padrão. sequenciamento do genoma inteiro e alinhamento de ler foi feito usando um sequenciador de 2000 Illumina HighSeq no Centro Nacional de Génotypage (Evry, França). Dados do top 17 genes que codificam não sinónimas mutado no cancro pancreático foi obtido a partir do catálogo Sanger Institute de mutações somáticas no web site do cancro (https://www.sanger.ac.uk/cosmic) [33]. Além disso, três genes foram incluídos no banco de dados OMIM sob o termo de pesquisa “câncer pancreático” (https://www.omim.org/entry/260350) [34]. Todos estes genes foram verificados quanto a mutações não sinónimas ex�icas em BxPC-3 e JoPaca-1 (Tabela S2). Além disso, as variações não-codificantes associados com câncer pancreático foram obtidos a partir do genoma estudos de associação ampla (GWAS) (Tabela S3). A enumeração de uma mutação e do tipo selvagem lê foi feito à mão usando o genoma navegador Ensembl [35] e visualizador genoma integrativa [36] contando cada mapeadas ler.
Sanger seqüenciamento do
KRAS
A região em torno do codão 12
KRAS
foi amplificado a partir de ADNc gerada a partir das linhas celulares por PCR convencional utilizando Phusion polimerase (F-530, Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha) e os seguintes iniciadores : KRAS-F (5′-CAC CAT CGC TTC GGA CTG GG-3 ‘) e KRAS-R (5′-ACT CCT CTT GAC CTG CTG TGT GC-3’). Os produtos de PCR foram sequenciados por GATC (Constance, Alemanha) utilizando o iniciador KRAS-F.
Resultados
células JoPaca-1 derivam de adenocarcinoma ductal pouco diferenciado do pâncreas
para o isolamento das células do tumor primário, tecido fresco foi obtido a partir de um 46-year old sofrimento paciente do sexo masculino de câncer pancreático, que passou por uma pancreatecto-duodenectomia de preservação do piloro (operação pp-Whipple). Ele morreu cinco meses após a cirurgia. O exame histopatológico do tecido revelou um adenocarcinoma ductal pouco diferenciado do pâncreas, com infiltração do tumor do duodeno, o ducto biliar intrapancreática e o tecido mole peripancreática. Perineural, lymphogenic e infiltração tumoral hematogênica poderia ser encontrado, bem como duas metástases linfáticas em 22 linfonodos regionais. O estágio TNM foi pT3, pN1 (2/22), G3. Clinicamente, não houve ocorrência de metástases órgão distante. A linha de células primária JoPaca-1 foi isolado a partir do tecido ressecado do cancro, tal como descrito em detalhe na secção dos métodos. A população resultante de células tumorais puras foi congelada depois de quatro passagens de crescimento. Para as experiências relatadas abaixo, foram usadas células de 6 a 19 passagens. As células foram cultivadas em meio IMDM padrão de cultura de células suplementado com 10% FCS e 1% PS.
subclones de JoPaca-1 revelam uma heterogeneidade fenotípica da população parental
células individuais de JoPaca-1 cultivadas em completo isolamento deu origem a colónias que exibiram uma morfologia variável (Fig. 1). Normalmente, pode-se observar duas formas de crescimento: formação próxima ilha contato e se espalhando sem contato (Fig 1B, C.). heterogeneidade celular reflectiu-se igualmente a variedade de formas diferentes de células que foram observados. Round and células vesiculares ocorreu como fez um fenótipo fusiforme. Além disso, a formação de longas pseudopods Pode ser visto (Fig. 1D-F). Ambos, diferentes características de crescimento e as várias formas de célula também podia ser detectada na população parental (Fig. 1A), indicando a sua boa representação pelas sub clones isolados.
imagens de contraste de fase são apresentados de JoPaca-1 células parentais
e subclones mostrando diferentes características de crescimento e morfologias. A. JoPaca-1 população celular parental. B, C. Duas características diferentes de crescimento pode ser observado: close-contact formação de ilhas (B) e espalhando sem contato (C). D-F. Foram observados três formas diferentes de células:. redondas e vesicular (D), fusiforme (E), e pseudo-pod formando células (F)
células JoPaca-1 são tetra para pentaplóides e genomically instável
JoPaca-1 foi preso em metáfase para estudar as aberrações do cariótipo e cromossômicas. Foram analisados os spreads metáfase de 26 células. Eles apresentaram uma tetra- para cariótipo pentaploidic com cinco aberrações cromossómicas comumente observados (Fig. 2). Estas são as translocações t (17; 5) (5; 17), t (7; 4), t (13; 12), e t (2; 9) e uma inversão do cromossoma 13 (I13). No total, 47 aberrações diferentes foram observados nos 26 cariogramas. Mas para as aberrações relativamente frequentes de acima, a maioria (38) foram observados apenas uma vez. Três outros translocações foram encontrados duas vezes ou três vezes (Tabela S1). O cromossomo Y estava perdido em 20 dos 26 cariogramas.
A karyogram representante da JoPaca-1 é mostrado aqui. JoPaca-1 é uma linha celular de tetra-penta-ploidic. Abaixo da imagem panorâmica, os cinco aberrações mais comumente observados em 26 cariogramas são apresentados. As translocações podem ser identificadas por hibridação de sondas de cores diferentes, resultando em cromossomos de duas cores. Inversão do cromossomo 13 (i13) é a fusão de dois q-braços na kinetochore. O cromossomo Y é muitas vezes perdido em células de tumor, pois é nesta representação.
JoPaca-1 mostra aumento da resistência à gemcitabina sobre BxPC-3
JoPaca-1 células foram comparados para BxPC-3 na sua resposta à gemcitabina, a primeira linha de tratamento quimioterápico padrão de câncer pancreático. Na ausência da droga, o tempo de duplicação foi de 28 h para JoPaca-1 e 19 h para BxPC-3. Durante um período de crescimento de 72 h, o que corresponde a 3,79 de divisões celulares e BxPC-3 de 2,57 JoPaca-1. A fim de dividir a 3,79 vezes, JoPaca-1 exigiria 106 h. Por conseguinte, uma incubação prolongada com gemcitabina teve um efeito mais forte sobre a viabilidade celular de JoPaca-1 (Fig. 3A). Em comparação com BxPC-3, JoPaca-1 mostraram uma tolerância substancialmente maior para gemcitabina com um IC
50 de 28 nM, em comparação com 11 nM para BxPC-3 mesmo depois da metade da população de células sofreu uma rodada adicional de mitose (3.79+ 0,49 = 4,28 divisões celulares = 120 h) (Fig. 3B). Portanto, o aumento da resistência de JoPaca-1 é independente da taxa de proliferação.
BxPC-3 e JoPaca-1 de células que tratadas com concentrações crescentes de gemcitabina por 72, 96, e 120 horas. A viabilidade celular foram normalizados com os controlos não tratados. Os pontos de dados representam os resultados de seis experiências duplicadas com desvios padrões indicados por barras de erro médio. A. O aumento do tempo de incubação com os resultados da gemcitabina no aumento da citotoxicidade para JoPaca-1. B. A viabilidade celular foi comparada entre 3.79 e 4.28 divisões celulares para BxPC-3 e JoPaca-1, respectivamente. JoPaca-1 mostra uma maior tolerância para com gemcitabina que BxPC-3, mesmo após incubação prolongada de 0,49 divisões celulares.
células JoPaca-1 são altamente tumorigénico e aumentaram clonogênica potencial
Para estabelecer o potencial clonogénico de JoPaca-1, em células de passagem 10 foram contadas e semeadas numa 1-1 diluição em duas séries de placas de 96 poços a partir de 125 células por poço para baixo a 4 células por poço. Cada diluição foi efectuada 16 vezes. Após 15 dias de incubação, os poços que contêm colónias distintas foram contadas. A análise computacional das contagens de colónias usando o “extremo LDA” algoritmo [32] mostraram que uma célula 48 (~ 2%) foi capaz de formar uma colónia (Fig. 4A). Este potencial clonogénico é dez vezes maior do que a linha de células estabelecida Capan-1 com 0,2% [19].
e potencial clonogénico de tumourgenicity JoPaca-1 foram determinados por ensaios de diluição limitante
In vitro
e
in vivo
. A. Diluição de células em uma placa de 96 poços e a contagem de células contendo colónias após 10 dias conduzir a uma potencial clonogénico de uma célula em 48 tal como calculado por ELDA [32]. B. ortotópico de injecção de 10.000, 1.000, 100 e células JoPaca-1 em 6 NOD.Cg-
Prkdc
SCID IL2RG
tm1Wjl
ratinhos cada resultou na formação de tumores que foram excisados, pesados e fotografado. massas médias tumorais são mostrados.
Para estabelecer a tumourgenicity de JoPaca-1
in vivo
, três grupos de seis imunológico comprometido NOD.Cg-
Prkdc
scid IL2RG
tm1Wjl
camundongos foram injetados ortotopicamente com 10
4, 10
3 e
2 células 10, respectivamente. Após 100 dias, todos os ratos ainda estavam vivos. No total, 11 ratos tinham formado tumores: 6/6 para os animais com 10
4 células, 4/6 com 10
3 células e 1/6 com 10
2 células (Fig 4B.). frequência de iniciação do tumor foi estimado pelo algoritmo ELDA a 1 célula em 831 com um limite inferior e superior de 1 em 2114 e 1 em 327, respectivamente. Os tumores foram excisados e pesados. O peso tumoral correlaciona-se directamente com o número de células injectadas. Com 10
4 células, o peso médio do tumor foi de 927 mg; indução com 10
3 células deram origem a tumores de 618 mg, em média. O único tumor resultante de 10
2 células tinha 300 mg.
células JoPaca-1 invadir tecido circundante normal e mostram metástase potencial in vivo
tecido muscular liso
O tumor primário tinha invadido de o duodeno proximal (Fig. 5A). tumores de xenoenxerto não foram encapsulados; Além disso, eles revelaram uma frente invasiva com áreas de expansão do tumor infiltrante para o tecido normal adjacente pâncreas (Fig. 5B) Metástases poderia ser observada em um de três murganhos durante as experiências iniciais, mas não foram ainda analisados (Fig. 5C).
Mostrado aqui estão H e as manchas de primário (A) e fatias de tecido de xenotransplante (B). A. tecido do músculo liso do duodeno foi infiltrada por células tumorais do tumor primário. B. frente invasiva de tumores xenoenxerto com áreas de expansão do tumor infiltrativa no tecido pâncreas normal adjacente (seta cabeças). C. Um dos três ratos NSG desenvolvido metástase durante as experiências iniciais, quando 1 células Mio foram injetados ortotopicamente (cabeças de seta).
Os tumores primários e de xenotransplante levantadas a partir JoPaca-1 têm muito semelhante histologia
histopatologia, os tumores de xenoenxerto mostram um elevado grau de semelhança ao tumor primário. padrões de morfologia celular e crescimento foram em geral pouco diferenciado caracterizada pelo crescimento celular ou sólido único. No entanto, as áreas de padrões de crescimento micropapilares e formações ductulares foram encontrados em ambos os tecidos primários e xenotransplante (Fig. 6A). Além disso, o comportamento migratório e invasiva foi observada para um grau semelhante. tecidos primários e de xenotransplante mostrou infiltração perineural e invasão linfóides e vasos sanguíneos (Fig 6B, CII e 11C.)
Mostrado aqui estão H . E manchas de tumores primários e de xenotransplante. A. Primário e tumores de xenoenxerto mostram fenótipos de diferenciação semelhantes que variam de diferenciação pobre em geral (-) sobre o crescimento micropapilar (x) às formações ductulares mais diferenciadas (*). B. Perineuronais invasão pode ser observado em ambos os tumores primários e de xenoenxerto (cabeças de seta). C. Mostrado aqui são áreas de necrose tumoral, demarcadas por granulócitos neutrófilos (C i, asteriscos) e infiltração do tumor dos vasos linfáticos (C ii, cabeça de seta). D. Distribuição de estroma (s) no tecido do tumor primário e xenoenxerto. As células tumorais de ambas as amostras são incorporados no estroma tumor desmoplásico. Enquanto estroma do tumor primário é dispersa por todo o tumor, ele é mais localizada no xenoenxerto.
Características devido às suas características imunológicas foram naturalmente mais pronunciado no tumor primário do que no xenoenxerto como ratinhos NSG são incapazes de montar uma resposta imune inata ou adaptativa. Estas características imunológicas incluem áreas de necrose tumoral que foram demarcadas por granulócitos neutrófilos (Fig. 6CI), bem como células inflamatórias infiltrantes, principalmente linfócitos e granulócitos. No tumor primário, as células são incorporados no estroma desmoplástico tumor. tumores de xenoenxerto são parcialmente intercalado com o tecido do estroma, bem. Aqui, estas áreas são localizados e não como omnipresente como no tumor primário (Fig. 6D).
JoPaca-1 expressa citoqueratinas e o marcador tumoral mesotelina
A imuno-histoquímica das citoqueratinas foi realizada no primário e fatias de tecido de tumor xenoenxerto. Ambos, tumores primários e de xenotransplante manchado positivo para os clones pan-citoqueratina AE1 e AE3. Expressão de citoqueratinas em que o tumor primário era ligeiramente mais dispersos do que nos xenoenxertos, onde claramente corados das células epiteliais que revestem o lado do lúmen das condutas. Mais especificamente, a expressão de citoqueratina 19 foi ainda mais caracteristicamente ductal em ambos os tecidos. controlos do isotipo foram negativos (Fig. 7). Imunofluorescência confirma a expressão de citoqueratina 19 em células isoladas JoPaca-1. Citoqueratina 19 é uma proteína de filamento intermédia e foi expressa pelo JoPaca-1 no crescimento da frente de uma colónia de células (Fig. 8A). Além disso, JoPaca-1 foi testado para a expressão do marcador de tumor mesotelina. A linha celular de cancro pancreático estabelecida BxPC-3, e a linha de células pancreáticas ductal HPDE C7 normais foram utilizados como controlos positivos e negativos, respectivamente. Expressão de mesotelina poderia ser detectado em JoPaca-1 e células BxPC-3, mas não em células normais do ducto pancreático HPDE C7. Isotipo-controles foram negativos (Fig. 8B).
A imuno-histoquímica foi realizada em fatias de tumores primários e de xenotransplante. As citoqueratinas AE1 /AE3 e mais especificamente citoqueratina 19 foram expressos em estruturas ductais de tumores primários de xenoenxerto e (castanho). controles isotípicos foram negativos.
imagens de contraste de fase são apresentados que mostram mesothelin e citoqueratina 19 como detectado em JoPaca-1 fixa, BxPC-3 e células c7 HPDE. Ambas as proteínas foram marcadas com anticorpo primário e secundário conjugado com FITC (verde). Os núcleos foram coradas com DAPI (azul). controles isotípicos foram negativos. A. citoqueratina 19 é expressa na frente em crescimento de células JoPaca-1. B. JoPaca-1 e da linha celular estabelecida BxPC-3 ambos expressam mesothelin enquanto o normal, c7 pancreático linha celular ductal HPDE não.
células JoPaca-1 são altamente enriquecido em marcadores de células-tronco do câncer
câncer de células estaminais auto-renovação são pensados para ser a força motriz por trás de progressão tumoral e responsável pela resistência contra a quimioterapia.