Abstract

A nova função para a pasta de Arl dois (BART) molécula em células de câncer de pâncreas é relatado. BART inibe a capacidade de invasão das células cancerosas do pâncreas através da ligação a um Ca

2 + dependente, proteína de fusão da membrana fosforilada, triphosphatase guanosina (GTPase), annexin7 (ANX7). Uma função supressora de tumor para ANX7 foi relatado anteriormente com base no seu papel prognóstico em cancros humanos e o fenótipo do mouse câncer-propensos

ANX7

(+/-). Outras investigações demonstraram que o complexo de Bart-ANX7 é transportado no sentido protuberâncias celulares em células de migrar quando Bart suporta a ligação de ANX7 para a isoforma da proteína quinase C (PKC) PKCα. Evidências recentes sugerem que a fosforilação de ANX7 por PKC potencializa significativamente fusão induzida por ANX7 de vesículas de fosfolipídios; No entanto, os dados actuais sugerem que o complexo de Bart-ANX7 reduz a actividade PKCα. Derrubando endógena BART e ANX7 aumenta a atividade de PKCα e inibidores específicos da PKCα revogar significativamente invasão induzida por BART e knockdown ANX7. Estes resultados implicam que BART contribui para regular a atividade PKCα através da ligação a ANX7, afectando assim a capacidade de invasão das células cancerosas do pâncreas. Assim, é possível que Bart e distintamente ANX7 pode regular a sinalização a jusante de PKCα que potencialmente relevante para a invasão de células, actuando como moléculas anti-invasivos

citação:. Taniuchi K, K Yokotani, Saibara T (2012 ) BART Inibe o cancro do pâncreas invasão celular pelo PKCα Inactivação através da ligação a ANX7. PLoS ONE 7 (4): e35674. doi: 10.1371 /journal.pone.0035674

editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne Escola de Medicina da Universidade de Estado, Estados Unidos da América

Recebido: 29 Janeiro, 2012; Aceito: 19 de março de 2012; Publicação: 19 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Taniuchi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma Grant-in-Aid do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar do Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O ligante de dois Arl (Bart) molécula é uma proteína solúvel de 19 kDa originalmente purificada a partir de cérebro bovino e identificado como um parceiro de ligação de ADP-ribosilação tipo factor 2 (ARL2) [1]. A ligação do Bart para ARL2 é de elevada afinidade e depende da ligação de GTP a ARL2 [1]. funções distintas foram inferidos a partir de resultados que ARLs faltam as actividades bioquímicas ou genéticas característicos de factores ADP ribosilação (ARFs), apesar da identidade de sequência de aminoácidos de 40% a 60% entre ARFs ARLs e [2]. ARL2 tem sido implicado como um regulador da dinâmica dos microtúbulos e dobrando [3], mas a sua função permanece em grande parte desconhecida. Nós relatado anteriormente que a regulação da modificação BART pós-transcricional

via

intracelular obrigatório para G3BP em grânulos de estresse CD24 contribui para a inibição da invasão e metástase de células pancreáticas adenocarcinoma ductal (PDAC) [4]. G3BP N-terminal contribui para a regulação pós-transcricional de BART [5]. Um estudo adicional demonstrou que Bart diminui a invasividade de células PDAC inibindo a diminuição mediada por ARL2 na actividade da proteína de Rho GTPase RhoA [6]. Estes dados sugerem que Bart desempenha um papel na inibição da capacidade de invasão PDAC.

ANX7 é um membro da família anexina de ligação de fosfolípidos e proteínas códigos de cálcio-dependentes de Ca

2 + -activated GTPase.

ANX7

(+/-) knockout camundongos têm Ca

2 + defeitos de secreção endócrina dependentes [7]. ANX7 é fosforilada por PKC, o que significativamente aumenta a ligação de ANX7 de vesículas de fosfolípidos fundidas em células de cromafina [8]. Activado PKC induz a secreção de MMP-9, levar à activação de MMP-2, infra-regular a secreção de TIMP-1 e TIMP-2, e aumentar a MT1-MMP na superfície celular [9]. Assim, ANX7 pode ser um dos factores associados com a cascata de secreção dependente de PKC. Além disso, ANX7 é um gene supressor de tumor recentemente descrito para o cancro da próstata, tal como evidenciado pela perda de heterozigotia e reduziu a expressão da proteína ANX7 numa grande fracção de tumores metastáticos arquivados [10]. ANX7 exibe muitas propriedades biológicas e genéticos de um gene supressor de tumores e também está implicado na carcinogénese através de vias de sinalização distintas envolvendo outros supressores de tumores, de reparação de ADN e genes relacionados com apoptose [10], [11]. Estes relatórios sugerem que ANX7 desempenha várias funções diferentes envolvidas na exocitose, a supressão do tumor e de carcinogénese.

PKC é uma família de serina /treonina-cinases envolvidas na transdução de sinais, incluindo o sinal de Ras, para a proliferação celular e diferenciação [12], [13]. A família de PKC é composto de pelo menos 12 isoformas com diferentes padrões de expressão do tecido, especificidade de substrato, e localizações subcelulares que estão relacionados com as funções de células especializadas, incluindo a proliferação celular, a diferenciação e a apoptose [14]. PKCS “clássicas” (α, β1, β2, e y) ésteres de forbol travamento e Ca

2 + dependentes. Os ‘novos’ PKC (δ, ε, η, e θ) não dependem de Ca

2 +, mas se ligam ésteres de forbol. A terceira subfamília compreende os PKC “atípicos” (ξ, ι, λ e μ), que não se ligam a qualquer Ca

2 + ou éster de forbol [14], [15]. receptores da superfície de células constitutivamente activada, tal como o receptor de EGF ou o receptor PDGF [16], ou Ras [17], causa hiperactivação da PKC, bem como da cascata de proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK). Superexpressão de PKCδ induz um fenótipo de células de câncer pancreático mais maligna

in vivo

, através da modulação da proliferação celular e sobrevivência [18]. Outro estudo demonstrou que PKC activada induz a formação de lamellipodia e subsequente aumento da atividade migratória de fibroblastos subconjuntival [19]. Assim, tem sido sugerido que a PKC induz a proliferação de células /sobrevivência, invasão e metástase.

Neste estudo, ANX7 foi identificada como um parceiro de ligação de novo do Bart, e Bart foi encontrado para ser associado com a PKC-ANX7 formação de complexos em células PDAC. Além disso, os resultados atuais demonstraram que derrubar BART induz invasão celular, aumentando a atividade PKCα através da perda de formação do complexo ANX7-PKCα. Assim, diminuiu PKCα ativa

via

tanto BART e ANX7 contribui para a inibição da invasão PDAC.

Resultados

BART se liga a ANX7 em células PDAC

BART aumenta knockdown invasão retroperitoneal e metástase de células PDAC ao fígado num modelo de xenotransplante ortotópico, como descrito em um relatório anterior [4]. Para investigar o mecanismo pelo qual Bart suprime a capacidade de invasão e metástase, imunoprecipitação experiências (IP) foram realizadas na linha celular humana PDAC S2-013 utilizando um anticorpo específico para Bart, para detectar complexos do Bart com outras proteínas. S2-013 é uma sublinha clonado de uma linha celular PDAC (SUIT-2) derivadas de uma metástase no fígado [20], e foi obtido do Dr. T. Iwamura (Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japão). fracções imunoprecipitadas corados com prata separados em géis de SDS-PAGE revelou uma banda de 50 kDa que não foi observada em imunoprecipitados controlo de isotipo (seta na Fig. 1A). A banda foi excisada e analisada por Q-TOF-MS após digestão em gel de tripsina, e identificado como ANX7. A cobertura da sequência do péptido foi de 15% (Fig. 1B). Esta ligação de ANX7 BART específica foi demonstrada por co-S2-013 IP de células (Fig. 1C) e co-localização subcelular foi analisada por imuno-coloração dos S2-013 células (Fig. 1D). Bart e ANX7 coimmunoprecipitated e foram co-localizada no citoplasma. Digno de nota é que Bart e ANX7 acumulado em saliências lamellipodial-like que são essenciais para a migração celular (setas na Fig. 1E).

A. Os imunoprecipitados de células S2-013 utilizando IgG de coelho normal (controlo) e anticorpo anti-Bart foram examinados por análise de mancha de prata. Q-TOF-MS análise investigada uma banda proeminente na Bart imunoprecipitados (seta). A porcentagem de cobertura para B. ANX7 é representado pelos péptidos identificados na sequência de proteína total (número de acesso NM_004034). C. imunoprecipitada Bart endógeno ou a partir ANX7 S2-013 foram analisados ​​por transferência de Western utilizando anticorpos anti-anti-ANX7 Bart e. IgG de coelho ou um rato normal foi utilizado como um controlo de isotipo para Bart e ANX7, respectivamente. coloração D. imunocitoquímica de S2-013 células utilizando anticorpos anti-ANX7 (vermelho) anti-BART (verde) e. Azul, coloração DAPI. Bar, a 10 uM. E. As setas indicam que BART (verde) e ANX7 (vermelho) colocalize em saliências lamellipodial-like de S2-013 células. Azul, coloração DAPI. Bar, 10 mm.

ANX7 inibe a invasão de células PDAC

Anteriormente, clones celulares foram geradas em que BART foi estavelmente suprimida por baseada em vetor curto hairpin específica pequena interferência RNA (siRNA) em S2-013 células que anteriormente expressas altos níveis de BART [4]. Para determinar a função de complexos de Bart-ANX7, um ensaio de imunocoloração de cicatrização de feridas foi usado para observar a localização de Bart e ANX7 em células migratórias polarizado (Fig. 2a). Ambos Bart e ANX7 foram recrutados para os bordos de ataque durante a cicatrização de feridas de controlo S2-013 células (setas na Fig. 2A). Depleção do Bart inibiu a acumulação ANX7 aos bordos de ataque (painéis inferiores na Fig. 2A). Combinado com o resultado da Fig. 1E, estes resultados indicam que Bart e ANX7 interdependente localizar-se os bordos de condução e nas saliências lamellipodial semelhantes associados com a migração celular.

. mexidos controlo negativo (SCR-1) e Bart RNAi (siBART-1) S2-013 células em culturas confluentes foram feridos. Após 4 h, as células foram imunocoradas com anticorpos anti-ANX7 (vermelho) anti-Bart (verde) e. Azul, coloração DAPI. Setas, colocalized BART e ANX7 na vanguarda das células de controlo. Bares, 10 ^ m. oligonucleotídeos B. siRNA segmentação ANX7 (siANX7) e controle mexidos negativo foram transitoriamente transfectados em células S2-013 e PANC-1. Western blotting validado ANX7 knockdown em ambas as linhas celulares. C. Transwell ensaio de motilidade das células tratadas como em (B). As células migraram em quatro campos por grupo foram contados. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Colunas

, média;

bares

, SD. *

p Art 0,005 em comparação com células de controlo. D. Quantificação do ensaio de invasão de duas câmaras de células tratadas como em (B). células invadidas em quatro campos por grupo foram contadas. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Colunas

, média;

bares

, SD. *

p

. 0,001 em comparação com células de controlo

In vitro

ensaios foram usadas para examinar os efeitos da ANX7 na motilidade celular e invasão. Como mostrado por meio de análise de mancha de Western, a expressão ANX7 foi marcadamente reduzida em S2-013 e uma linha celular de PDAC, PANC-1, 72 h após a transfecção com os oligonucleótidos siRNA alvejando ANX7, em contraste com as células transfectadas com ARNsi-oligonucleótidos mexidos (Fig . 2B). Supressão de ANX7 motilidade aumentada no Transwell ensaios de motilidade de S2-013 e PANC-1, em comparação com células de controlo (Fig. 2C). Em ensaios de invasão em duas câmaras, as células ANX7 de ARNi foram significativamente mais invasiva do que a S2-013 controlo e células PANC-1 (Fig. 2D). Estes resultados sugerem um papel importante para a ligação de Bart e ANX7 na inibição da migração celular.

A ligação de ANX7 e PKC fosforilada está associada a inibição da capacidade de invasão de células PDAC

Co-IP do ANX7 e complexo de PKC foi realizada utilizando anticorpos anti-ANX7 ou anticorpo anti-PKC (10800) a reacção com o PKCα, b1, b2, ô, isoformas £ e r | S2-013 em células. Imunotransferência dos imunoprecipitados revelou que a co-imunoprecipitada com a PKC (Fig. 3A) ANX7. expressão PKC não era particularmente elevada, mas havia quantidades significativas em complexos imunoprecipitados-ANX7 sem secretagogos PKC. Os efeitos de derrubar ANX7 na regulação da actividade de PKC foram investigados utilizando Western blotting utilizando um anticorpo anti-fosfo-PKC (9379), que detecta as PKCs clássicos (α, β1, β2 e γ) e novos PKCs (δ, ε, η e θ) quando fosforilada no resíduo de um homólogo de Thr514 PKCγ (Fig. 3B). ANX7 knockdown fosforilação induzida de PKC em células S2-013, indicando que ANX7 desempenha um papel na diminuição de PKC fosforilada. Para investigar a co-localização subcelular de ANX7 e PKC fosforilada, S2-013 células foram imunocoradas. ANX7 e PKC fosforilada foram colocalized em saliências lamellipodial-like (setas na Fig. 3C). Curiosamente, ANX7 e PKC fosforilada foram recrutados e co-localizada com os bordos de ataque durante a cicatrização de feridas de células S2-013 (setas na Fig. 3d), o que indica que a PKC fosforilada está associada com a função anti-invasiva de ANX7. Desde ANX7 poderia funcionar na diminuição da actividade da PKC (Fig. 3B), a inibição dependente da ANX7 de invasão de células é susceptível de ser associada com a actividade diminuída das isoformas específicas de PKC clássicas ou novos. Assim, novos experimentos para análise da inibição BART-ANX7-associado da invasão de células foram focada nas isoformas PKC clássicas e inovador para que reagiram ao anticorpo anti-fosfo PKC (9379).

A. A imunoprecipitação de ANX7 endógeno ou a partir da PKC S2-013 células. Os imunoprecipitados foram analisados ​​por transferência de Western utilizando anti-ANX7 e anticorpos anti-PKC. IgG normal de rato ou de coelho foi usado como controlo de isotipo para ANX7 ou PKC, respectivamente. B. mancha de Western com anti-PKC e anticorpos anti-fosfo-PKC mostrando S2-013 células transitoriamente transfectadas com ARNsi para ANX7 em comparação com células transfectadas com controlo scrambled. coloração C. imunocitoquímica em S2-013 células, como determinado com anti-ANX7 (verde) e anticorpos anti-fosfo-PKC (vermelho). Azul, coloração DAPI. Flechas, colocalized ANX7 e PKC fosforilada na saliências lamellipodial-like. Bar, a 10 uM. células D. Confluent S2-013 ficaram feridos. Após 4 h, as células foram marcadas usando anti-ANX7 (verde) e anticorpos anti-fosfo-PKC (vermelho). Azul, coloração DAPI. Flechas, colocalized ANX7 e PKC fosforilada na vanguarda. Bar, 10 mm.

fosforilada PKC induz a invasão de células de células PDAC

Um estimulador PKC, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) é um potente promotor de tumor [21] que induz a migração de fibroblastos subconjuntivais [19] e células de glioblastoma [9]. PMA interage com e activam isoformas de PKC ambas as clássicas e novas [21]. Assim, foi investigado o efeito de PMA na invasão de células de S2-013 e PANC-1. Immunoblotting utilizando anticorpos anti-fosfo-PKC anticorpo (9379) revelou que o tratamento com PMA aumentou PKC activas (Fig. 4A). PMA estimulou significativamente a invasão de células de S2-013 e PANC-1 em

In vitro

ensaios de invasão (Fig. 4B), indicando que as isoformas da PKC-PMA sensíveis contribuir para a capacidade de invasão de células PDAC. Para confirmar que a invasão induzido por PMA foi dependente de PKC activas, as células foram inicialmente tratadas com um inibidor de PKC (calfostina C, um inibidor de PKC ambas as clássicas e novas) e, em seguida, tratado com PMA. O tratamento inicial com o inibidor de PKC impediu o aumento induzido por PMA na actividade da PKC (Fig. 4A) e inibiu a invasão de células mediada por PMA de S2-013 e PANC-1 (Fig. 4B). Estes resultados indicam que isoformas específicas de PKC clássicas e novas poderia induzir a invasão de células PDAC.

A. S2-013 e células PANC-1 pré-tratadas com ou sem calfostina C foram tratados com PMA, e a actividade da PKC foi determinada por Western blotting com um anticorpo anti-fosfo-PKC. células B. S2-013 e PANC-1 tratadas como em (A) foram semeadas em câmaras de invasão de Matrigel. células invadidas em quatro campos por grupo foram contadas. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Colunas

, média;

bares

, SD. *

p Art 0,001; **

P

0,003 em comparação com células não tratadas de controlo. células C. S2-013 foram tratados com ou sem PMA, e coloração imunocitoquímica foi realizada utilizando anticorpos anti-E-caderina e anticorpos anti-catenina-p (verde). Azul, coloração DAPI; barras, de 10 um.

a adesão célula-célula pode também influenciar a motilidade [22]. Após a formação de contactos célula-célula, células reduzir a sua actividade taxa de migração e de superfície celular saliência, e diminuir os microtúbulos e filamentos de actina-dinâmica [23]. Para determinar o efeito das PKC clássicas e novas em contacto célula-célula, S2-013 células foram incubadas com PMA e imunofluorescência foi realizada utilizando anticorpos anti-E-caderina e anticorpos anti-β-catenina (Fig. 4C). PMA reduziu significativamente proteínas de junção em regiões do contato célula-célula, indicando diminuição da localização periférica de proteínas de junção, resultando em junções de adesão com a diminuição da estabilidade. Estes resultados sugerem que a PKC-PMA sensíveis desempenhar um papel na diminuição da estabilidade dos contactos célula-célula e, por sua vez, induzir a invasão de células.

Bart suporta a ligação de ANX7 para PKC e funções activa em diminuindo PKC activa

para determinar o efeito dos complexos de Bart-ANX7 na regulação da actividade de PKC, foram investigados os efeitos do Bart knockdown na afinidade para ANX7 PKC constitutivamente activado por tratamento com PMA (Fig. 5A). estimulação PMA causado aumentos significativos na quantidade de complexos ANX7-PKC em células de controlo, enquanto que não houve diferenças em células BART RNAi S2-013. Além disso, se a ligação pode ser inibida pelos inibidores de PKC antes da estimulação das células de controlo com PMA foi avaliada. Calfostina C e cloreto de queleritrina (um inibidor de PKCα, β, γ e δ) diminuiu marcadamente interacção ANX7-PKC em células de controlo estimuladas com PMA-(Fig. 5A). Além disso, Bart imunoprecipitados com quantidades crescentes de ANX7 S2-013 quando as células foram tratadas com PMA, e a pré-incubação com calfostina C inibiu o aumento na ligação (Fig. 5B). Análise imunocitoquímica foi realizada para examinar a localização intracelular de complexos ANX7-PKC induzida por PMA em células Bart ARNi S2-013 (Fig. 5C) e controlo. ANX7 colocalized com PMA PKC-estimulados em células de controlo (setas na Fig 5C.); no entanto, BART knockdown impedido ligação de ANX7 e PKC PMA-estimulados (setas na Fig. 5C). Além disso, experimentos IP usando anticorpo PKC anti-fosforilada (9379) confirmou que derrubar BART inibiram a ligação de ANX7 e PKC fosforilada (Fig. 5D, E).

A. A imunoprecipitação a partir de células de PKC Bart S2-013 ARNi de controlo e estimuladas por PMA com ou sem pré-tratamento de calfostina C ou cloreto de queleritrina foi examinado por transferência de Western utilizando anti-ANX7 e anticorpos anti-PKC. *, ANX7 com PKC co-imunoprecipitados em células Bart ARNi S2-013. B. A imunoprecipitação a partir do Bart S2-013 células tratadas como em (a) foi analisado por transferência de Western utilizando anti-ANX7 e anticorpos anti-Bart. C. coloração imunocitoquímica de controlo (painéis superiores) e Bart RNAi (painéis inferiores) S2-013 células estimuladas por PMA, utilizando anticorpos anti-ANX7 (vermelho) anti-PKC (verde) e. Azul, coloração DAPI. Setas, ANX7 colocalized com PKC PMA-sensíveis em células de controlo; pontas de seta, PKC PMA-sensíveis não colocalized com ANX7 em células BART RNAi. Bares, 10 ^ m. D. A imunoprecipitação de PKC fosforilado a partir de células Bart S2-013 ARNi de controlo e foi examinado por transferência de Western utilizando anti-ANX7 e anticorpos anti-fosfo-PKC. E. análise densitométrica dos resultados da Figura 5D. O nível de ANX7 nos precipitados foi avaliada após a normalização ANX7 sinais para sinais fosfo-PKC de lisados ​​celulares. blot F. ocidental com anticorpos anti-BART e anti-fosfo-PKC mostrando dois S2-013 clones transfectadas com siRNA para BART (siBART-1 e 2) em relação ao controle simulada (Neo-1) e mexidos (SCR-1) clones.

células BART RNAi S2-013 tinham níveis elevados de PKC ativos e inalterados os níveis estáveis ​​de PKC (Fig. 5F). Este resultado indica que Bart pode ser associado com níveis reduzidos de PKC activa. Nós supomos que regula Bart interacções entre ANX7 e formas activas de PKC-alvo como uma molécula de esqueleto e /ou uma proteína de carga ANX7, permite ANX7 para diminuir a actividade da PKC-alvo, e, por sua vez, inibe a invasão da célula.

PKC actividade não é regulada directamente pela ANX7

Para investigar o papel da PKC na regulação da fosforilação de ANX7, como relatado anteriormente em células cromafins [8], células S2-013 e PANC-1 foram marcadas metabolicamente com [

32P] -orthophosphoric ácido, e depois estimuladas com PMA. A-ANX7 marcado radioactivamente foi imunoprecipitado com anticorpo monoclonal anti-ANX7 e foi analisada por imagiologia de fósforo (Fig. 6A). Se ANX7 é um substrato de PKC específicos, o nível de fosforilação ANX7 deve resultar em um aumento significativo de alterações em resposta ao AMF. No entanto, a estimulação com PMA não aumentou os níveis de fosforilação ANX7 em qualquer linha de células. Em seguida,

In vitro

ensaios de fosforilação foram usadas para determinar se a actividade de PKC foi directamente regulada pela ANX7 (Fig. 6B). cérebro de rato purificada, com uma pureza de 95% e contendo isoformas de PKC clássicas e novas, foi incubado com a proteína recombinante ANX7 com ou sem proteína recombinante Bart. ANX7 não alterou a actividade de PKC e proteína Bart adição, não foi associada com regulação da actividade de PKC. Estes resultados sugerem que ANX7 não é um substrato da PKC, e que ANX7 não altera os níveis de fosforilação da PKC-alvo diretamente.

A. células S2-013 e PANC-1 foram prelabeled com [

32P] ácido -orthophosphoric e estimuladas ou não com PMA. ANX7 foi imunoprecipitada, separadas por SDS-PAGE e analisadas por autorradiograf ia. Uma imunotransferência foi realizada no lisado de células como um controlo de carga. B.

In vitro

ensaios de fosforilação para investigar o efeito de BART e ANX7 em PKC-fosforilação. cérebro de rato purificada foi incubada com ANX7 recombinante com ou sem Bart recombinante. Os produtos da reacção foram analisados ​​por um ensaio ELISA. ABS em

Y

-axis significa absorvência a 492 nm como referência, medida com um leitor de microplacas.

PKCα está associada com complexos BART-ANX7

Para identificar específica isoformas de PKC que se ligam a ANX7 neste sistema, um perfil de expressão precisa de PKC clássicas e novas foi gerado através de Western blotting utilizando anticorpos anti-fosfo individuais-PKC em células derivadas de Bart ARNi S2-013 (Fig. 7A). Uma vez que os níveis de fosforilação de PKC-alvo foram aumentados em células Bart RNAi (Fig. 5f), regulados positivamente fosfo-PKcs em células Bart ARNi foram seleccionados para posterior análise. Entre estes, PKCα foi significativamente ativado por BART knockdown no S2-013. Além disso, foi abundantemente PKCα fosforilado em células de ARNi ANX7 S2-013 e PANC-1 (Fig. 7B). Em seguida, a ligação de ANX7 com PKCα fosforilado foi demonstrado através de imunoprecipitação e análise Western blot em S2-013 células (Fig. 8A). A fosfo-PKCη não foi imunoprecipitada com ANX7. Para investigar a co-localização subcelular de PKCα fosforilada, S2-013 células foram imunocoradas. Fosforilada PKCα foi localizada em saliências lamellipodial-like (setas na Fig. 8B). Além disso, ANX7 e PKCα fosforilados foram recrutados para os bordos de ataque durante a cicatrização de feridas de controlo S2-013 células (painéis superior, na fig. 8C). Esgotamento de BART não induziu acumulação de ANX7 nos bordos de ataque e de co-localização posterior com PKCα fosforilada (painéis inferiores na Fig. 8C). Estes resultados indicam que PKCα é interdependente associada a BART e ANX7 na modulação da migração celular PDAC.

A. Western blot com anticorpos contra as isoformas PKC clássicas e novas que mostram dois S2-013 clones transfectadas com siRNA para BART, em comparação com simulação e mexidos clones de controle. oligonucleotídeos B. siRNA segmentação ANX7 e controle mexidos negativo foram transitoriamente transfectados em S2-013 e células PANC-1. Western blot com anticorpos contra as isoformas PKC clássicas e inovadoras foi realizada.

A. A imunoprecipitação de ANX7 (esquerda painéis) ou fosfo-PKCα (painéis da direita) de S2-013 células foi examinado por transferência de Western utilizando anticorpos contra ANX7, fosfo-PKCα e fosfo-PKCη. B. imunocitoquímica coloração em células S2-013, tal como determinado com o anticorpo anti-fosfo-PKC (verde). Azul, coloração DAPI. Flechas, PKC fosforilada na saliências lamellipodial-like. Bar, a 10 uM. culturas C. confluentes de células BART RNAi S2-013 controle e foram feridos. Após 4 h, as células foram marcadas usando anti-ANX7 (verde) e anticorpos anti-fosfo-PKCα (vermelho). Azul, coloração DAPI. Bares, 10 mm.

inibidores específicos de PKCα inibem o aumento da migração celular por knockdown de BART e ANX7

Para examinar se a sinalização PKCα está envolvido no aumento da migração por BART ou knockdown ANX7 em S2-013, um inibidor /β1 PKCα Ro-32-0432 e uma safingol inibidor PKCα específicas foram aplicados em

in vitro

ensaios de invasão. Como mostrado na Fig. 9A e 9B, PKCα fosforilado foi especificamente diminuiu-Ro 32-0432 e safingol tratamento, mas as expressões de fosfo-PKCη não foi alterada. A maior migração de células S2-013 ocorreu após derrubar BART ou ANX7; No entanto, o aumento da migração foi inibida por pré-incubação com Ro-32-0432 (Fig. 9C) e safingol (Fig. 9D). O aumento da capacidade de invasão de Bart ou knockdown ANX7 não foi impedido pela pré-incubação com um inibidor pseudosubstrate PKCη com ácido mirístico (Figura 9E.) E um inibidor PKCδ (rottlerin; dados não mostrados). Estes resultados sugerem que a activação de PKCα é necessária para a migração celular induzida por Bart PDAC ou knockdown ANX7.

. células BART RNAi S2-013 e S2-013 células transitoriamente transfectadas com ANX7-siRNA foram pré-tratados com ou sem Ro-32-0432. A actividade de PKCα e η foi avaliada por Western blotting. B. Células mostrado em (A) foram pré-tratadas com ou sem safingol. A actividade de PKCα e PKCη foi avaliada por Western blotting. C. O efeito de Ro-32-0432 na invasão de células foi investigada utilizando o ensaio Transwell invasão. As células migraram em quatro campos por grupo foram contados. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Colunas

, média;

bares

, SD. *

P

0,001 em comparação com células não tratadas. D. O efeito de safingol na invasão de células foi investigada utilizando o ensaio Transwell invasão. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Colunas

, média;

bares

, SD. *

p Art 0,001; **

P

0,003 em comparação com células não tratadas. E. O efeito da rottlerin e pseudosubstrate PKCη inibidor na invasão de células foi investigada utilizando o ensaio Transwell invasão. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Colunas

, média;

bares

, SD.

Discussão

PDAC é um dos cancros mais mortais, devido à sua capacidade de invadir tecidos circundantes extensivamente e metástase em um estágio inicial [24 ]. infiltração local extensa e metástase são as principais causas de morte no PDAC [25]. À luz do papel do BART na inibição da invasão de células PDAC, este estudo foi desenhado para identificar o BART proteínas associadas com a capacidade de invasão das células PDAC vinculativo. As principais características deste relatório são os seguintes:.

BART e ANX7 podem funcionar juntos em complexo de inibir a migração celular

BART e ANX7 pode inibir a invasão de células, diminuindo PKC ativa em bordos de ataque.

fosforilada PKCα é responsável pelo aumento da capacidade de invasão das células PDAC observados com BART ou knockdown ANX7. PKCα é interdependente associada a BART e ANX7 na modulação da capacidade de invasão das células PDAC.

Foi observada perda frequente de expressão ANX7 no câncer de próstata, especialmente em metástase e recorrência local da doença hormônio refratário [7]. Considerando nula

ANX7

– /- ratos morrerem durante a embriogênese, camundongos heterozigotos ANX7 (

ANX7

+/-) desenvolver, amadurecer e idade normalmente, e mais interessante, tem um fenótipo de câncer-propensos [10]. Uma ampla gama de tumores espontâneos foram detectados em

ANX7

+/- ratinhos, incluindo no fígado, da próstata, do endométrio, glândulas salivares, timo e [11]. No rato, haploinsuficiência de expressão ANX7 parece conduzir progressão para o câncer por causa da instabilidade genômica através de uma via de sinalização discreta envolvendo outros genes supressores tumorais, genes de reparação do ADN e os genes relacionados com a apoptose. Os nossos dados sugerem que Bart e ANX7 desempenhar um papel na diminuição do nível de fosforilação em células PKCα PDAC.

In vitro

experimentos não conseguiram demonstrar que ANX7 diminuiu diretamente a atividade da PKC (Fig 6B.); No entanto, a Fig. 6A mostra definitivamente que ANX7 não foi um substrato da PKC nas células PDAC. Embora o mecanismo pelo qual ANX7 regula a actividade de PKC permanece desconhecida, é notável que Bart e ANX7 poderia funcionar em conjunto para diminuir a actividade da isoforma PKCα e, por sua vez, suprimir a capacidade de invasão de células PDAC. Essa avaliação estudo permitiu de uma via de sinalização celular regulada pela

ANX7

gene supressor de tumor no PDAC. Mais estudos são necessários para determinar quais as moléculas de suprimir diretamente PKCα e identificar substratos precisas de PKCα, a fim de compreender os mecanismos envolvidos na inibição BART-ANX7 mediada da invasão celular.

O papel da PKCα no PDAC migração celular não tem sido extensivamente estudada. Diversas linhas de evidência indicam que PKCα desempenha um papel crítico na proliferação celular /migração /invasão, incluindo câncer humano pouco diferenciado hepática [26], o cancro endometrial [27] e câncer gástrico [28]. Celular vias envolvendo a família de sinalização PKC, são iniciadas através da ligação de um ligando, tal como um factor de crescimento, para o seu respectivo receptor de superfície celular, o que desencadeia a repartição de fosfolípidos por fosfolipases C e D e de produção de diacilglicerol (DAG). DAG se liga e activa a maioria das isoformas da PKC, as quais, em seguida, translocar para compartimentos subcelulares específicos, que variam dependendo do tipo de célula e da isoforma da PKC. Em última análise, MAPKs, incluindo a proteína quinase extracelular-sinal regulada (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK), e p38MAPK, desempenham um papel crucial na migração celular mediada por PKC PMA-activado [19], [29 ]. Isso Bart e ANX7 anular a fosforilação de ERK em células PDAC foi demonstrada (dados não mostrados), sugerindo que PKCα pode estar associada com a modulação da actividade de ERK possivelmente associada com a inibição-Bart-ANX7 relacionada de invasividade. Além disso, é possível que a exocitose induzida PKCα modula a migração celular. Assim, estudos futuros de PKCα são necessários para caracterizar ainda mais a sua função exocitic e elucidar sua potencial contribuição para a migração celular.

Em resumo, os resultados apresentados neste estudo são de suporte dos papéis fundamentais do BART na regulação coordenada da atividade PKCα

via

ligação com ANX7. O significado funcional da Associação do Bart, ANX7 PKCα e na modulação da capacidade de invasão de células PDAC foi estabelecida. É possível que Bart e distintamente ANX7 pode regular a sinalização a jusante de PKCα que potencialmente relevante para a invasão de células, actuando como moléculas anti-invasivos.