Abstract

Fundo

peças angiogénese patológica um papel essencial na agressividade do tumor e leva a prognóstico desfavorável. O objetivo deste estudo é detectar o papel potencial da proteína de ligação Retinoblastoma 2 (RBP2) na angiogénese tumoral do câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).

Métodos

coloração imuno-histoquímica foi utilizado para detectar a expressão de RBP2, fator-1α indutível por hipoxia (HIF-1α), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e CD34. Dois pares de sequências de siRNA e pcADN3-HA-RBP2 foram usadas para regular negativamente e sobre-regular a expressão RBP2 em H1975 e SK-MES-1 células. Um ensaio de formação de tubo de células endoteliais, o VEGF ensaio imunossorvente ligado a enzima, PCR em tempo real e transferência de Western foram realizados para detectar os potenciais mecanismos mediados por RBP2 na angiogénese tumoral.

Resultados

Da 102 fase I espécimes NSCLC analisados, a expressão da proteína de alta RBP2 está intimamente relacionado com o tamanho do tumor (P = 0,030), de expressão elevada de HIF-1α expressão elevada de VEGF (P = 0,028), (P = 0,048), o aumento da angiogénese do tumor (P = 0,033 ) e mau prognóstico (P = 0,037); MVD elevada foi associada com a expressão elevada de HIF-1α (P = 0,034), de expressão elevada de VEGF (P = 0,001) e mau prognóstico (P = 0,040). A análise multivariada indicou que RBP2 teve uma influência independente sobre a sobrevida dos pacientes com estágio I NSCLC (P = 0,044). Através da modulação da expressão de RBP2, os nossos resultados sugerem que a depleção de proteínas RBP2 diminuiu a formação de tubos HUVEC pelo VEGF-regulação para baixo num meio condicionado. RBP2 estimulou a sobre-regulação de VEGF, que era dependente de HIF-1α, e activado o HIF-1α através de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /via de sinalização de Akt. Além disso, o VEGF aumentou a activação de Akt regulada por RBP2.

Conclusões

A proteína RBP2 podem estimular a expressão de HIF-1α através da activação da via PI3K /Akt via de sinalização sob normoxia e depois estimular VEGF expressão. Estes resultados indicam que RBP2 pode desempenhar um papel crítico na angiogénese tumoral e servir como um alvo terapêutico atraente contra a agressividade do tumor para pacientes com NSCLC em estágio inicial

Citation:. Qi L, Zhu F, Li Sh, Si Lb, Hu Lc, Tian H (2014) Retinoblastoma Binding Protein 2 (RBP2) promove a angiogênese HIF-1α-VEGF-induzida de Non-Small Cell Lung Cancer através da Akt. PLoS ONE 9 (8): e106032. doi: 10.1371 /journal.pone.0106032

editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de abril de 2014; Aceito: 27 de julho de 2014; Publicação: 27 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Qi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. O projecto foi apoiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 30571844), o Desenvolvimento da Ciência e Tecnologia Fundação da província de Shandong (Sem . 2009GG10002007) e da National Science Foundation Natural da província de Shandong (No. ZR2009CM090). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) está entre as neoplasias mais comuns que levam à morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. Apesar das inúmeras melhorias nas técnicas cirúrgicas e quimioradioterapia adjuvante para NSCLC longo das últimas décadas, o prognóstico permanece relativamente pobre [2]. Uma variedade de novos marcadores moleculares e possíveis novos alvos foram encontrados para tratar a doença. No entanto, a progressão do tumor é um processo de passos múltiplos e o mecanismo molecular subjacente a carcinogénese pulmonar é, em grande parte claro.

angiogénese patológica é um acontecimento relativamente precoce na carcinogénese, e aumento da angiogénese tumoral correlaciona-se com o crescimento do tumor invasivo e metástases e pobre prognóstico [3], [4]. Tem sido proposto que o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e factor de 1α indutível por hipoxia (HIF-1α) desempenham papéis críticos na angiogénese tumoral. VEGF, que é o factor angiogénico específico de células endoteliais mais extensivamente caracterizadas, conduz ao aumento da permeabilidade vascular e desempenha um papel importante na angiogénese fisiológica e patológica [5], [6]. evidências acumuladas demonstrou que o HIF-1α, uma proteína heterodimérica compostas de HIF-1α e subunidades de HIF-1β, está associada a vários aspectos de processos celulares e fisiológicas. Sob a normoxia, HIF-prolil-1α é hidroxilado, ubiquitylated e degradada em proteossomas por se ligar ao complexo de von Hippel Lindau (VHL). Após a estabilização hipoxia, HIF-1α se liga a HIF-1β no núcleo e iniciam a transcrição de genes alvo através do elemento responsivo a hipóxia-[7], [8], [9]. Nos últimos anos, diversos estudos sugerem que o HIF-1α poderia também conduzir à expressão elevada de diferentes genes envolvidos em diversas funções biológicas sob normoxia, incluindo a proliferação celular, a apoptose, a migração, a invasão e a angiogénese [10], [11].

Retinoblastoma proteína de ligação 2 (RBP2), um membro da família Jarid de proteínas, é uma fosfoproteína nuclear com actividade desmetilase de lisina 4 de histona H3 (H3-K4) [12], [13], [14 ]. Verificou-se que RBP2 exerce a sua função, em parte, ao reprimir a transcrição de genes alvo envolvidos na diferenciação e que a ligação à proteína do retinoblastoma (pRb) converte RBP2 de um repressor transcricional para um activador transcricional [15], [16]. Uma pesquisa recente no cancro do pulmão estabeleceu que RBP2 está relacionada à migração do tumor e invasão diretamente ligação a integrina β1 (ITGB1) promotores [17]. Outro estudo demonstrou que RBP2-regula a expressão de N-caderina e caracol através da activação de Akt sinalização [18]. Além disso, a sinalização de Akt ITGB1 e estão significativamente correlacionados com a angiogénese de tumores [19], [20], [21], [22]. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem um papel para RBP2 oncogénica na angiogénese e progressão do tumor.

Neste estudo, a expressão RBP2 foi encontrado para ser aumentada em linhas celulares de NSCLC, bem como nos tecidos de doentes com NSCLC. Para investigar ainda mais os possíveis papéis da RBP2 na angiogénese tumoral, forneceu a evidência que mostra que a expressão elevada RBP2 em linhas celulares de NSCLC promove significativamente a angiogénese de tumores e elucidar o mecanismo envolvido na activação da sinalização de Akt, a indução de acumulação de proteína HIF-1α e expressão de VEGF sob normoxia.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Qilu Hospital de Ética. consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente para publicar os detalhes do caso, e na aquisição de amostras de tecido foi realizada como prescrito pelas diretrizes institucionais.

Os pacientes

Um total de 102 pacientes (71 homens e 31 mulheres, com idade média de 62 ± 3,56 anos), com a fase I NSCLC submetidos à ressecção completa do tumor (lobectomia ou pneumonectomia) com linfonodos regionais nó dissecção entre janeiro de 2006 e dezembro de 2008 no Departamento de Cirurgia Torácica, Qilu Hospital, foram incluídos no o estudo. O exame histológico e grau de diferenciação de células de câncer foram baseados no sistema de classificação da Organização Mundial da Saúde revisto em 2004 eo sistema de estadiamento TNM da UICC de 2009. Além disso, 3 pacientes (2 casos com cancro de células grandes e 1 caso com câncer adeno ) foram submetidos a ressecção completa do tumor durante este período foram excluídos devido ao tamanho muito pequeno da amostra. As características clínicas dos 102 pacientes são apresentados na Tabela 1.

Imunohistoquímica

coloração imuno-histoquímica para RBP2, HIF-1α, VEGF e CD34 foram realizadas utilizando o método de estreptavidina-peroxidase . Resumidamente, secções de 4 um de espessura foram cortadas de blocos embebidos em parafina, e as lâminas foram incubadas com anticorpos primários contra RBP2 (Bethyl, Montgomery, TX, USA, diluição 1:100), HIF-1α (BD Biosciences, Pharmingen , Lexington, MA, EUA, diluição 1:100), VEGF (A-20; Santa Cruz Biotechnologies, CA, EUA, diluição 1:150) e CD34 (SC-19621; Santa Cruz Biotechnologies, CA, EUA, diluição 1: 100) durante a noite a 4 ° C. Posteriormente, anticorpos secundários biotinilados e reagente complexo estreptavidina conjugado com peroxidase foram aplicados, seguido de contracoloração com hematoxilina de Mayer. Os controlos positivos e negativos foram incluídos em cada passo. A expressão da proteína RBP2 foi avaliada pelo cálculo de uma pontuação total de imunocoloração como o produto de ambos o marcador intensidade (0, coloração negativa; 1, coloração fraca; 2, coloração moderada; 3, coloração forte) e pontuação proporção (0, nenhum; 1, 10%; 2, 10-50%; 3, 51-80%; 4, 80%). Assim, a pontuação total variou de 0 a 7. As lâminas imunocoradas foram avaliados por dois investigadores independentes de forma cega e reavaliados por estes investigadores sob um microscópio multihead em casos discordantes para chegar a um consenso. Para a avaliação da coloração positiva de RBP2, pelo menos 3 secções ou áreas de cada amostra foram contadas.

Para a quantificação da angiogénese associada ao tumor, a densidade microvascular (MVD) foi avaliada através da contagem de células endoteliais imunocoradas CD34-positivas. células endoteliais CD34 positivas, bem como grupos de células endoteliais que foram claramente separados microvasos adjacentes foram medidos como microvasos contáveis ​​[23], [24], [25]. Para quantificar o MVD, cinco áreas altamente vasculares foram digitalizados em baixa potência para identificar “pontos quentes” e contou microscopicamente em alta potência (200 × ampliação) Campos. A contagem média de dez campos de visão foi registrado como o MVD final (dois observadores e cinco pontos quentes vasculares cada).

O valor de corte para RBP2 e expressão MVD foi determinado com base em um valor heterogeneidade medida através de um log- análise estatística classificação em relação à sobrevida global [26]. A pontuação coloração final de 4 foi escolhido como ponto de corte para a discriminação entre alta e baixa expressão RBP2. Portanto, os tumores com uma pontuação final de coloração ≥4 foram definidos como superexpressão da proteína RBP2. Tumores com microvasos ≥57 foram classificados como de alto MVD; tumores com microvasos 57 foram classificados como baixo MVD. HIF-1α foi considerado quando superexpresso 1% de núcleos foram positivos como descrito anteriormente [27]. Tumores com uma pontuação final de coloração ≥3 foram definidos como superexpressão da proteína VEGF [28].

linhas celulares, condições de cultura, transfecção e pequeno RNA de interferência Tratamento

O adenocarcinoma do pulmão linhas celulares A549 humana , SPCA-1 e H1975 foram adquiridos a partir do National Cancer Institute (Bethesda, MD, EUA). A linha de células escamosas do pulmão humano SK-MES-1 e a linha celular epitelial bronquial humano BEAS2B foram obtidos a partir de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foram adquiridos da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Os, A549, células SPCA-1 e H1975 BEAS2B foram cultivadas em Park Memorial Institute do Roswell (RPMI) 1640 (Hyclone, Logan, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Gibco, Gaithersburg, EUA). Os SK-MES-1 foram cultivadas em meio MEM (Gibco, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 20% de FBS. As HUVECs foram cultivadas em meio de crescimento de células endoteliais M199 suplementado com FBS a 15%, 1 mg /suplementos de crescimento baixo mL de soro e glutamina 2 mM. Todas as células foram incubadas em 5% de CO

2 a 37 ° C. RBP2 foi overexpressed usando pcDNA3-HA-RBP2, uma oferta generosa de W.G Kaelin [12], e siRNA para RBP2 foi adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). O plasmídeo pcDNA3-HA-HIF-1α foi comprado de Addgene (plasmídeo 18949) [29], e siRNA para HIF-1α (ONTARGET mais piscina SMART, o L-004018) foi adquirida a partir de Dharmacon ARN Technologies (Chicago, IL, EUA) . O plasmídeo pcDNA3 Myr HA Akt1 foi comprado de Addgene (plasmídeo 9008) [30]. Para o tratamento pequeno ARN interferente (siRNA), as células foram incubadas em placas de 6 poços (3,0 x 10

5 /poço) durante a noite e, em seguida, a transfecção foi efectuada utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As seguintes sequências de siRNA foram utilizados neste estudo: RBP2 siRNA1 5′-UUGUGUACUCGUCAAACUCUACUCC-3 ‘; RBP2 siRNA2 5’-UUAACAUGCCGGUUAUCCAGGCUCU-3 ‘; controle de siRNA 5’-UUCUCCGAAGGUGUCACGUTT -3 ‘.

Preparação de Acondicionado

Médio

As células células RBP2-siRNA1 H1975, células e RBP2-siRNA2 H1975 controle siRNA-H1975 foram cultivadas sob soro-livre condições em meio RPMI 1640 durante 24 h, respectivamente. O sobrenadante foi então recolhida, centrifugada, filtrada através de um filtro de 0,22 mm (Millipore, Billerica, EUA) e armazenou-se a -20 ° C até ser utilizada no ensaio de ensaio imunoenzimático (ELISA) ligado a enzima e formação do tubo.

endotelial formação de células tubo de ensaio

O ensaio de formação do tubo foi efectuada como descrito anteriormente [31]. Resumidamente, as células HUVEC (1 × 10

4 /po) foram semeadas em placas de 96 poços revestidas com Matrigel (50 ul) e, em seguida, incubadas a 37 ° C durante 1 h para polimerizar. HUVECs (1 × 10

4 células) foram semeadas em poços com meio condicionado a partir de células diferentes RBP2 siRNA1-H1975, células RBP2-siRNA2 H1975 e as células de controlo siRNA-H1975. Um inibidor de VEGFR (malato de sunitinib, 2,5 mM) [32] foi adicionado ao meio condicionado do controlo células siARN H1975 e recombinante humano VEGF-165 (rhVEGF165, Millipore, Billerica, MA, EUA, 2 ng /ml) foi adicionado a o meio condicionado das células RBP2 siRNA2-H1975. As placas de 96 poços foram incubadas durante 6 h, e a formação do tubo foi então fotografadas sob um microscópio invertido. A capacidade de formação de tubos foi quantificada através da contagem do número total de tubos completos, e a média de três aleatório × 200 campos por poço foi registada como o valor por poço.

VEGF Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

os níveis de VEGF nos diferentes meios condicionados foram determinados utilizando um kit de ELISA (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA) de acordo com as instruções do fabricante e analisadas utilizando um leitor Multiscan Labsystems. A experiência foi repetida duas vezes com as medições em triplicado em cada experiência.

de SDS-PAGE e Western Blotting

As proteínas foram extraídas com tampão de lise RIPA. Quantidades iguais (20 ug) de proteína foram sujeitos a análise de SDS-PAGE, transferidos para membranas de nitrocelulose e sondadas com anticorpos primários contra RBP2 (Cell Technologies sinalização, Danvers, MA, EUA), HIF-1α (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA , EUA), de VEGF (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, EUA), Akt e fosfo-Akt (Ser-473) (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, EUA). LY294002 foi comprado de Beyotime Instituto de Biotecnologia (Haimen, China). As bandas de proteína foram detectadas usando o método de quimioluminescência aumentada (Millipore, Billerica, MA, EUA). A densidade de banda óptica foi quantificada (Imager da Alpha Corporation, San Leandro).

Extração de RNA, transcrição reversa Polymerase Chain Reaction

O ARN celular total nas células de diferentes tratamentos foi extraído utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado por SuperScript III Síntese da primeira cadeia do sistema (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Quantitative PCR em tempo real (qRT-PCR) foi realizada utilizando SYBR Green Supermix (Bio-Rad) para HIF-1α e VEGF de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de HIF-1α e ARN de VEGF mensageiro (mRNA) foram normalizados para o nível de expressão β-actina humana e calculada usando a

2 (- ΔΔCT) método de [33]. Os iniciadores para a HIF-1α foram 5′-TTTTTCAAGCAGTAGGAATTGGA-3 ‘(directo) e 5′-GTGATGTAGTAGCTGCATGATCG-3′ (inverso). Os iniciadores para o VEGF foram 5’-ATCTTCAAGCCATCCTGTGTGC- 3 ‘(directo) e 5′-CAAGGCCCACAGGGATTTTC-3′ (inverso). Os iniciadores para β-actina foram 5’-GCATCCACGAAACTACCT-3 ‘(directo) e 5′-GAAAGGGTGTAACGCAAC-3’ (inverso). As condições dos ciclos foram como se segue: desnaturação inicial a 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 5 s, 60 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 15 s

seguidor. -up

Todos os pacientes que receberam alta do hospital foram acompanhados no ambulatório a cada 3 a 6 meses. A avaliação de seguimento dos pacientes constou de exame físico, exames de sangue, tomografia computadorizada, ultra-sonografia, radiografia de tórax e fibrobroncoscopia, se necessário. Follow-up foi concluída em todos os pacientes até dezembro de 2013, eo período médio de acompanhamento foi de 66 meses (variação: 16~96 meses).

Análises Estatísticas

Todas as análises estatísticas foram examinados usando SPSS 17.0 software estatístico. Os dados quantitativos foram expressos como a média ± DP para cada grupo, e as comparações foram feitas pelo teste t de Student. Qui-quadrado foram realizados para examinar a associação entre RBP2, MVD e vários fatores clínico-patológicas. A correlação entre MVD intratumoral e os níveis de proteína RBP2 foi analisada por um teste não-paramétrico (Mann-Whitney U Test). O tempo de seguimento foi censurado se o paciente foi perdido durante o seguimento. As curvas de sobrevida foram desenhados utilizando o método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank. A análise de regressão multivariada de Cox foi utilizado para identificar fatores prognósticos independentes significativos.

valores

P foram calculados a partir de testes estatísticos bicaudais. A diferença foi considerada estatisticamente significativa quando

P

. 0,05

Resultados

1. Correlação de proteína RBP2 e MVD com factores clinicopatológicas

A imuno-histoquímica com anticorpos RBP2 (Fig. 1A e Fig. 1B) e a HIF-1α (Fig. 1D e a Fig. 1E) mostrou uma reacção positiva no núcleo, e anticorpos de VEGF (Fig. 1F e a Fig. 1G) mostrou uma reacção positiva no citoplasma das células tumorais. RBP2 foi detectado como sendo sobre-expresso em 52 (51%) de 102 amostras de NSCLC de acordo com os critérios acima referidos. As relações entre a expressão da proteína RBP2 e fatores clínico-patológicas foram examinados pelo teste do qui-quadrado e os nossos dados mostraram que RBP2 superexpressão foi associado com o tamanho do tumor (

P

= 0,030), a alta expressão HIF-1α (

P

= 0,028) e de expressão alta VEGF (

P

= 0,048). No entanto, não houve significância estatística na relação entre expressão RBP2 e outras variáveis ​​clínico-patológicas (

P Art 0,05, Tabela 1)

(A) a expressão da proteína alta RBP2 no câncer de células escamosas. ; (B) a expressão da proteína de alta RBP2 no adenocarcinoma; (C) a expressão da proteína RBP2 negativo em NSCLC; (D) a alta expressão de HIF-1α em cancro de células escamosas; (E) alta HIF-1α expressão da proteína no adenocarcinoma; (F) a alta expressão de VEGF no câncer de células escamosas; (L) elevado de VEGF no adenocarcinoma; (H) a alta expressão de CD34 em cancro de células escamosas; (I), a expressão elevada de CD34 no adenocarcinoma.

MVD intratumoral foi quantificada por contagem de células endoteliais CD34-positiva na mesma série de tecidos de cancro de pulmão (Fig. 1 H e A Fig. 1-I), e a média número de microvasos em dez campos foi contada como uma medida de MVD para cada amostra. O número médio de microvasos de MVD em cada amostra de tumor variou em termos gerais, de 6,4 a 102. Como descrito anteriormente, os tumores com microvasos ≥57 foram classificados como de alta MVD e 46 casos (45,1%) mostraram alta MVD. O teste do qui-quadrado mostrou que a alta MVD foi associada com alta expressão de HIF-1α (

P

= 0,034) e de expressão alta VEGF (

P

= 0,001), mas não foram observadas correlações significativas entre MVD e outros fatores clínico-patológicas (

P Art 0,05, Tabela 1).

coloração imuno-histoquímica das secções em série de tecidos de câncer mostraram que o MVD média foi de 59,6 no grupo de alta expressão RBP2 (7,8-102) e 35,4 no grupo de expressão RBP2 baixa (6,4-94). Além disso, nossa análise estatística demonstrou que a alta MVD foi detectada com maior frequência em tumores com superexpressão da proteína RBP2 do que naqueles sem superexpressão (

P

= 0,033, Mann-Whitney U, Fig. 2A). Estes dados sugerem que RBP2 possam promover a angiogénese patológica na progressão NSCLC.

(A) Correlação entre a expressão RBP2 e MVD para a fase I NSCLC. NSCLC com expressão de proteína de alta RBP2 mostrou significativamente maior MVD intratumoral do que com expressão baixa proteína RBP2 (

P

= 0,033, Mann-Whitney U). curvas (B) de Kaplan-Meier da sobrevivência global demonstrou uma fraca taxa de 5 anos de sobrevida global em pacientes com superexpressão da proteína RBP2 (53,8% versus 72,0%,

P

= 0,037). curvas (C) de Kaplan-Meier da sobrevivência global demonstrou uma taxa de sobrevivência pobres de 5 anos global em pacientes com alta MVD (52,2% versus 71,4%,

P

= 0,040).

a análise de Kaplan-Meier de sobrevida global também demonstrou uma taxa de sobrevivência pobres de 5 anos global em pacientes com superexpressão da proteína RBP2 (53,8% versus 72,0%,

P

= 0,037; a Fig. 2B) e alta MVD ( 52,2% versus 71,4%,

P

= 0,040, Fig. 2C). Todas as variáveis ​​estatisticamente significativas avaliadas nas análises univariadas foram incluídas em um modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox. A análise multivariada indicou que apenas RBP2 teve uma influência independente sobre a sobrevida dos pacientes com estágio I NSCLC (

P

= 0,044, Tabela 2).

2. RBP2 é sobre-expresso em linhas celulares de NSCLC humanos

O nível de proteína de RBP2 foi regulado para cima em linhas celulares de cancro de pulmão SK-MES-1, A549, SPCA-1 e H1975 em comparação com a linha celular epitelial bronquial humano BEAS2B (Fig. 3A). O nível de expressão de células H1975 em RBP2 foi maior do que em BEAS2B, SK-MES-1, SPCA-1 e células A549.

(A) RBP2 é sobre-expresso em linhas celulares de NSCLC humanas SK-MES-1 , A549, SPCA-1 e H1975 em comparação com as células brônquicas humanas BEAS2B linha de células epiteliais. (B) Efeitos de RBP2 siRNA1, RBP2 siRNA2 e pcADN3-HA-RBP2 sobre a expressão da proteína RBP2.

Duas partes de siRNAs e pcADN3-HA-RBP2 segmentação RBP2 foram empregados para um funcional análise em células H1975 e SK-MES-1. Como mostrado na Fig. 3B, os resultados demonstraram que RBP2-siRNA1 e RBP2-siRNA2 poderia significativamente regular negativamente a expressão da proteína RBP2 em células H1975. Além disso, os dois siRNAs mostrou quase os mesmos efeitos de RNAi, enquanto que o siARN de controlo negativo não afectou significativamente a expressão de RBP2. Enquanto isso, pcADN3-HA-RBP2 significativamente sobre-regulada a expressão de RBP2 em SK-MES-1 de células, ao passo que pcADN3-HA não afectou significativamente a expressão RBP2. Portanto, RBP2-siRNA1, RBP2-siRNA2 e pcADN3-HA-RBP2 foram seleccionados para um estudo mais aprofundado as funções da proteína RBP2 in vitro.

3. Depleção da proteína RBP2 diminui HUVEC formação do tubo induzida por meio condicionado

Para avaliar o significado funcional de RBP2 na angiogénese tumoral, RBP2 foi derrubado em linhas de células H1975. Os resultados demonstraram que o número de tubos completas induzidas por meio condicionado de células RBP2-siRNA1 H1975 (12,33 + 3,06) e células RBP2-siRNA2 H1975 (9,67 + 1,53) foi significativamente reduzida em comparação com a das células controlo siARN H1975 (38,67 2,52, Fig 4 A-D,

P Art 0,01)

ensaio de formação do tubo:.. (A) células controle siRNA-H1975; (B) As células RBP2 siRNA1-H1975; células (C) RBP2-siRNA2 H1975. (D) A análise quantitativa da formação de tubos por células HUVEC induzida por meio condicionado; (E) A regulação negativa da proteína RBP2 diminuiu os níveis de expressão de VEGF em meios condicionados. (F) A formação de tubos induzida pelo meio condicionado de células de controlo de H1975 siARN foi bloqueado pelo inibidor de VEGFR (sunitinib malato, 2,5 uM). (G) A formação do tubo induzida por redução do meio condicionado de células RBP2-siRNA2 H1975 foi resgatada pela adição de VEGF-165 (2 ng /ml).

4. Down-regulação da proteína RBP2 diminui os níveis de expressão de VEGF em meio condicionado

Dado o fato de que a alta MVD foi associada com a expressão de VEGF alta (teste do qui-quadrado,

P

= 0,001, Tabela 1), o próximo explorou a associação entre níveis RBP2 e proteína VEGF em meios condicionados utilizando um ensaio ELISA. Os resultados demonstraram que os níveis de proteína de VEGF em meios condicionados de RBP2-siRNA1 (0,99 ± 0,11 ng /ml) e RBP2-siRNA2 (0,94 ± 0,14 ng /ml) H1975 células foram significativamente mais baixos do que nas células de controlo siARN H1975 (1,87 ± 0,10 ng /ml), (Figura 4E,

P

. 0,01). Além disso, os nossos resultados sugerem que a formação do tubo induzida por meio condicionado do controlo células H1975 siARN foi bloqueada com a adição de um inibidor de VEGFR (sunitinib malato, 2,5 uM, 10,33 + 2,22,

P

. 0,01, Figura 4F); a formação do tubo induzida por reduziu o meio condicionado de células RBP2-siRNA2 H1975 foi resgatada pela adição de VEGF-165 (2 ng /ml, 41,03 + 3,25,

P

0,01, Figura 4G.).

5. RBP2 estimula HIF-1α e ARNm de VEGF e a expressão da proteína

HIF-1α é um factor de transcrição importante e desempenha um papel crucial na angiogénese tumoral. Além disso, o factor de transcrição HIF-1α regula o nível de vários genes de hipóxia-responsivo expressão, incluindo VEGF [11]. A seguir, investigou se RBP2 poderia afectar a expressão de HIF-1α em células SK-MES-1-expressando RBP2 ectópicas. Como mostrado na Fig. 5A, a expressão forçada de RBP2-regulada a expressão da proteína HIF-1α de uma forma dependente do tempo sob condições de normóxia, e o valor de pico da expressão de HIF-1α apareceu em 36 horas após a transfecção foi realizada. No entanto, o HIF-1α era instável e degradada por proteassomas sob normoxia [9], e os nossos resultados sugerem que a expressão de HIF-1α diminuiu após a transfecção foi realizada 48 horas. Por conseguinte, para investigar o possível regulação da angiogénese tumoral por RBP2, examinámos a expressão de factores de transcrição HIF-1α e VEGF em células que sobre-expressam RBP2 e NSCLC -depleted sob normoxia 36 horas após a transfecção. Como mostrado na Fig. 5B e na Fig. 5C, a sub-regulação de RBP2 em H1975 células levaram à diminuição da expressão de HIF-1α e VEGF, enquanto que a expressão RBP2 ectópica em SK-MES-1 células por pcADN3-HA-RBP2 levaram à sobre-regulação de HIF-1α e VEGF.

(a) RBP2-regulada a proteína HIF-1α de uma forma dependente do tempo sob condições de normóxia. (B) Depleção de RBP2 diminuiu a expressão de HIF-1α e VEGF em células H1975. (C) a regulação positiva de RBP2 aumentou a expressão de HIF-1α e VEGF em SK-MES-1 células. (D) em tempo real de RT-PCR demonstraram que os níveis de HIF-1α e VEGF expressão de ARNm foram significativamente diminuída em células H1975 com depleção de RBP2 em comparação com células de controlo. (E) em tempo real de RT-PCR demonstraram que os níveis de HIF-1α e VEGF expressão de ARNm foram significativamente aumentados em células SK-MES-1-overexpressing RBP2.

Os níveis de expressão de ARNm de HIF -1α (

P

siRNA1 = 0,006,

P

siRNA2 = 0,001) e VEGF (

P

siRNA1 = 0,000,

P

siRNA2 = 0,000) foram significativamente diminuída em células H1975 com depleção de RBP2. Além disso, o HIF-1α (

P

= 0,001) e VEGF (

P

= 0,000) foram aumentadas em que sobre-expressam RBP2 SK-MES-1 em comparação com células de células de controlo (Fig. 5D e a Fig. 5E). Estas descobertas sugerem que RBP2 desempenha um papel importante no processo da angiogénese do tumor através da sobre-regulação de HIF-1α e VEGF.

6. RBP2 indução de VEGF é dependente de HIF-1α

Para confirmar o papel de RBP2 na regulação de HIF-1α em células NSCLC, que modulada a expressão de HIF-1α por transfecção de células com um siRNA específico contra HIF-1α (Si -HIF-1α) e um plasmídeo pcADN3-HA-HIF-1α, e avaliada a expressão de VEGF após 36 horas. Como mostrado na Fig. 6A e a fig. 6B, knockdown de expressão de HIF-1α em células ectópicas-expressando RBP2 SK-MES-1 levaram à infra-regulação de VEGF em comparação com o ARNsi de controlo precipitação não específica; a sobre-regulação da expressão de HIF-1α em células H1975 com depleção de RBP2 levaram à sobre-regulação de VEGF. Estes resultados indicaram que a angiogénese de tumores mediada por células NSCLC de RBP2 parcialmente pode ser regulado através da activação de HIF-1α.

(A) Depleção de HIF-1α com um siRNA específico contra HIF-1α em RBP2- superexpressando SK-MES-1 células levaram à infra-regulação de VEGF em comparação com o controlo de precipitação não específica siARN. (B) Up-regulação da expressão do HIF-1α em células RBP2-siRNA2 H1975 levaram ao aumento da regulação do VEGF.

7. RBP2 ativa HIF-1α via PI3K /Akt via de sinalização

Um estudo recente sugere que RBP2 regula N-caderina e caracol através da activação da Akt sinalização [18]. Além disso, sob condições de normóxia, a expressão ea atividade de HIF-1α e as subsequentes fatores angiogênicos secretados no câncer pode ser anormalmente up-regulada por diferentes vias de sinalização [34], [35], [36] que envolve Akt e seus efetores a jusante [20], [22]. Portanto, a hipótese de que regula RBP2 HIF-1α através da activação de sinalização de Akt, e ainda mais procurado para detectar os mecanismos de sinalização envolvidos em angiogénese tumoral mediada por RBP2. Os nossos resultados mostraram que o silenciamento de expressão RBP2 com qualquer RBP2-siRNA1 ou RBP2-siRNA2 em H1975 células diminuiu significativamente a fosforilação da Akt, ao passo que a expressão forçada de RBP2 com pcDNA3-HA-RBP2 em SK-MES-1 células aumentou a actividade de Akt (Fig. 7A). Além disso, quando uma forma constitutivamente activa de Akt em células RBP2-siRNA2 H1975 foi expressa, a expressão de HIF-1α e VEGF foram aumentadas em comparação com o controlo; a via PI3K /Akt inibidor LY294002 inibiu significativamente a expressão de HIF-1α e VEGF em pcADN3-HA-RBP2 SK-MES-1, células (Fig. 7B). Estes dados sugerem que RBP2 promove a angiogénese do tumor através da activação da via PI3K /Akt via de sinalização em linhas celulares de NSCLC.

(A) Silenciamento RBP2 expressão em células H1975 diminuiu significativamente a fosforilação da Akt, e a expressão forçada de RBP2 em SK-MES-1 células aumentou a actividade de Akt. (B) Quando foi Akt constitutivamente activada na RBP2 siRNA2-H1975, a expressão de HIF-1α e VEGF foram aumentadas em comparação com o controlo. O LY294002 inibidor PI3K /Akt inibiu significativamente a expressão de HIF-1α e VEGF em pcDNA3-ha-RBP2 SK-MES-1 células. (C) Westernblots que mostra a evoluo no tempo da fosforilação de Akt em células RBP2-siRNA2 H1975 devido ao VEGF-165 (25 ng /mL). (D) na presença de estimulação de VEGF-165 humana recombinante, a activação de Akt estava aumentado em células RBP2-siRNA2 e H1975-RBP2 superexpressando SK-MES-1, células (25 ng /ml, 30 minutos).

O VEGF tem sido mostrado para ser um activador potente de Akt, em alguns casos [37]. Nós próxima exploraram se VEGF poderia ativar Akt. Como mostrado na Fig. 7C, o tratamento de células H1975 RBP2-siRNA2 com recombinantes de VEGF-165 humana (25 ng /ml) aumentou a activação de Akt dentro de 15 a 30 minutos. Por conseguinte, para investigar o possível regulação de Akt por VEGF, examinámos a expressão de P-Akt em 30 minutos depois adicionou-se recombinante humano VEGF-165. Como mostrado na Fig. 7D, na presença de estimulação de VEGF-165 humana recombinante, a activação de Akt estava aumentado em células H1975 com depleção de células RBP2 e SK-MES-1-overexpressing RBP2 (25 ng /ml, 30 minutos).