Abstract

A superexpressão do canal de cátions permeável TRPM8 em cancros da próstata pode representar um romance oportunidade para o seu tratamento. Inibidores de TRPM8 reduzir o crescimento de células cancerosas da próstata. Usámos dois bloqueadores recentemente descritos e altamente específicos, AMTB e JNJ41876666, e de ARNi para determinar a relevância da expressão TRPM8 na proliferação de células tumorais e não tumorais. A inibição da expressão ou função do canal reduz a taxa de proliferação e fracção proliferativa em todas as células de tumor testadas, mas não de células da próstata não-tumorais. Observou-se sem aceleração consistente de crescimento após a estimulação do canal com mentol ou icilin, indicando que a expressão basal TRPM8 é suficiente para sustentar o crescimento de células de câncer de próstata

Citation:. Valero ML, Mello de Queiroz F, Stuhmer W , Viana F, Pardo LA (2012) TRPM8 Ion Channels diferencialmente modular a proliferação e distribuição do ciclo celular normal e câncer de próstata células. PLoS ONE 7 (12): e51825. doi: 10.1371 /journal.pone.0051825

editor: Alexander A. Mongin, Albany Medical College, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de julho de 2012; Aceito: 06 de novembro de 2012; Publicação: 14 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Valero et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Financiado pela a Sociedade Max-Planck e concede SAF2010-14990 e PROMETEO2010-046 a FV. MV foi o destinatário de uma bolsa predoctoral do Governo espanhol (F.P.I). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

TRPM8 é, um canal de catião não-selectiva de cálcio-permeável do receptor transiente potencial superfamília [1], necessária para a transdução de baixas temperaturas moderadas [2], [3]. A presença de TRPM8 em neurónios de pequeno diâmetro frios-responsivas em gânglios da raiz dorsal e gânglios do trigémeo e o fenótipo detectados em TRPM8 – /- murganhos nocaute suporta um papel de TRPM8 em thermosensation nocicepção e [4] – [6]. canais TRPM8 foram clonados a partir de espécies em géneros diferentes, de anfíbios para os seres humanos [7]. TRPM8 humana foi inicialmente identificado durante uma tela para genes regulados positivamente em cancro da próstata (e, por conseguinte, designados por TRP-P8 [8], mas mais tarde detectados em outros tipos de tumores [9], [10]. Entre os tecidos normais, a expressão do canal é muito restrita a uma subpopulação dos neurónios sensoriais primários [2], [3], mas também está presente no sistema reprodutor masculino em quantidades significativas, [2], [3], [8], [9], [11], [12]

Activação de endógeno (ou seja, neuronal) ou canais TRPM8 recombinantes dá origem a uma corrente de assinatura caracterizada por rectificação exterior e dependente da tensão extrema gating [13] -.. [15] canais TRPM8 pode ser activada por agonistas específicos e selectivos, quer naturais (tais como eucaliptol e mentol) ou compostos sintéticos como o super icilin agente de arrefecimento, que é até agora o agonista mais potente do TRPM8 [2], [3], [16] – [19] . Outros agonistas (linalol, geraniol, entre outros) foram identificados por pesquisa de derivados de mentol ou compostos odorantes. em particular, o geraniol pode ser um activador fisiológico do TRPM8 porque é um intermediário durante a síntese do colesterol e que induz a proliferação em epitélio da próstata. Todos os agonistas conhecidos TRPM8 induzir um efeito de arrefecimento, o que reforça o conceito de um papel de TRPM8 na percepção frio [20].

TRPM8 ARNm foi detectada em células malignas, e esta tem sido extensivamente estudado no cancro da próstata. TRPM8 ARNm foi altamente sobre-expressa em tumores da próstata precoce bem diferenciadas. Num modelo típico para o cancro da próstata dependentes de androgénio (células LNCaP, as células apicais do epitélio com um fenótipo secretor) a expressão é detectada, tanto a membrana plasmática e o retículo endoplasmático, onde ele poderia actuar como um Ca

2+ canal de lançamento [ ,,,0],18], [19], [21] – [23]. TRPM8 membrana plasmática pode exercer um efeito protector, uma vez que a activação de TRPM8 por PSA (antigénio específico da próstata) reduziu a motilidade celular em células PC3 [24].

TRPM8 pode ser um marcador útil para o resultado do cancro da próstata, uma vez que a perda de TRPM8 expressão parece estar associada a transição para a independência de androgénios e prognóstico pobre [19], [21], [25]. Isso pode refletir o efeito dos andrógenos sobre a expressão TRPM8, uma vez que o gene exibe dez putativos elementos que respondem a androgénios [18]. Os níveis anormais de ARNm TRPM8 também podem ser indicativos de doença metastática [26].

função de canal Canónica TRPM8 pode ser bloqueado por compostos de ureia (veja abaixo), que também são conhecidos por inibir a TRPV1 [17], [25 ], [27]. Isto limita a utilização de tais bloqueadores no estudo do papel do TRPM8 no cancro da próstata, porque as células expressam TRPV1 também [28]. No presente, o único meio viável para dissecar especificamente o papel do canal no cancro da próstata é o uso de siRNA. interferência de RNA pode produzir uma batida específica e eficaz para baixo de um gene particular

in vivo

e

in vitro

[29], [30].

Neste estudo foram examinadas os efeitos que TRPM8 silenciamento tem na sobrevivência e proliferação celular de células de três linhas de células da próstata humano, LNCaP, PC3 e DU145. LNCaP está fortemente dependente de androgénios-[19] enquanto DU145 é independente de androgénios [31] e PC3 representaria um estado intermédio [32]. Estudámos também o comportamento, neste contexto, uma linha de células de próstata não tumoral (SV40 imortalizada), PNT1A [33]. A inibição da expressão ou função das taxas de proliferação de canais reduzida e fração proliferativa em todas as células tumorais testadas, mas não das células da próstata não-tumorais.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

linhas de células derivadas da próstata PNT1A (ECACC 95012614), LNCaP (DSMZ ACC 256), PC3 (DSMZ ACC 465) e DU145 (DSMZ ACC 261) foram obtidos a partir de DSMZ (Braunschweig, Alemanha) ou ECACC (Salisbury, UK) . Cada linha foi propagada e mantida de acordo com as instruções do fornecedor correspondente. Identidade de linhas de células de tumor foi confirmada através da expressão de marcadores específicos (PC3 AR, ERa +, RpE +, PSA, DD3-; DU145 AR, ERα-, RpE +, PSA, DD3-; LNCaP AR +, ERα- , ERP +, PSA +, DD3 +;. Paul Thelen, Departamento de Urologia do Hospital Universitário Göttingen)

siRNA transfec�es

a transfecção com siRNAs (25 nm) foi realizada usando Lipofectamine 2000 ou Lipofectamine RNAiMAX reagentes em meio OptiMEM (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemanha), 24 horas após o plaqueamento. Quatro siRNAs diferentes foram desenhados para alvejar o canal hTRPM8 usando HiPerformance siRNA design Algoritmo (Qiagen). Foram utilizados os seguintes sequências (NM_024080) hTRPM8: TRPM8.1, tcgaatgttctcacctattaa; TRPM8.2, aaggttagattccaataaata; TRPM8.3, cagaatgttatcatactacat e TRPM8.4, ccgggacgagatggacataga.

Todos os siRNAs foram sintetizados pela Qiagen (Hilden, Alemanha), exceto o comercial negativa Controle # 1 e a GAPDH humana siRNA (Ambion, Darmstadt, Alemanha), que foi usado como controlos negativos e positivos, respectivamente. As células foram incubadas com o siRNA e o reagente de transfecção durante 6 h e colhidas para as experiências logo após o fim da transfecção. Além disso, as células tratadas apenas com OptiMEM e o correspondente reagente de transfecção foram incluídos como controlos.

qPCR

O ARN total obtido a partir de culturas utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) foi transcrito de forma inversa ( sobrescritos, Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) com oligo-dT e genes primers específicos para hTRPM8 (5′-cttgggcaaaacacacaatg-3 ‘). PCR em tempo real foi realizada no modelo usando o sistema de TaqMan num modelo ABIPRISM 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA) ou uma LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Alemanha). Os seguintes fragmentos foram amplificados: nt 2910-3058 da sequência NM_024080.4 foi detectada com a sonda hTRPM8 (5’-FAM-tcgccatgtttggctacacggtgggcacc-TAMRA-3 ‘) e NT 1.632-1.732 a partir da sequência NM_003234 foi detectada com a sonda HTFR (5 ‘-Joe-tgaatggctagagggatacctttcgtccc- (6-TAMRA) -3’). O receptor de transferrina humana foi utilizado como um modelo de controlo para a integridade de ARN e o desempenho de PCR. A quantificação relativa foi realizada utilizando o software de lazer (Relativa ferramenta Expression Software; [34], [35])

Citometria de Fluxo

siRNA: Após o tratamento com siRNA, as células foram semeadas em 6-. placas de poços e foram incubadas durante 24-120 horas antes das medições. As células foram tratadas com tripsina, lavadas duas vezes com PBS e subsequentemente mantida em gelo. Para medições do ciclo celular, as células foram incubadas com 50 ug /mL de iodeto de propídio (PI), 0,3% de saponina e 100 U /ml de RNase. Para medições de viabilidade, as células não viáveis ​​foram detectadas por coloração com 10 ug /ml em PBS PI. As amostras foram analisadas num citómetro de fluxo BD FACSAria (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha). iodeto de propídio foi excitado a 488 nm, e fluorescência foram obtidos utilizando um espelho dicróico 595 nm e 610/20 nm filtro passa-banda (por ciclo celular) ou 655 nm espelho dicróico e 695/40 nm filtro passa-banda (para a viabilidade) . Os portões de células viáveis ​​foram estabelecidos por fases de dispersão e do ciclo celular prospectivas e laterais foram determinadas usando o software FlowJo (Árvore Star Inc., Ashland, EUA). Alternativamente, a percentagem de células viáveis ​​foi directamente determinada por exclusão de PI.

Para as experiências na presença de mentol e icilin, as células foram plaqueadas em placas de 6 poços e incubadas durante 24-168 horas com 125-300 ^ M mentol ou 10 uM icilin antes das medições. As células foram tripsinizadas, e lavou-se duas vezes com PBS. As amostras foram tratadas e analisadas para as medições do ciclo celular e viabilidade tal como descrito antes.

Imagem de cálcio

O cálcio experiências de imagiologia foram conduzidas com o indicador fluorescente Fura-2. Antes de cada experiência, as células foram incubadas com 5 ^ M acetoxymethylester forma de Fura-2 (Fura-02:00; Invitrogen) durante 45 min a 37 ° C. Depois disto, foi adicionado 250 pM de sulfinpirazona durante mais 20 minutos, a fim de bloquear o transportador de aniões que prejudica o carregamento com Fura-02:00 nas linhas de células cancerosas. As medições de fluorescência foram efectuadas num microscópio invertido Leica (Nussloch, Alemanha) DM IRE2 equipado com um 12 bits arrefecida câmara CCD (imago QE Sensicam; ATÉ Photonics, gräfelfing Alemanha). Fura2 foi excitada a 340 e 380 nm com um monocromador policromo IV (ATÉ Photonics) e a fluorescência emitida foi filtrada através de um filtro passa-nm de comprimento 510. rácios calibrados foram exibidos na linha em 0,5 Hz usando TILL software Visão versão 4.01 (ATÉ Photonics). As experiências de imagiologia de cálcio foram realizadas em simultâneo com gravações de temperatura. A solução do banho, referido como “solução de controlo”, continha (mM): NaCl 140, KCl 3, CaCl

2 2,4, MgCl

2 1,3, Hepes 10 e glucose 10, e foi ajustado para pH 7,4 com NaOH.

Ensaios de Proliferação

a proliferação foi estimada com base na capacidade das células metabolicamente activas de reduzir sais de tetrazólio a formazano colorido (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2 , 5-difeniltetrazólio, MTT, Sigma-Aldrich). As células foram tripsinizadas e plaqueadas em placas de 96 poços de fundo plano com densidades que variam de 2000 a 5000 células /poço dependendo da linha de células examinadas. Para determinar a actividade metabólica, 10 ul de MTT foram adicionados a cada poço e incubou-se durante 4 h. A absorvência do formazano produzido foi determinada num leitor de placas Victor2 (Wallac) utilizando 570 nm e 630 nm filtros de excitação. Para experiências com mentol, o meio foi renovada a cada 48 h, tanto nos poços de teste e controle

cicatrização de feridas Ensaio

As células foram primeiro cultivadas para confluência ( 90%). Em 6- pratos bem. Uma pequena área foi então interrompido por arranhar a monocamada com um 1000 ul ponta da pipeta de plástico. Em seguida, as células foram cultivadas durante 12, 24 ou 48 h, sob diferentes condições experimentais: baixo teor de soro ou de qualquer veículo ou meio contendo droga. As células foram inspeccionadas microscopicamente ao longo do tempo. A área da ferida remanescente foi calculado utilizando o software CorelDraw e a distância de migração das células foi estimado com base no cálculo de que

Drogas

4- (3-Cloro-piridin-2-il). – ácido (4-terc-butil-fenil) -amida do ácido piperazina-1-carboxílico (BCTC) foi uma oferta generosa da Grünenthal AG (Aachen, Alemanha). [L-arginilo] – [N- [2,4-diclorofenetilo] glicil] -N- (2,4-diclorofenetilo) glicinamida (DD01050; (H-Arg-C em 15-15 [36]), foi um presente do Dr. A. Ferrer-Montiel (Universidad Miguel Hernández, Espanha) AMTB (N- (3-aminopropil) -2 -. [(3-metilfenil) metoxi] -N- (2-tienil-metil) -benzamida (1: 1) hiclato) um romance, altamente antagonista TRPM8 seletiva foi uma oferta generosa do Dr. Stuart Bevan (faculdade do rei, Londres) JNJ41876666 (composto 5 em referência [37].; 3-[7-Trifluoromethyl-5-(2-trifluoromethyl-phenyl)-1

H-

benzimidazol-2-yl]-1-oxa-2-aza-spiro[4.5]dec-2-ene Cloridrato,), um antagonista TRPM8 potente, era um dom generoso de Janssen Research .. Development, LLC (Spring House, PA) figura 1 mostra as estruturas químicas das drogas utilizadas

Estatística. análise

os dados são apresentados como média ± SEM obtido a partir de pelo menos três experiências independentes a significância estatística foi avaliada pelo teste t de Student os valores de P são indicadas nas figuras por asteriscos perto da coluna ou o símbolo correspondente * p 0,05; ** p 0,01; *** p . 0.005

Resultados

Detecção de expressão TRPM8 nas linhas de células de próstata e prostáticas

expressão TRPM8 é mais abundante no tecido do sistema nervoso e do sistema reprodutor masculino. estudos anteriores descreveram a sobre-expressão de TRPM8 em tumores da próstata e linhas celulares derivadas de cancro da próstata, especificamente LNCaP [8]. Outras linhas de células foram encontrados negativos nestes relatórios. Mais recentemente, foram reportados células PC3 fracamente positivas por western blot [21]. Partimos para determinar os níveis de TRPM8 expressão nas células de cancro de próstata LNCaP, PC3 e DU145 e a linha celular PNT1A não tumoral por diferentes abordagens para expandir e complementar os resultados relatados antes [38].

em primeiro lugar, o conteúdo de ARNm TRPM8 foi determinada por transcrição reversa-PCR em tempo real (qRT-PCR) utilizando sondas TaqMan no cérebro humano normal, próstata, e linhas de células LNCaP, PC3, DU145 (derivado de tumores) e PNT1A (imortalizadas não transformada linha de células da próstata). a integridade de ARN e a transcrição reversa foram controlados utilizando o receptor de transferrina humana como referência para a normalização. ARNm para TRPM8 foi detectada no cérebro e da próstata, com níveis máximos na próstata saudável (não mostrado). A mensagem foi também detectado em todas as linhas de células humanas testadas, LNCaP, PC3, DU145 e PNT1A. Como relatado anteriormente, os níveis da linha PNTA1 não-tumoral foi significativamente menor do que nas linhas celulares de cancro. A quantidade relativa de mensagem TRPM8 era DU145≈LNCaP PC3 PNT1A

A (Fig 2A.).. abundância de ARNm foi determinada por PCR em tempo real em ARN a partir de ADNc derivado a partir da fonte indicada. O receptor de transferrina humana foi utilizado como gene constitutivo de referência. abundância de ARN é expressa como valores normalizados mais PNT1A. Os asteriscos indicam significância estatística em relação ao PNT1A. B-C. células DU145 responder ao frio e mentol. B. Transmissíveis (esquerda) e pseudo ratiometric [Ca

2 +]

i imagens que mostram um exemplo da resposta das células DU145 ao frio (18 ° C) e mentol 500? M. C. [Ca

2 +]

i respostas de um a frio e celular sensível ao mentol (C1) em comparação com uma célula DU145 frio insensível mentol-insensitive (C2). D-F. Resposta ao frio é diminuído pela TRPM8 knockdown em células DU145. PseudoColor raciométrica [Ca

2 +]

i imagens em células transfectadas com ARNsi de controlo (D) ou com ARNsi TRPM8.4 (E) a 37 ° C (painéis superiores) ou 18 ° C (painéis inferiores). Individual [Ca

2 +]

i respostas são representados à direita das imagens correspondentes. A amplitude e a fracção de células que respondem a estímulos frios é claramente diminuída em culturas tratadas com siRNA TRPM8. Este efeito é quantitativamente descrito em F.

A partir destes resultados, conclui-se que o TRPM8 é expressa em todas as linhas celulares prostáticas testados. Além disso, a proteína aparece para formar canais funcionais. Nas nossas mãos, DU145 (Fig. 2B, C), as células LNCaP e PC3 (dados não apresentados) mostraram um aumento de Ca intracelular

2+ níveis após estimulação por mentol (500 uM) e moderada frio (diminuição da temperatura de 36 ° C a 18 ° C), compatível com a expressão funcional de TRPM8. respostas a frio evocado em células DU145 foram fortemente reduzidos por siRNA dirigido contra TRPM8 (Fig. 2D-F).

Efeito do TRPM8 Blockers sobre a proliferação de linhas celulares de cancro da próstata

As experiências descritas medida suportam a noção de que a expressão TRPM8 ocorre tanto em células da próstata normais e tumorais. A questão permanece, no entanto, se a inibição de TRPM8 tem efeitos semelhantes em todos os tipos de células. Nosso principal objetivo foi testar se a atividade TRPM8 é um requisito geral para a proliferação de diferentes linhas celulares de cancro da próstata. . Para testar isso, usamos bloqueadores farmacológicos TRPM8 [39] e da tecnologia siRNA

bloqueadores utilizados (Fig. 1) foram clotrimazol (CE

50 200 nM) [40]; BCTC, um agente bloqueador de canais TRPV1 [41] e de camundongo, rato e canais TRPM8 humanos (com CE

50 de aproximadamente 0,6-1 M) [13], [17], [27], [42]; tio-BCTC, uma menor actividade (CE

50 3,5 uM) analógico de BCTC; e DD01050, um romance bloqueador dos canais TRPV1, que também bloqueia TRPM8 em neurônios e células HEK293 (CE

50 cerca de 1 mícron) [38]. A proliferação foi determinada utilizando ensaios de MTT (Fig. 3) e o efeito destas drogas e um antagonista TRPM8 mais selectiva (ver infra) sobre a viabilidade celular e a distribuição do ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo (Fig. 4).

o crescimento das linhas celulares indicadas, na presença de inibidores TRPM8. hidrólise de MTT, expresso como vezes de aumento, foram normalizados para níveis no tempo 0. A clotrimazola (quadrados a cheio), BCTC (círculos a cheio), tio-BCTC (quadrados abertos) e DD01050 (triângulos), ao longo de 5 dias de experiência. Os pontos de dados representam média de 4 experiências ± SEM. *:

p Art 0,05; **:

p Art 0,01; ***:

p Art 0,005. Os bloqueadores foram utilizados numa concentração final de 10 uM.

Os histogramas mostram alterações na fracção proliferativa em presença de agentes bloqueadores de canal, tal como determinado por citometria de fluxo de análise do ciclo celular. Todas as drogas foram usadas a uma concentração de 10 uM. A fracção proliferativa sob condições de controlo (células tratadas com veículo) foi considerada como 100% de proliferação.

clotrimazol é um inibidor bem estabelecido de proliferação de células de cancro provavelmente através de múltiplos alvos, incluindo a condutância intermédia activados pelo cálcio K

+ canais [43]. Na concentração utilizada (10 uM), a clotrimazola inibiu a proliferação de todas as linhas de células de tumor de 60 a 80% após cinco dias, mas não afectou o crescimento de células PNT1A (Fig. 3). BCTC em 10 pM mostrou um comportamento semelhante ao clotrimazol, uma vez que reduz fortemente a proliferação de todas as linhas de células (50-70%), mas PNT1A. Os efeitos de BCTC parecem ocorrer, pelo menos em parte (ver abaixo), através da sua acção sobre o TRPM8, desde tio-BCTC foi claramente menos eficaz em todas as linhas testadas. Surpreendentemente, DD01050 (10 uM) induziu uma inibição significativa apenas nas células PC3 para um nível comparável ao de outros inibidores, mas não mostrou qualquer inibição significativa de qualquer outra linha de células (Fig. 3).

A inibição da proliferação bem correlacionada com a fracção proliferativa que foi medida como a percentagem de células em S /G2 /M fases do ciclo celular. Como mostrado na Fig. 4, a potência relativa de cada bloqueador também se reflecte no decréscimo na fracção proliferativa induzida. Nenhum dos fármacos testados mudados a fracção prolif erativa de células PNT1A. Por outro lado, tanto o clotrimazol e BCTC (ambos a 10 uM), diminuiu as células em S /G2 /fases M em todas as linhas de células de tumor, enquanto 10 uM tio-BCTC era menos potente e DD01050 foi mais eficaz em células PC3. Também testamos o efeito da AMTB e JNJ41876666, romance e inibidores TRPM8 altamente específicos [37], [44], em todas as linhas celulares. A 10? M, ambos os fármacos reduziu a fracção prolif erativa de linhas celulares de cancro, deixando as células PNT1A afectada. Não foram observados quaisquer efeitos citotóxicos das drogas nas concentrações utilizadas (não mostrado). Coletivamente, os resultados obtidos com os diferentes bloqueadores são consistentes com a ideia de que a inibição dos resultados TRPM8 em uma proliferação reduzida de células cancerosas da próstata.

Knock Down de TRPM8 Mensagem Reduz o cancro da próstata Proliferação celular

para atingir uma correlação mais directa entre a expressão TRPM8 e proliferação de células tumorais, foi utilizado ARNsi contra TRPM8 e medidos os seus efeitos sobre a proliferação e a distribuição do ciclo celular nas três linhas celulares prostáticas tumorais e a uma não-tumoral. Como um controlo positivo foi utilizada ARNsi dirigido contra hGAPDH. Como GAPDH é uma enzima-chave da glicólise, a redução da proteína é reflectida sobre a actividade metabólica das células transfectadas. Isto foi demonstrado para as quatro linhas celulares por ensaios MTT (não mostrados) e citometria de fluxo (Fig. 5A).

Determinou-se o efeito do knockdown GAPDH na fracção prolif erativa de cada linha de células. Como esperado, GAPDH knockdown inibe a proliferação em todos os tipos de células. Claro B. Tempo de redução TRPM8 RNA conteúdo pelo tratamento TRPM8 siRNA indicado. TRPM8 mensagem foi determinada nos tempos indicados após a transfecção. abundância relativa é referida à quantidade de ARNm no tempo 0, e corrigida para a expressão do receptor da transferrina como controlo. proteína C. TRPM8 knockdown por TRPM8.3 e TRPM8.4 siRNA 48 h após a transfecção. Actina foi utilizado como controlo de carga, e a quantificação densitométrica em relação ao ARNsi de controlo é apresentado no diagrama de barra direita.

O uso de múltiplos siRNAs funcionais é aconselhável para garantir a especificidade dos efeitos observados devido fenotípicas sequências de direccionamento diferentes partes da mensagem deve ter qualitativamente os mesmos efeitos. Quantitativamente, os diferentes ARNsi de segmentação do mesmo gene muitas vezes não são igualmente eficazes devido a propriedades termodinâmicas, estabilidade, e o posicionamento de ambos os siRNAs si ou da região do alvo do gene. Por isso, testou quatro siRNAs diferentes dirigidos contra TRPM8, que foram designados TRPM8.1-4. Estes siARN reconhecem sequências alvo diferentes na TRPM8 e diferem na sua potência silenciamento nas diferentes linhas celulares. Para reduzir a possibilidade de efeitos fora do alvo, utilizou-se uma baixa concentração de ARNsi (25 nM) e o tempo optimizado de transfecção. Para isso, foi incubada com cada tipo de célula equilibrada mistura reagente siRNA-transfecção para 4, 6, 8, 12, e 24 h, monitorada e 24 e 48 horas após a redução relativa na TRPM8 provocada por TRPM8.3 e usando TRPM8.4 PCR em tempo real; TRPM8.3 TRPM8.4 e foram eficazes a nível do RNA em todas as quatro linhas celulares testadas (incluindo PNT1A) após a incubação de 6 horas com siARN. Nós também optimizado do tempo de incubação após a transfecção siRNA seguindo a abundância de ARNm TRPM8 em 12, 24, 72 e 120 horas. Para PNT1A, LNCaP e PC3 a redução máxima da mensagem TRPM8 usando TRPM8.4 siARN foi observada às 72 horas, enquanto DU145 mostrou o efeito máximo já às 48 horas (Fig. 5B). O silenciamento de TRPM8 induziu uma diminuição da proliferação medida por ensaios MTT na linha celular PC3. hidrólise de MTT em PNT1A, DU145 e células LNCaP não foi obviamente afectados pelo siARN (não mostrado). Este é provavelmente um reflexo dos diferentes tempos óptimos para knockdown de ARN, porque é de esperar que uma mudança por várias horas entre a redução na mensagem TRPM8 e os efeitos sobre a proliferação, o que dependerá do tempo de duplicação e o tempo necessário para a proteína knockdown ambos que são diferentes para cada tipo de célula. A redução de ARNm correlacionada com uma clara redução de proteína em cerca de 50% em todas as linhas de células às 48 horas (Figura 5C), mas o knockdown incompleta poderia explicar a ausência de efeito sobre a hidrólise de MTT.

Por esta razão foram realizadas medidas da fração proliferativa, que transformaram mais sensível. Foi detectada uma diminuição na fracção de células em S /G2 /M fases do ciclo celular em todas as linhas de células de tumor, mas observaram nenhum efeito sobre as células tumorais não-PNT1A. Um exemplo de medições da distribuição do ciclo celular em células DU145 é mostrado na Fig. 6A. Uma diminuição em células S e G2 /M é claramente visto após o tratamento de siARN. O resultado das duas siRNAs eficazes era diferente dependendo das linhas de células; PC3 e LNCaP respondeu apenas para uma das duas sequências (TRPM8.4, Fig. 6B), enquanto que para ambas as sequências DU145 foram eficazes.

. Representante histograma do ciclo celular de células DU145 transfectadas com o controlo (em cima) ou hTRPM8 siRNA (parte inferior). A fracção proliferativa (S /G2 /M) é claramente reduzida após TRPM8 knockdown. B. proliferativa fracção (%) de células transfectadas com o controlo ou anti TRPM8 siRNA (sequências 3 e 4). As barras representam média de 3-5 experiências. C. BCTC mantém os seus efeitos inibitórios após o silenciamento de TRPM8. Normalizado crescimento de células DU145, na presença de 10 uM BCTC, após transfecção das células com o controle (coluna branca) ou TRPM8.4 siRNA (coluna preta). O crescimento na ausência de BCTC representa 100%.

Os efeitos observados sob siARN tornou possível testar se a inibição da proliferação induzida por agentes farmacológicos é mediada exclusivamente pelos seus efeitos sobre o TRPM8. Para testar isso, avaliamos se BCTC foi capaz de reduzir o crescimento de células DU145 após o tratamento siRNA. Se todos os efeitos de BCTC eram mediados através TRPM8, o fármaco deve ter menor efeito sobre a proliferação após TRPM8 knockdown por siRNA. No entanto, BCTC (10 uM) inibiu o crescimento desta linha celular a um nível semelhante após TRPM8 knockdown, indicando que o efeito de BCTC sobre a proliferação celular do cancro da próstata não é inteiramente devida à inibição TRPM8 (Fig. 6C).

relatórios anteriores demonstraram que a viabilidade de células LNCaP é reduzida pela inibição de TRPM8 [19]. Pudemos confirmar esta observação, mas LNCaP foi a única linha de células que mostraram este comportamento. A viabilidade para PNT1A1 também foi diminuída após transfecção siRNA, mas este efeito não dependem TRPM8, pois ocorreu nesta linha de células também para ARNsi de controlo (dados não apresentados).

mentol e Icilin Efeitos na proliferação e viabilidade das células da próstata

Nossos resultados confirmam a noção de que a inibição TRPM8 reduz a proliferação celular das células cancerosas da próstata. Assim, decidimos testar se a activação de TRPM8 com mentol produzido um efeito oposto, isto é, um aumento de proliferação. Mentol (120 ou 300