Abstract

metástase peritoneal é o tipo mais frequente de recorrência em pacientes com câncer gástrico (GC) e está associada a Prognóstico pobre. Peritoneal citologia lavagem, utilizada para avaliar o risco de metástases peritoneais, tem uma baixa sensibilidade. Aqui, nós avaliamos o potencial de diagnóstico de exosomal perfis de miRNA no líquido peritoneal para a previsão de disseminação peritoneal em GC. O ARN total foi extraído a partir de exossomas a partir de seis isolados de ascites malignas gástricas (MA), 24 amostras de amostras de fluido de lavagem peritonial (FLP), e os sobrenadantes de cultura (CM) de duas linhas celulares de carcinoma gástrico humano que diferem no seu potencial de metástases peritoneais. Expressão de miRNAs exosomal foi avaliado com microarrays Agilent miRNA Humano e RT-PCR quantitativa (qRT-PCR). A análise indicou uma micromatriz baixa variabilidade no número e na intensidade de sinal de miARNs detectadas entre as amostras. Nos seis fluidos MA, miR-21 apresentou a maior intensidade de sinal. Foram identificados cinco miRNAs (miR-1225-5p, miR-320C, miR-1202, miR-1207-5p e miR-4270), com alta expressão em amostras MA, o PLF de GC serosa-invasivo, eo CM de um linha de células GC altamente metastático; estas espécies de miRNA candidatos parecem estar relacionados à disseminação peritoneal. A expressão diferencial de miR-21, o miR-320c, e miR-1225-5p foi validado no PLF de serosa-invasivo e não-invasivo de GC por qRT-PCR e miR-21 e miR-1225-5p foram confirmados para ser associado com invasão serosa no GC. FLP pode ser usado para a expressão de perfil miARNs exosomal. Nossos resultados sugerem que miR-21 e miR-1225-5p podem servir como biomarcadores de recidiva peritoneal após a ressecção curativa GC, proporcionando assim uma nova abordagem para o diagnóstico precoce de disseminação peritoneal de GC

Citation:. Tokuhisa M, Ichikawa Y, Kosaka N, Ochiya t, Yashiro H, Hirakawa K, et al. (2015) Exosomal miRNAs de Peritoneum Lavage Fluid como potenciais prognósticos Biomarcadores de Peritoneal metástase em câncer gástrico. PLoS ONE 10 (7): e0130472. doi: 10.1371 /journal.pone.0130472

editor: Soheil S. Dadras, da Universidade de Connecticut Health Center, United States |

Recebido: 01 de fevereiro de 2015; Aceito: 20 de maio de 2015; Publicação: 24 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Tokuhisa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

MicroRNAs (miARNs) são pequenos (19-23 nucleótidos) não-codificante ARN que funcionam como reguladores de pós-transcricional da expressão génica e desempenham um papel importante no controlo de diversos processos biológicos, incluindo a diferenciação celular, proliferação, e apoptose [1]. MiRNAs ter sido demonstrado ter actividade oncogénica ou supressoras de tumor, e desregulada expressão de muitas espécies de miARN foi detectado em vários cancros, sugerindo a aplicação potencial de miARNs como biomarcadores de progressão e metástase [2-5] cancro.

miRNAs são embrulhados em microvesículas secretoras (por exemplo exossomos, corpos apoptóticos e microvesículas derramamento), que miRNAs escudo da degradação por RNAse e servem como veículos para a secreção de miRNA em fluidos do espaço e do corpo extracelulares. Os exossomas são pequenas vesículas membranosas que têm sido implicados em respostas imunes celulares; No entanto, recentemente, tornou-se evidente que os exossomas contêm quantidades substanciais de ARN e pode estar envolvida em mecanismos de regulação imuno-independente. Foi agora estabelecido que exossomas pode executar a transferência intercelular de miARN, participando, assim, em mecanismos de sinalização baseados em miARN [6]. Níveis mais elevados de exossomas contendo miARN também foram detectados no plasma de pacientes de cancro do que em indivíduos saudáveis ​​que de [7], sugerindo que a secreção de miARN à base de exossoma está envolvida no desenvolvimento do cancro. Análise de expressão miRNA aberrante no soro, saliva, fezes e urina tem sido empregado para a detecção precoce do linfoma de células B, e, intestinais e cancros da bexiga orais [8-11].

O câncer gástrico (GC) é a segunda causa mais comum de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [12]. O peritônio é o local mais comum de metástase e recorrência de GC, e ascite maligna (MA), causada pela disseminação peritoneal de células de câncer, têm sido associados com mau prognóstico. Actualmente, não há preditores fiável para o desenvolvimento de ascites malignas peritoneal em pacientes de GC. exossomas contendo miARN representar um novo mecanismo de sinalização intercelular e podem proporcionar perspectivas sobre o meio ambiente que permite a difusão do cancro no peritoneu [13].

Neste estudo, os exossomas foram isolados a partir de MA e o fluido de lavagem peritoneal intraoperatória amostras (FLP) obtidos a partir de pacientes de GC, e o meio de cultura (CM) de linhas de células peritoneais altamente invasivos, e foram, em seguida, extraiu-se miARNs a partir destas amostras. A qualidade dos miRNAs exosomal extraídos ea coerência dos padrões de expressão de miRNA foram verificados. perfis de expressão miRNA em MA, PLF, e as amostras de CM foram comparadas e foram identificados miRNAs candidatos relacionados à disseminação peritoneal de GC.

Materiais e Métodos

Os pacientes

Todos os pacientes ou seus responsáveis ​​fornecida consentimento informado por escrito. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Hospital da Universidade da Cidade de Yokohama (Aprovação No. A110127001) Ética.

MA e intra-operatórias amostras PLF foram coletadas de pacientes GC com as características clinicopatológicas apresentados na Tabela 1. Todos os pacientes tinham sido previamente diagnosticado com GC por análise histopatológica de amostras de biópsia retiradas das lesões primárias, e seis pacientes MA tinha sido diagnosticada pela presença de ascite por tomografia computadorizada abdominal (TC). A ascite foram também analisadas por citologia e todos foram confirmadas como positivas para malignidade por patologistas; as amostras MA restantes foram utilizados para o isolamento de miARN. PLF foi intra-operatório coletadas de 24 pacientes do GC (Tabela 1). Após laparotomia, 100 ml de solução salina normal foi vertida para o saco de Douglas e de água de lavagem peritoneal foi recolhido antes da ressecção cirúrgica do tumor. PLF foi analisada por citologia e utilizado para o isolamento de miARN. Entre as 24 amostras PLF, seis foram testadas usando miRNA microarray e 18 foram analisadas por qPCR

adenocarcinoma bem diferenciado (bem).; adenocarcinoma moderadamente diferenciado (mod); mal adenocarcinoma diferenciado (pobres). ascite maligna (MA); lavado peritoneal (PLF); palco TMN (UICC 7ª edição); Presente (P) ausente (A); Peritoneal citologia lavagem (CY);

cultura celular

A linha de células OCUM-2M foi estabelecida a partir de um tumor primário do carcinoma gástrico scirrhous ea linha de células OCUM-2MD3 foi obtido a partir células OCUM-2M com um elevado potencial de disseminação peritoneal em camundongos nus [14]. As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado com soro a 10% inactivado pelo calor fetal de bovino (FBS) e antibiótico-antimicótico a 37 ° C num CO 5%

2 incubadora. Para obter CM de células, as células OCUM-2M e OCUM-2MD3 foram lavadas três vezes com DMEM isento de soro suplementado com antibiótico-antimicótico e incubadas no mesmo meio durante 48 h.

Isolamento de exossomas

As amostras para isolamento exossomo foram preparados como descrito previamente [15]. Para remover partículas celulares e detritos celulares, MA, FPP, e cm Grande foram centrifugadas a 2000 ×

g

durante 15 min a 4 ° C e filtrada através de um filtro de 0,22 mícrons (Millipore, Billerica, MA). O sobrenadante foi armazenado a -80 ° C até ser necessário para a extracção de miARN.

Para precipitar exossomas, as amostras foram centrifugadas a 110000 ×

g

durante 70 min a 4 ° C. O sedimento exossomo foi lavada com 11 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e centrifugado outra vez, como descrito. O sedimento foi utilizado para extracção de ARN.

extracção de ARN total e análise

O ARN total foi extraído a partir de exossomas usando um kit miRNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante e foi em seguida, armazenada a -80 ° C até análise posterior exigido.

A qualidade, concentração e tamanho de ARN total exosomal foram avaliados usando Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Foster City, CA). Antes da análise, o ARN total foi preparado utilizando um kit de ARN Pico Agilent 6000 (Agilent Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante.

miARN microarray

MiRNAs extraídos do seis MA, seis PLF, e duas amostras de CM foram analisados ​​usando Agilent Humano miRNA microarrays (Agilent Technologies), que contêm 1.226 miRNAs humanos e 146 miRNAs virais humanas. Para a detecção de miARN, 100 ng de ARN foi marcado e hibridado utilizando o kit humano miARN Microarray (REL 16,0; Agilent Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante (miARN Labeling kit completo e Hyb para miARN Microarray System). sinais de hibridização foram detectados com um G2505C DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies) e as imagens digitalizadas foram analisadas usando o Software Feature Extraction Agilent (v. 10.7.3.1). A análise dos dados foi realizada utilizando software Agilent GeneSpring GX v. 11.0.2. (Log

2 transformação). transformação de linha de base não foi realizada.

A qualidade da extração de miRNA foi analisada de acordo com a variabilidade no número de espécies de miRNA detectou-microarray, a intensidade do sinal, ea correlação de expressão miRNA entre as amostras de acordo com a média ± SD, coeficiente de variação (CV) e coeficiente de correlação (CC).

Seleção de miRNAs específicos de metástase peritoneal

Os perfis dos miRNAs exosomal expressão foram analisados ​​para selecionar miRNAs que são específicos para peritoneal GC difusão usando a seguinte abordagem passo a passo. Passo 1: Perfis de miARN no CM das células OCUM-2MD3 peritoneais altamente metastáticos foram comparados com os das células não metastático OCUM-2M parentais, e miARNs expressos diferencialmente (média dobra-mudança, 2) foram seleccionadas

Passo 2: seis amostras PLF foram classificados em dois grupos: T4 (n = 4) e T1-T3 (n = 2), de acordo com o estágio do câncer pelo tamanho do tumor e extensão (UICC-AJCC, 7

ª edição). Estágio T4 GC é caracterizado por a frequência mais elevada de metástases peritoneais, em comparação com outras fases [16]. Os perfis de expressão de miARN grupo T4 foram comparados com aqueles do grupo T1-T3 e miARNs expressos diferencialmente (média dobra-mudança, 2) foram seleccionadas

Passo 3:. Os miARNs seleccionadas que eram comuns aos e ambos os passos que foram expressos em MA foram posteriormente filtradas de acordo com a intensidade do sinal. Aqueles com valores de intensidade de mais do que log

2 10 em MA e PLF foram seleccionados como candidatos miARNs relacionadas com metástases peritoneais; miR-21 apresentou a maior intensidade média do sinal entre as amostras MA. A expressão diferencial de espécies de miRNA seleccionado no passo 3 foi validado nas 18 amostras PLF restantes por qRT-PCR.

A análise quantitativa de expressão miRNA específicos de metástase peritoneal por qRT-PCR

TaqMan microRNA os ensaios (Life Technologies) foram usadas para quantificar os níveis de expressão relativos de miR-21 (ID ensaio. 000397), o miR-320c (ensaio ID. 241053_mat), miR-1225-5p (ID ensaio. 002764), e miR-16 (ID ensaio. 000391). A transcrição reversa foi realizada utilizando o kit TaqMan miARN RT (Life Technologies) de acordo com as seguintes condições: 30 min a 16 ° C, 30 min a 42 ° C e 5 min a 85 ° C. A PCR foi realizada em placas de 96 poços utilizando o tempo real PCR System 7500 (Life Technologies); Todas as reacções foram realizadas em triplicado. Os níveis de miARN alvo de expressão foram normalizadas para que de miR-16, que foi utilizado como um controlo estavelmente expressa [17]. Ao analisar os dados de microarranjos de exosomal miRNA em amostras de ascite maligna, miR-16 apresentou o menor coeficiente de variação (CV = 4%) entre os padrões internos candidatos, incluindo miR-638 (CV = 8%), deixe-7a (CV = 8%), e 142-3p (CV = 23%).

A análise estatística

As variáveis ​​contínuas foram comparadas por meio de Student

t

-teste. Quando necessário, o

t

-test foi modificado para comparar variâncias desiguais. A diferença entre as variáveis ​​categóricas foi avaliada utilizando o teste exato de Fisher. Correlação entre duas variáveis ​​foi avaliada pelo coeficiente de correlação de Pearson. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a P 0,05. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS 21.0 para Windows (IBM, Armonk, NY).

Resultados

A análise quantitativa de RNA extraído exosomal

O RNA total foi extraído de exossomos isolados de MA, PLF intra-operatório, e CM celular. A concentração média do RNA exosomal extraído foi de 4,4 ng /mL (entre 1,2 e 6,1 ng /mL) para MA e 6,4 ng /mL (1,7-16,4 ng /mL) para o PLF. Eletroferogramas revelou uma grande proporção de espécies de ARN de pequenas presentes em todas as amostras clínicas e CM, enquanto que nenhuma ou muito pouca contaminação com 18S e 28S de ARN ribossomal (não há picos distintos no peso molecular correspondente) foi observado (Figura 1).

Variação e comunalidade entre as amostras. Avaliação de ARN total exosomal utilizado um Bioanalyzer 2100. Os electroferogramas mostram a distribuição do tamanho (nucleótidos, nt) e a intensidade de fluorescência (UF) de ARN total isolado a partir de exosomal CM, MA, e PLF. O menor aumento (cerca de 25 nt) em cada amostra é o marcador do kit Pico Agilent RNA 6000.

Desempenho de microarrays miRNA

Para testar a expressão de microarrays exosomal miRNA em cada grupo de amostras, examinámos o número de miARN detectados, percentil da intensidade do sinal, o número de miARNs geralmente capturados, e a correlação da expressão de miARN entre os grupos. O número de espécies de miARN detectadas em cada grupo por microarranjo é mostrado na Figura 2. Na seis MA e seis amostras PLF, estes significam números eram 490,1 (DP = 42,3; CV = 8,6%) e 367,5 (DP = 13,4; CV = 3,6%), respectivamente. Em cada grupo, a variabilidade do número de miARNs detectada entre amostras foi baixa

distribuição de intensidade de sinal de cada grupo está apresentada na Fig. 3; esta mostra os sinais processados ​​normalizados para o 25, 50, 75, e 90

percentil em cada grupo. Na década de 50

percentil, o log

2 intensidades de sinal relativos de MA (Figuras 3-1) e PLF (Figuras 3 e 2) amostras e entre os três grupos (MA, PLF, e CM, Figuras 3 e 4) foram 5,53 ± 0,19 (CV = 3,49%), 6,14 ± 0,24 (CV = 3,87%), e 4,97 ± SD (CV = 5,24%), respectivamente. A variabilidade da intensidade do sinal entre as amostras em cada grupo, bem como entre os grupos foi baixa.

O número de miRNAs comuns entre as amostras do MA, PLF, e grupos CM foram 327, 263 e 354, respectivamente, enquanto que este foi 194 para os três grupos (Fig 4).

a Tabela 2 mostra a correlação de expressão miRNA entre cada duas amostras. Os valores mais elevados e menor CC foram de 0,94 e 0,68, respectivamente; CC média de todas as amostras foi de 0,79 (CV = 8,86%). Em MA, PLF, e os grupos CM, os valores médios de CC foram 0,85, 0,88, e 0,90, respectivamente, e a variabilidade nos perfis de expressão para cada grupo foi baixa.

Seleção de miRNAs candidatos relacionados à disseminação peritoneal

até o momento, não existem dados já estão disponíveis nos perfis dos miRNAs exosomal associados à disseminação peritoneal de expressão, devido à indisponibilidade de fluidos normais ascítico contra o qual comparar os perfis de expressão MA. Foram selecionados miRNAs relacionados à disseminação peritoneal usando uma abordagem passo a passo. O número de miRNAs comumente capturados nas seis amostras MA foi 327. nas etapas 1 e 2, 140 e 118 miRNAs específicos de metástase foram selecionados nos grupos CM e PLF, respectivamente. A partir desses 327, 140 e 118 miRNAs, cinco miRNAs foram selecionados como candidatos relacionados à disseminação peritoneal (Fig 5). Duas delas (miR-1225-5p e miR-320c) e miR-21 com a maior intensidade de sinal entre os miARNs específica-MA foram validadas como sendo expressas diferencialmente em 18 amostras PLF, utilizando qPCR (Tabela 3).

representação esquemática da abordagem passo a passo para a triagem miRNAs relacionada à disseminação peritoneal. Passo 1: selecção de miARNs expressos diferencialmente (fold-change, 2) em meio de cultura (CM) da linha celular peritoneal altamente metastático OCUM-2MD3 (linha celular parental OCUM-2M foi usado como controlo). Passo 2: seis (FLP) amostras de fluido de lavagem peritoneal foram divididos em T4 (n = 4) e os grupos T1-T3 de acordo com a fase do cancro gastrointestinal; miARNs expressos diferencialmente (fold-change, 2) no grupo de T4 foram selecionados. Passo 3: as espécies de miRNA selecionados comuns para as etapas 1 e 2 e expressos em ascite maligna (MA), com intensidade de sinal de log foram consideradas

2 10 em MA e PLF como miRNAs candidatos relacionados a metástases peritoneais

ascite maligna (MA).; lavado peritoneal (PLF); médio condição (CM), T fase UICC 7

ª edição (T4, T1-3); OCUM-2M (2M); OCUM-2MD3 (D3).

Validação do candidato expressão miRNA por qPCR

Dezoito amostras PLF foram divididos em dois grupos de acordo com o estágio metastático, T4 (serosa perfurado, n = 9) e T1-T3 (subserosa ou menos, n = 9), e a expressão de miR-21, o miR-320c, e miR-1225-5p foi analisada por qRT-PCR. Figura 5 mostra que os níveis de miR-21 e miR-1225-5p em pacientes GC T4-estágio foram significativamente aumentados em comparação com os pacientes em T1-T3 (MIR-21, p = 0,027, e miR-1225-5p, P = 0,008; Figura 5). . A diferença na expressão de miR-320c entre dois grupos de pacientes não foi significativa (P = 0,928, Fig 6)

Um asterisco indica P 0,05.

Em seguida, a correlação entre os níveis de miRNA e quadro clínico dos pacientes GC foi examinado (Tabela 4). MiR-21 e miR-1225-5p expressão foi significativamente maior em pacientes com câncer de T4-stage do que em pacientes T1-T3-estágio (P = 0,015). Nenhuma correlação significativa foi encontrada entre a expressão de miRNA e outros parâmetros clínicos.

Discussão

Neste estudo, nós investigamos, pela primeira vez, o teor de miRNA de exossomos isolado do MA e PLF dos pacientes do GC. Nosso estudo mostra que miRNAs exosomal pode ser consistentemente extraído do MA e PLF e que perfis de expressão miRNA pode indicar o status de peritônio em pacientes GC.

O prognóstico da GC com invasão serosa continua pobre, mesmo após ressecção R0, porque da alta taxa de recorrência, especialmente metástases peritoniais (PM) [18]. PM em GC é o tipo mais complicada de recorrência, porque é difícil de prever, bem como para o diagnóstico. Embora ascite é o sintoma mais comum PM, muitos pacientes GC com PM não desenvolvem ascite. Entre os métodos de diagnóstico baseados em imagem, tomografia helicoidal de alta velocidade é amplamente utilizado para a avaliação do estadiamento pré-operatório de GC e pós-acompanhamento terapêutico; No entanto, no caso de PM sua precisão do diagnóstico é inadequada, principalmente por causa da baixa sensibilidade [19]. Utilizando PET-CT para o diagnóstico de AM em GC também é controverso, uma vez que foi reportado que a FDG-PET tem uma fraca sensibilidade para a detecção de AM em GC [20]. PLF tornou-se o próximo alvo para o diagnóstico e previsão de PM no GC. exame citológico do PLF no intra-operatório recolhida é usada para a previsão de recidiva peritoneal [21] e é utilizado para o estadiamento GC no Japão [22]. No entanto, alguns investigadores relataram que os FLP citologia não exibem a sensibilidade exigida para a previsão e detecção de AM [21], e propuseram o uso de métodos de diagnóstico molecular, tais como RT-PCR, para a detecção de micro-metástases em PLF. Em um estudo prospectivo, multicêntrico, a expressão de ARNm dos genes que codificam o antigénio carcinoembrionário (CEA) e citoqueratina 20 (CK-20), avaliada por RT-PCR, tem provado ser útil para a predição da sobrevivência global e PM no GC [23] . No entanto, a desvantagem dos métodos de diagnóstico baseados em ARNm é a elevada degradabilidade de ARNm no decurso dos procedimentos cirúrgicos.

Em contraste, miARNs fechados em exossomas permanecer estável e pode circular nos fluidos corporais, tais como soro, plasma , saliva, urina, leite materno, e lágrimas, por longos períodos de tempo [24, 25]; exossomos, também foram isoladas de MA no cancro do ovário [26].

Para o melhor do nosso conhecimento, não houve nenhum relatório sobre miRNAs exosomal isolados do PLF dos pacientes do GC. Levänen et ai. coletado exossomos de lavado bronco-alveolar e analisados ​​exosomal expressão miRNA para detectar espécies de miRNA relacionados à alergia [27]. Liu et al. relataram que exossomas isoladas a partir de fluido de lavagem genital do continham níveis elevados de miR-21, que podem ser utilizados como um biomarcador de cancro cervical [28]. Aqui, foram analisados ​​os perfis de miRNAs exosomal no PLF dos pacientes GC por tecnologia de microarray miRNA expressão, a fim de identificar os candidatos biomarcadores miRNA de diagnóstico para a previsão de metástase em GC.

Em nossa investigação, o primeiro leigo desafio no isolamento quantitativo a partir de exosomal miARN PLF. Weber et ai. avaliada a expressão de miARN em 12 fluidos corporais e relataram que a concentração de RNA total no fluido peritoneal foi 775 ug /L [25], que foi menor do que a que obtida a partir de MA e PLF-4400 e 6400? g /L, respectivamente, a razão para o diferença pode ser a metodologia utilizada para o isolamento do ARN total, por Weber et ai. diretamente extraído ARN a partir de fluido peritoneal, enquanto que nós isolado pela primeira vez exossomos e depois usou estes para extração de RNA. Análise da qualidade do ARN isolado a partir de PLF demonstrou uma abundância de pequeno ( 200 nt) espécies de ARN em CM e MA. Não houve distintas 18S e 28S ribosomal RNA picos na preparação, indicando a ausência de contaminação com ARN intracelular.

O segundo problema encontrado no presente estudo de consistência envolvido na qualidade dos miARNs exosomal isolado. No nosso estudo, observou-se menor variabilidade do número de espécies de miARN detectados e intensidade de sinal miARN, e uma alta correlação da expressão de miARN entre as amostras em cada grupo. Os números médios de miRNAs detectáveis ​​no MA e PLF foram 490 e 367, que estava de acordo com o número de miRNAs (397) previamente detectado no líquido peritoneal [25].

PLF e amostras MA apresentaram baixa variabilidade na intensidade de sinal (CV = 3,87% para os 50

percentil). Além disso, os padrões de expressão de miARN foram altamente correlacionadas entre amostras dentro de cada grupo (CC 0,850), bem como entre os grupos (0,8 CC 0,7). Estes resultados indicaram que PLF poderia ser uma fonte de alto rendimento de miRNAs de boa qualidade, que mostram padrões de expressão consistentes no ensaio de microarray.

Os perfis de expressão de miRNA foram analisados ​​para selecionar miRNAs específicos para a metástase peritoneal. MiR-21 apresentou maior expressão em pacientes com carcinoma de T4-fase em que as do grupo T1-T3. Fabbri et ai. relataram que o miR-21 e miR-29a em exossomas libertado-cancro afectado o crescimento do tumor e se espalhou através da ligação e activação de TLRs nas células do sistema imunológico e que rodeiam a indução de uma resposta inflamatória prometastatic [29]; esta apoiada a noção de que os exossomas derivadas de tumores contribuir para o microambiente premetastatic [30, 31]. Isso pode indicar que T4 exossomos derivados de carcinoma criar o nicho premetastatic no peritônio, que então suporta invasão peritoneal após a ressecção curativa do GC.

Usando uma abordagem passo a passo, foram selecionados cinco miRNAs exosomal (miR-320c , miR-1202, miR-1225-5p, miR-1207-5p e miR-7270) e validado expressão de miR-320 e miR1225-5p na PLF de 18 pacientes CG por qRT-PCR. Mir-1225-5p mostrou maior expressão de T4 de pacientes em fase CG T1-T3, o que confirma os resultados obtidos por micromatriz, ao passo que não foi observada diferença no miR-320 níveis entre os grupos de pacientes. Mir-1225 alvos do gene da doença renal policística,

PKD1

, que é frequentemente mutado na doença autossômica dominante renal policística; Assim, miR1225 pode afectar a progressão da doença [31]. No entanto, a relação entre o miR-1225 e o cancro permanece obscura. MiR-21 e miR-1225-5p pode preparar um nicho premetastatic no peritônio para a divulgação e assentamento de células de câncer em metástase e, portanto, pode indicar a predisposição para a recorrência peritoneal após a ressecção curativa GC.

PLF fornece informações sobre o estado do peritoneu, tais como alterações na população de células do sistema imunológico e a secreção de factores de crescimento e citoquinas [32, 33]. ensaios de diagnóstico molecular citologia e baseiam-se na detecção de células cancerígenas, enquanto perfis de miARNs em PLF podem ser utilizados para a predição de um fenótipo premetastatic peritoneal em GC, assegurando medidas preventivas e curativas mais eficazes.