Abstract
Objectivo
O desenvolvimento de resistência ao tratamento e toxicidade adverso associado com agentes quimioterapêuticos clássicos destaca a necessidade de abordagens terapêuticas mais seguras e eficazes. Aqui, nós examinamos a eficácia de um regime de tratamento combinado de 5-fluorouracil (5-FU) e curcumina no câncer colorretal células (CRC).
Métodos
células tipo HCT116 selvagens e HCT116 + células CH3 (complementada com cromossoma 3) foram tratados com curcumina e 5-FU de uma forma tempo e dose-dependente e avaliadas por ensaios de proliferação celular, a coloração DAPI, a microscopia electrónica de transmissão, análise do ciclo celular e imunotransferência para proteínas de sinalização importantes.
resultados
O indivíduo IC
50 de curcumina e 5-FU foram aproximadamente 20 mM e 5 M em células HCT116 e 5? M e 1 M em células HCT116 + ch3, respectivamente (
p 0,05
). Pré-tratamento com curcumina reduziu significativamente a sobrevivência em ambas as células; células HCT116 + ch3 foram consideravelmente mais sensíveis ao tratamento com a curcumina e /ou 5-FU do que as células HCT-116 do tipo selvagem. A IC
50 valores para o tratamento de combinação foi de aproximadamente 5 uM e 1 uM em HCT116 e 5 uM e 0,1 uM em HCT116 + CH3, respectivamente, (
P 0,05
). Curcumina induziu apoptose em ambas as células por indução de degeneração mitocondrial e a libertação de citocromo c. Análise do ciclo celular revelaram que o efeito anti-proliferativo da curcumina e /ou 5-FU foi precedida pela acumulação de células de CRC na fase S do ciclo celular e a indução de apoptose. Curcumina expressão potenciada ou clivagem de proteínas pró-apoptóticas (proteínas caspase-8, -9, -3, PARP e Bax), e regulados negativamente anti-apoptótica (Bcl-xL) e proliferativa (ciclina D1) 5-FU induziu . Embora 5-FU activado NF-kB /PI-3K /Src via em células CRC, este foi regulada pelo tratamento curcumina através da inibição da ativação da quinase IκBα e fosforilação IκBα.
Conclusões
combinando curcumina com agentes quimioterapêuticos convencionais, tais como 5-FU pode proporcionar estratégias de tratamento mais eficazes contra as células cancerosas do cólon quimiorresistentes. Os mecanismos envolvidos podem ser mediados por vias PI-3K /Src NF-kB /e produtos de genes regulados NF-kB
Citation:. Shakibaei M, Mobasheri A, Lueders C, Busch F, Shayan P, Goel A (2013) curcumina aumenta o efeito da quimioterapia contra células de câncer colorretal pela inibição de NF-kB e Src proteína quinase vias de sinalização. PLoS ONE 8 (2): e57218. doi: 10.1371 /journal.pone.0057218
editor: Bharat B. Aggarwal, da Universidade do Texas M. D. Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América
Recebido: 09 de julho de 2012; Aceito: 22 de janeiro de 2013; Publicação: 22 de fevereiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Shakibaei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal (CRC) é um dos principais. causas de morte em homens e mulheres, e está entre os terceiros cânceres mais comuns em todo o mundo [1]. A prevalência de CRC continua a aumentar apesar da nossa melhor compreensão da patogênese da doença, bem como o estabelecimento de melhores estratégias de triagem para esta malignidade. Tem sido relatado que quase 50% dos pacientes com CCR, irá desenvolver a doença recorrente, indicando que os regimes de tratamento atualmente disponíveis não são capazes de controlar esta doença mortal e há uma necessidade imperiosa para terapias melhoradas [2]. 5-fluorouracilo (5-FU) é uma das drogas clássicos utilizados como agente quimioterapêutico contra o CRC. o tratamento com 5-FU suprime o crescimento de células tumorais e induz a apoptose através da incorporação dos seus metabolitos no DNA e RNA através de timidilato-sintase. No entanto, os ganhos obtidos pela eficácia quimioterápico de 5-FU são um pouco limitadas em pacientes com câncer colorretal, principalmente devido à resistência adquirida progressiva de células CRC a 5-FU e toxicidade para células vizinhas saudáveis [3], [4].
a maioria dos tumores ativar o fator de transcrição fator-kB nuclear (NF-kB), enquanto agentes quimiopreventivos naturais suprimi-la, indicando uma forte ligação entre a biologia do tumor e os efeitos anti-câncer de vários compostos naturais [5]. Em contraste com as células saudáveis, na maioria das linhas celulares de tumores sólidos e hematopoiéticas NF-kB é constitutivamente activa [6]. Além disso, as citocinas pro-inflamatórias, os agentes quimioterapêuticos e a terapia de radiação, que induzem a apoptose também activar o NF-kB [7] e, assim, pode mediar quimiorresistência e radiorresistência de células tumorais [8]. Curiosamente, a inibição do NF-kB em células de tumor a proliferação blocos, faz com que a paragem do ciclo celular, e leva a apoptose, o que sugere um papel central para este factor de transcrição na proliferação celular e sobrevivência [9]. NF-kB desempenha um papel importante na proliferação celular e a transformação maligna em diferentes células, a ligação aos locais alvo de ADN como homo- ou heterodero de influenciar a expressão de genes a jusante [10], [11].
CRC se acredita ocorre como uma consequência da acumulação progressiva de alterações genéticas em diversos genes que conduzem a instabilidade genómica melhorada. Tais alterações têm influência direta sobre genes associados à metástase, oncogenes e genes supressores de tumor [12], [13]. Além disso, há um aumento do reconhecimento que, além de eventos genéticos em CRC, alterações na expressão do gene pode ser mediada por alterações epigenética incluindo metilação aberrante de DNA, histonas e modificações da cromatina remodelação [14], [15]. Além disso, a reparação incompatibilidade do sistema (MMR) desempenha um papel essencial na revisão de erros de síntese de DNA durante a replicação celular. Danos no sistema de MMR causa instabilidade genética, conduzindo a alterações no fenótipo da célula, tornando a célula mais susceptíveis à transformação neoplásica e facilitar o desenvolvimento de resistência quimioterapêutica. proteínas DNA MMR, como hMSH2, hMSH3, hMSH6, hMLH1, hPMS2 e hMLH3 desempenhar um papel importante em ambas as variedades esporádica e familiar de CRC humana [16], [17], [18], [19]. Na verdade, a restauração do defeito MMR por re-expressão de hMLH1or hMSH2 por transferência cromossomo confere maior sensibilidade aos agentes [20], [21].
CRC é uma doença evitável, e é fortemente influenciado pelo ambiente , estilo de vida e fatores dietéticos. Neste contexto, existe um crescente corpo de literatura que sugere que diversas substâncias que ocorrem naturalmente como suplementos dietéticos podem reduzir o risco de cancro e têm sido relatados para segurar um papel central no desenvolvimento de drogas anti-tumorais [22], [23]. Produtos naturais com a capacidade para inibir a activação do factor de transcrição nuclear de NF-kB podia ter um potencial terapêutico contra o desenvolvimento do tumor como a CRC. A curcumina (diferuloylmethane) é o componente fitoquímicos biologicamente activo presente na cúrcuma especiarias (
Curcuma longa), e foi demonstrado ser um potente inibidor da activação de NF-kB em vários tipos de células em concentrações não tóxicas em humanos [ ,,,0],24]. A propriedade anti-tumoral de curcumina, é em parte devido à prisão de células cancerosas em S, fase G2 /M do ciclo celular e a indução de apoptose. Além disso, a curcumina inibe o crescimento de células cancerígenas do cólon ADN MMR deficientes em [25], [26]. Também tem sido relatado que a curcumina quinase sub-regula constitutivamente activada PI-3K vias /AKT em células de leucemia de células T, que suprime a proliferação e induz a apoptose dependente da caspase [27].
Dado que os pacientes com cancro colo-rectal a deficiência de reparo incompatível DNA não beneficiam de 5-FU quimioterapia à base, foi utilizado um par de linhas celulares isogênicos, HCT116 (MMR deficiente, devido à hipermetilação do gene MLH1) e HCT116 + ch3 (MMR-proficientes, devido à transferência estável de cromossomo 3 rolamento tipo de cópia selvagem do gene MLH1). O objetivo deste estudo foi examinar o potencial quimiossensibilização da curcumina na quimioterapia baseada em 5-FU em células CRC MMR-deficientes e -proficient.
Materiais e Métodos
Os anticorpos
Anticorpos contra a MMP-9 (MAB 911) e caspase-3 activa (AF835) foram obtidos a partir de R D Systems, Inc., (Heidelberg, Alemanha). anti-PARP [poli (ADP-ribose) polimerase] monoclonal anticorpos (7D3-6) foram adquiridos a Becton Dickinson (Heidelberg, Alemanha). A ciclo-oxigenase-2 (160-112) de anticorpos foi obtido a partir de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, EUA). Os anticorpos para a p-actina (A5316) foram de Sigma (Munique, Alemanha). Os anticorpos para Bax foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Os anticorpos contra fosfo-IκBα específica (Ser-32/36), p65 e p65 específico-fosfo (Ser536) foram obtidos a partir de Cell Technology (Beverly, MA). Anti-cinase IkB (IKK-anti) e anticorpos -a -p (anti-IKK) foram obtidos a partir de Imgenex (Hamburgo, Alemanha). fosfatase alcalina ligada ovelhas anti-ratinho e de coelho de ovelha anti-anticorpos secundários para imunotransferência foram adquiridos a Millipore (Schwalbach, Alemanha). Todos os anticorpos foram utilizados a concentrações e diluições recomendadas pelo fabricante (diluições variando de 1: 100 para experiências immunomorphological a 1: 10.000 para análise por Western blot).
meios de cultura, produtos químicos, e citocinas
o meio de crescimento (Ham F-12 /meio de Eagle modificado de Dulbecco (50:50) contendo 10% de soro fetal de vitelo (FCS), ácido ascórbico /ml 25? g, 50 UI /ml de estreptomicina, 50 IU /ml de penicilina, 2,5 ug /mL de anfotericina B, aminoácidos essenciais e L-glutamina) foi obtido da Seromed (Munique, Alemanha). Tripsina /EDTA (CE 3.4.21.4) foi adquirido a partir de Sigma. Epon foi obtido a partir de Plano (Marburg, Alemanha). 5-FU foi adquirido a partir de Sigma (Munique, Alemanha). A curcumina com uma pureza superior a 95% foi adquirido a Indsaff (Punjab, India). Esta fonte comercial de curcumina contém três componentes principais: diferuloylmethane (o componente mais abundante e ativo da cúrcuma) (82%) e seus derivados demethoxycurcumin (15%) e bisdemetoxicurcumina (3%), em conjunto referidas como curcuminoids [24], [ ,,,0],28]. A curcumina foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) na forma de uma concentração de caldo de 5,000 uM e armazenadas a -80 ° C. As diluições em série foram preparadas em meio de cultura. Um estoque de 100 mM de 5-FU foi preparada em DMSO absoluto e armazenados a -20 ° C. Para o tratamento, a solução de reserva de 5-FU foi diluído em DMEM /F12 e adicionado às culturas para se atingir a concentração desejada. A concentração final de DMSO era inferior a 1% do tratamento medicamentoso. Após cultura das células até 70-80% de confluência, elas foram tratadas com 5-FU, a curcumina ou a sua combinação (em cada caso do tratamento de combinação, as células foram primeiro pré-tratadas com a curcumina durante 12 h ou os tempos indicados e, em seguida, expostos a 5-FU durante 24 h ou os tempos indicados).
linhas de células e cultura de células
células de cancro do cólon humano HCT116 (tipo selvagem) foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (Munique, Alemanha). HCT116 + CH3, o qual foi feito MLH1-proficiente pela transfecção estável de cromossoma 3 tendo uma cópia de tipo selvagem do gene da
hMLH1
foram preparadas tal como originalmente descrito [21]. As células HCT-116 e HCT-116 + ch3 foram utilizados para investigar a eficácia da terapia combinada de 5-FU e curcumina. As células foram mantidas em frascos de cultura de tecido em DMEM /F12 (4,5 g /L de D-glucose) suplementado com 10% FBS e 1% de antibiótico /antimicótico numa incubadora humidificada a 37 ° C numa atmosfera de 95% de ar e 5% CO2. O meio foi mudado de três em três dias, e as células foram passadas utilizando tripsina /EDTA.
proliferação celular ensaio
O efeito do 5-FU, a curcumina e sua combinação sobre a proliferação e viabilidade de HCT116 e células HCT116 + ch3 foi determinada pela 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) método de absorção como descrito anteriormente [29]. Resumidamente, as células (2500 por poço) foram expostas a diferentes concentrações de 5-FU ou a curcumina, cada uma em triplicado, numa placa de 96 poços durante os períodos de tempo indicados a 37 ° C, para determinar os individuais
50 valores IC (50% de crescimento de células concentrações inibitórias). Além disso, num outro conjunto de experiências, as células foram pré-tratadas com a curcumina 5 | iM, durante 4 h e, em seguida, co-tratados com diferentes concentrações de 5-FU (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 e 5 uM) durante 24 h para determinar a dose óptima para o tratamento de combinação. solução de MTT (5 mg /ml) foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada durante 2 h a 37 ° C. O tampão de lise (20% SDS e 50% de formamida de dimetilo) foi adicionado, e as células foram adicionalmente incubadas durante a noite a 37 ° C. A absorvância da suspensão de células foi medida a 570 nm utilizando um leitor de microplacas de 96 poços Revelação Multiscanner (Dynex Technologies, Chantilly, VA). Os dados obtidos foram calculados e representados como a percentagem de sobrevivência em relação aos controlos não tratados. A IC
50 foi definido como a concentração da droga necessária para inibir a HCT116 ou HCT116 + CH3 em 50% em relação aos controlos. IC
50 foram estimados os valores a partir da curva de resposta à dose. Os dados foram derivados a partir de pelo menos três experiências independentes. Esta experiência foi repetida 3 vezes de forma independente, ea análise estatística foi feito para obter os valores finais.
coloração DAPI de células em apoptose
Para examinar as alterações apoptóticos em HCT116 e células HCT116 + ch3, DAPI (4 ‘, 6’-diamidino-2-fenilindole, a Hoechst 33258) ensaio de coloração nuclear foi realizada. Para culturas em monocamada 1 × 10
6 células /placa foram semeadas em discos de cultura de tecidos de 35 mm. Após 80-90% de confluência, as células foram tratadas com diferentes concentrações de curcumina ou 5-FU (0, 1, 5, 10 e 20 uM) ou uma combinação de curcumina (5 uM) e 5-FU (0,1, 1, 2 e 3 | iM), calculada a partir das sub
50 valores IC, durante 24 h. Após conclusão do tratamento, as células foram fixadas com metanol durante 30 min a 4 ° C no escuro. As células fixadas foram lavadas duas vezes com PBS, e depois solução de DAPI foi espalhada sobre as placas, seguido por incubação durante 1 h a 4 ° C no escuro. As células marcadas foram lavadas várias vezes com PBS para remover o excesso de corante DAPI e avaliados sob microscópio de fluorescência (Leica, Alemanha).
microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
células cancerígenas do cólon HCT116 + ch3
HCT116 e foram tratados com curcumina (20 uM), 5-FU (5 uM) ou uma combinação de ambos (curcumina 5 | iM e 5-FU 1 uM em HCT116, curcumina 5 | iM e 5-FU 0,1 uM em HCT116 + CH3) durante 12 , 24, 36, 48, 60 e 72 h, respectivamente, para determinar o tempo óptimo necessário para a inibição do crescimento celular de 50%. A microscopia electrónica foi realizada como previamente descrito [30]. Resumidamente, as culturas foram fixadas durante 1 h em fixador de Karnovsky seguido de pós-fixação em 1% O
para
4 solução. Depois de desidratação em uma série ascendente de álcool, as culturas foram embebidas em Epon e corte ultrafinos com um Reichert-Jung Ultracut E (Darmstadt, Alemanha). As secções foram contrastadas com uma mistura de citrato de acetato de uranilo /chumbo de 2% e examinadas com um microscópio eletrônico de transmissão (Zeiss, Jena, Alemanha).
quantificação de apoptose morte celular
ultrafinos seções do As amostras foram preparadas e avaliadas com um microscópio de electrão (TEM 10; Zeiss). Para quantificar a avaliação morfológica e para definir o ponto de tempo em que 50% das células mostraram alterações mitocondriais (MC) e /ou foram apoptótico, o número de células com características morfológicas de morte celular por apoptose, incluindo o MC foi determinada marcando 100 células a partir de 20 diferentes campos microscópicos. Análise
ciclo celular por citometria de fluxo
células HCT116 (1 × 10
6) foram plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 60 mm e depois de cerca de 80% eram células confluência tratou-se com 20 curcumina uM, 5 uM de 5-FU, ou a sua combinação (5 uM e 1 uM curcumina 5-FU), durante 12 e 24 h. Numa experiência em separado, as células HCT116 + ch3 foram tratados com curcumina 5 uM, 1 uM de 5-FU, ou a sua combinação (curcumina 5 uM e 0,1 uM 5-FU), durante 12 e 24 h. Após o tratamento, as células foram fixadas com etanol gelado a 70%, lavada 2x com PBS e depois ressuspendidas com iodeto de propídio (10 ug /ml) e ribonuclease A (0,1%) em PBS durante 30 min. As células foram incubadas durante 30 min no escuro à temperatura ambiente. eventos fluorescentes a partir de complexos de ADN iodeto de propidio foram quantificadas após excitação com laser do corante fluorescente por separador de células activado por fluorescência (SCAF) (Becton Dickinson, CA) com uma contagem de células de 10.000 células por amostra. Finalmente, o conteúdo em ADN das células em diferentes fases do ciclo celular foi determinada utilizando celular Quest Software (Becton Dickinson). As experiências e análises foram realizadas em triplicado.
Preparação de extractos nucleares e citoplasmáticos de avaliar a translocação de NF-kB
Os extractos nucleares foram preparados como descrito previamente [31]. Resumidamente, as células foram suspensas em 400 ul de tampão de lise hipotónico contendo inibidores de protease, durante 20 min. As células foram então lisadas com 12,5 ul de 10% de Nonidet P-40. O homogenato foi centrifugado durante 1,5 minutos, e sobrenadante (extractos citoplasmáticos) foi armazenado congelado a -70 ° C. Em seguida, 25 ul de tampão de extracção nuclear gelado foi adicionado às peletes e incubadas durante 30 minutos com agitação intermitente. Os extractos foram centrifugados e o sobrenadante (extractos nucleares) transferida para tubos previamente arrefecidos para armazenamento a -70 ° C.
Isolamento de extractos mitocondriais para a detecção da libertação do citocromo c-
As células foram lavadas em 1 ml de PBS gelado e colocados em tampão de isolamento arrefecido em gelo mitocôndrias (sacarose 0,25 M, EDTA 0,2 mM e Tris-HCl a 10, pH 7,8) durante 30 min, seguido por homogeneização utilizando um homogeneizador de vidro pré-arrefecida. Os lisados celulares foram centrifugados a 1000 g durante 15 min a 4 ° C e o sobrenadante foi centrifugado a 12000 g durante 15 min a 4 ° C. Mitocôndrias isoladas foram ressuspensas em tampão de isolamento mitocôndrias contendo inibidores de protease (5 ug /ml de leupeptina, 5 ug /mL de pepstatina, 10 ug /ml de aprotinina, PMSF 1 mM, DTT 1 mM, 100 ortovanadato de sódio mM, fluoreto de sódio 10 mM, e 10 mM de óxido de phenylarsine).
Western blot análise
Para determinar os efeitos da curcumina, 5-FU ou a curcumina /5-FU sobre a HCT116 e células HCT116 + ch3, lisados de células inteiras, citoplasmática , prepararam-se extractos nucleares e mitocondriais de culturas de monocamada e fraccionados por SDS-PAGE [29], [32]. A concentração total de proteínas dos extractos celulares foi determinada usando o sistema de ensaio bicinconínico ácido (Uptima; Interchim, Montlucon, França) utilizando BSA como um padrão. Quantidades iguais de proteína (500 ng por pista) de proteínas totais foram separadas por SDS-PAGE (5%, 7,5%, 12% de gel) sob condições redutoras.
Imune ensaio de cinase complexa
Imune ensaio de cinase complexa foi realizada como previamente descrito em detalhe [33]. Resumidamente, para testar o efeito da curcumina e inibidor de PI-3K (wortmanina) sobre a activação induzida IKK-5-FU, foram realizados ensaios de cinase complexos imunes. O complexo IKK foi imunoprecipitada a partir de lisados de células totais com anticorpos contra a IKK-α e IKK-β e subsequentemente incubadas com /G-agarose com proteína A (Pierce, Alemanha). Após 2 h de incubação, as esferas foram lavadas com tampão de lise e ressuspenso numa solução de ensaio de cinase contendo 50 mM de HEPES (pH 7,4), MgCl2 20 mM, ditiotreitol 2 mM, 10 uM de ATP não marcado e 2 mg de IKK substrato GST-IκBα ( aminoácidos 1-54) e incubou-se a 30 ° C durante 30 min. Isto foi seguido por fervura em tampão de amostra de SDS-PAGE durante 5 min. As proteínas foram separadas utilizando SDS-PAGE sob condições redutoras tal como descrito acima. A fosforilação de GST-IκBα foi avaliada usando um anticorpo específico contra IκBα específica-fosfo (Ser 32/36). Para demonstrar que as quantidades totais de IKK-α e IKK-β em cada amostra, as proteínas celulares totais foram separadas utilizando SDS-PAGE sob condições redutoras tal como descrito acima. Detecção de IKK-α e IKK-β foi realizada por immunoblotting com anticorpos quer anti-IKK-a ou anti-IKK β.
A análise estatística
Os dados numéricos são expressos como valores médios ( +/- DP) para uma experiência representativa realizada em triplicado. As médias foram comparadas pelo teste t de estudante assumindo variâncias iguais. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativo se o P-valor foi menor que 0,05.
Resultados
Este estudo foi desenhado para investigar como a curcumina inibe a proliferação de células CRC e potencializa os efeitos da agente quimioterapêutico 5-FU em um
in vitro
modelo de células CRC humanos. Além disso, examinou-se o mecanismo (s) pelo qual a curcumina melhora os efeitos anti-proliferativos de 5-FU, especialmente em relação aos efeitos sobre o crescimento celular em células de CRC de NF-kB e activação de Src, produtos do gene de NF-kB-regulados, e. Duas células CRC humanas (HCT116 e HCT116 + ch3) foram utilizados nesta investigação.
A curcumina sensibiliza HCT116 e células cancerígenas do cólon HCT116 + ch3 a 5-FU-tratamento levando à diminuição da viabilidade e proliferação celular
Os efeitos de 5-FU e /ou curcumina sobre a viabilidade das células foram avaliadas pelo ensaio de MTT em HCT116 e HCT-116 + CH3 células (Fig. 1). Na base destas medições, foram determinados os IC
50 valores de crescimento celular (50%) As concentrações inibidoras para o indivíduo e as drogas combinadas em HCT116 e a viabilidade celular do cancro do cólon HCT116 + CH3. As células foram expostas a diferentes concentrações de curcumina ou 5-FU (0, 1, 5, 10, 20, 40 e 80 uM) e a viabilidade celular foi avaliada por ensaio de MTT, tal como descrito em Materiais e Métodos (Figura 1A . 1C ). O IC indivíduo
50 de curcumina e 5-FU foram cerca de 20 uM e 5 uM em células HCT116 e 5 uM e 1 uM em células HCT116 + CH3, respectivamente (
P 0,05
). Estes resultados sugerem que a curcumina e 5-FU tem efeitos anti-proliferativos potentes nas células de CRC e de que estes efeitos são mais pronunciados em HCT116 + CH3 do que em células HCT116
A:. As células HCT116 foram tratadas com diferentes concentrações de curcumina ou 5-FU (0, 1, 5, 10, 20, 40 e 80 uM) durante 24 horas e a viabilidade celular foi medida utilizando o método de MTT. As concentrações de curcumina e 5-FU, resultando em inibição do crescimento de 50% foram indicados como IC indivíduo
50 valores. B: células HCT116 foram pré-tratados com curcumina (5? M durante 4 h), em seguida, expostos a 5-FU em diferentes concentrações (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 e 5 uM) durante 24 h e avaliados por ensaio MTT. IC
50 por 5-FU no tratamento de combinação foi determinada a inibição do crescimento de 50% das células HCT116. As mesmas experiências mostradas em (A) e (B) foram realizadas em células HCT116 + CH3. IC
50 valores para único (C) e tratamento combinado (D) foram calculados com base em medições de MTT. Os resultados são apresentados como valores médios com desvio padrão de pelo menos três experiências independentes. Os valores foram comparados com os valores estatisticamente significativos com P . 0,05
Para examinar o efeito de um tratamento combinado de curcumina e 5-FU, ou HCT116 células HCT116 + ch3 foram pré-tratados com 5 jiM curcumina durante 4 h e, em seguida, co-tratados com diferentes concentrações de 5-FU (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 e 5 uM) durante 24 h (Fig 1B . 1D). ensaio de MTT foi realizado e IC
50 valores foram determinados. Curiosamente, o tratamento prévio com 5 uM curcumina reduzida IC
50 valores para 5-FU a 1 uM em HCT116 e 0,1 uM em HCT116 + CH3 (
P 0,05)
células. Estes resultados indicam que as células pré-tratadas com a curcumina foram mais sensíveis ao 5-FU do que as células tratadas apenas com 5-FU e a introdução do cromossoma 3 em células HCT116 mostrou um aumento da sensibilidade das células para o tratamento com 5-FU e /ou curcumina em comparação com o tipo selvagem HCT116.
o efeito da combinação de curcumina e 5-FU sobre a apoptose em células HCT116 e HCT-116 + CH3
para determinar se o efeito inibidor de curcumina e 5-FU sobre a viabilidade celular e o crescimento celular está relacionada com a indução de apoptose, HCT116 e células HCT116 + ch3 foram corados com Hoechst 33258 (DAPI). Este método de coloração à base de fluorescência revela que contêm corpos apoptóticos e fragmentação nuclear condensação da cromatina em células apoptóticas. As células HCT-116 e HCT-116 + ch3 foram expostas a diferentes concentrações de curcumina ou 5-FU (0, 1, 5, 10 e 20? M) ou a uma combinação de curcumina (5 uM) e 5-FU (0,1, 1, 2 e 3 uM). As concentrações aplicadas foram calculados a partir do IC
50 valores de curcumina e 5-FU determinada por ensaios MTT. Como mostrado na Fig. 2, o número de núcleos apoptóticos foi marcadamente aumentado nas células do grupo de tratamento combinado. Isto confirmou os resultados na Fig. 1B 1D e revelou que a curcumina sensibiliza células cancerosas HCT116 do cólon à apoptose induzida por 5-FU. Além disso, a restauração da actividade hMLH1 nas células HCT116, por introdução do cromossoma 3, foi associada a um aumento da sensibilidade ao 5-FU e a apoptose induzida por 5-FU.
HCT116 e células HCT116 + ch3 foram tratados com diferentes concentrações de curcumina ou 5-FU (0, 1, 5, 10 e 20 uM) ou uma combinação de curcumina (5 uM) e 5-FU (0,1, 1, 2 e 3 uM) durante 24 h. culturas em monocamada foram corados com Hoechst 33258 (DAPI) para revelar mudanças apoptóticos nos núcleos celulares.
A curcumina aumenta alterações mitocondriais induzidas por 5-FU e apoptose em HCT116 e células HCT116 + ch3
Como se mostra na Fig. 3, as células cancerosas HCT116 do cólon foram tratados com curcumina (20 uM), 5-FU (5 uM) ou uma combinação de ambos (curcumina 5 | iM e 5-FU 1 uM) durante 12, 24, 36, 48, 60 e 72 h, respectivamente. A viabilidade e alterações morfológicas das células foram determinados por exame ultra-estrutural com microscopia electrónica de transmissão. HCT116 células cancerígenas do cólon em culturas de controlo exibiu uma morfologia arredondada /esférica com pequenos prolongamentos citoplasmáticos, grandes núcleos (principalmente eucromáticos) com nucléolo distinto e um citoplasma bem organizado durante toda a duração do tratamento (Fig 3, de controle:. A-F). O tratamento de culturas HCT116 com a curcumina ou 5-FU sozinho até 36 horas resultou em alterações degenerativas, tais como o aparecimento de múltiplas vacúolos, inchaço das mitocôndrias e RE rugoso e degeneração de outros organelos celulares (Fig. 3, 5-FU, Cur : A-C). períodos de incubação mais longos com a curcumina ou 5-FU (60 e 72 horas) resultou em mais de degeneração celular. Isto incluiu áreas de heterocromatina condensada nos núcleos celulares e múltiplas, vacúolos citoplasmáticos autofágicos; as células se tornaram apoptóticas (Fig 3, 5-FU:. F, Cur: E-F). O pré-tratamento das culturas com a curcumina HCT116 (5? M) durante 4 h, seguido por co-tratamento com 5-FU (1 uM) durante o mesmo período de tempo revelaram um forte efeito. características morfológicas degenerativas extensas, inchaço mitocondrial e apoptose foram encontrados tão cedo quanto 36 h em células HCT116 e continuou a acumular até 72 h (Fig 3, Cur + 5-FU HCT116:. C). Em comparação com células HCT116, exames também foram realizadas em células HCT116 + ch3 tratados com uma combinação de curcumina 5 uM e 0,1 uM de 5-FU. Aqui, estes efeitos foram ainda mais proeminente e as células apoptóticas foram detectadas já após 12 horas de tratamento (FIG 3, Cur + 5-FU + CH3: HCT116. A). Estes resultados confirmaram que a sensibilidade ao 5-FU foi aumentada por pré-tratamento com a curcumina e os quais este foi agravado em células HCT116 + ch3.
células HCT116 foram tratadas com curcumina (20 uM), 5-FU (5 uM) ou uma combinação de ambos (curcumina 5 uM e 1 uM de 5-FU) para 12, 24, 36, 48, 60 e 72 h. Utilizando uma abordagem de diferentes células HCT116 + ch3 foram tratados com uma combinação de curcumina 5 uM e 0,1 uM de 5-FU por 12, 24, 36, 48, 60 e 72 h. Secções ultrafinas foram preparadas e avaliadas por microscopia eletrônica de transmissão. Micrografias mostrados são representativos de todas as culturas avaliadas. No ponto de tempo mais curto quando a apoptose foi detectada pela primeira vez as imagens são setas destacadas. alterações mitocondriais (pontas de seta) são mostrados. Ampliação: X5000, bar = 1 mm
Quantificação e avaliação estatística dos dados ultra realçou claramente os efeitos dependentes do tempo de curcumina e /ou tratamento de 5-FU sobre alterações mitocondriais (MC) e apoptose. em HCT116 e células HCT116 + CH3. Como mostrado na Fig. 4A B, mais do que 50% das células expostas MC ou características de apoptose em 24 h de tempo de incubação nas experiências de combinação com células HCT-116 e em 12 h para as experiências de combinação com células HCT116 + CH3 (
P
0,05) . Novamente, isto sugere que a curcumina sensibiliza HCT116 e células HCT116 + ch3 a apoptose induzida por 5-FU. Os resultados indicam que uma quantidade muito baixa de 5-FU (0,1 uM) é necessário para suprimir a viabilidade celular, quando combinado com uma dose moderada de curcumina (5 uM). Além disso, estes resultados confirmam que a introdução do cromossoma 3 em células HCT116 aumenta significativamente a sensibilidade das células para o tratamento com 5-FU e /ou curcumina em comparação com as células HCT116.
Para quantificar os resultados ultraestruturais, HCT116 (a) e culturas tratadas tal como descrito na Fig HCT116 + CH3 (B). 3 foram examinados para alterações apoptóticas e mitocondriais (MC) pela contagem de 100 células a partir de 20 campos microscópicos. O exame foi realizado em triplicado e os resultados são apresentados como valores médios com desvio padrão SD (
P
0,05). A partir de três experiências independentes
Efeitos de curcumina e /ou 5-FU sobre o ciclo celular e apoptose em HCT116 e células HCT116 + ch3
Para examinar os mecanismos pelos quais a curcumina e /ou 5-FU inibem a proliferação de células HCT116 e HCT-116 + CH3, examinámos e comparado o seu efeito sobre a taxa de inibição do crescimento e os níveis de apoptose. Portanto, determinou-se o comportamento destas duas células de CRC nas várias fases do ciclo celular por análise por citometria de fluxo (Fig. 5A /B). As células HCT116 foram tratadas com curcumina 20 uM ou 5 uM de 5-FU ou a sua combinação (5 uM e 1 uM curcumina 5-FU), durante 12 e 24 h. Numa experiência independente, as células HCT116 + ch3 foram tratados com curcumina 5 uM ou 1 uM de 5-FU ou a sua combinação (5 uM e 0,1 uM curcumina 5-FU), durante 12 e 24 h. As células tratadas foram colhidos e processados para análise de citometria de fluxo. O efeito mais significativo em ambos tratamento único e combinada foi uma redução de tempo e dependente da concentração de células na fase G1-e acumulação de células na fase S do ciclo celular. Este efeito foi ainda mais pronunciada em células HCT116 + ch3 do que em células HCT116. Depois de 12 h de tratamento, o que foi o mais rapidamente ponto de tempo foram examinados, os efeitos da curcumina e /ou 5-FU sobre o ciclo celular já foram muito distinta. Além das alterações na distribuição e G1-S-fase, o número de células que sofrem apoptose foi marcadamente elevada com o tratamento. Curiosamente, os efeitos do tratamento de combinação era claramente superior às dos tratamentos individuais. Às 24 horas de tratamento, a influência sobre o ciclo celular tornou-se globalmente mais pronunciada em ambas as células de cancro do cólon, mas era ainda mais evidente em células HCT116 + ch3 do que em células HCT116. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig.