Abstract

Fundo

Com menos de um adenocarcinoma do pâncreas 5% taxa de sobrevivência (PDAC) é quase uniformemente letal. A fim de ter um impacto significativo na sobrevida de pacientes com este tumor maligno, é necessário para diagnosticar a doença precocemente, quando a cirurgia curativa ainda é possível. O conhecimento detalhado da história natural da doença e eventos moleculares que levam a sua progressão é, portanto, fundamental.

métodos e resultados

Analisamos as lesões precursoras, PanINs, a partir de espécimes Pancreatectomia profiláticas de pacientes a partir de quatro famílias diferentes, com alto risco de câncer pancreático familial que foram tratados durante histologicamente comprovada PanIN-2/3. Assim, o material foi adquirido

antes

câncer pancreático tem desenvolvido, ao invés de PanINs em um campo de tecido que já contém o câncer. foi realizada perfil transcricional do genoma usando tais espécimes únicos. secções congeladas em massa exibindo os mais extensa, mas não microdissecadas PanIN-2/3 lesões foram usadas de forma a obter o ponto de vista global de ambas as lesões precursoras e o seu microambiente. Um painel de 76 genes comumente desregulados que fundamentam a progressão neoplásica de pâncreas normal para PanINs e PDAC foram identificados. Além de genes compartilhados também foram observadas algumas diferenças entre os PanINs de famílias individuais, bem como entre os PanINs e PDACs. Este foi particularmente pronunciada no estroma e respostas imunes.

Conclusões

A nossa análise exaustiva das lesões precursoras sem o componente invasivo fornece a prova definitiva de que molecular lesões pancreáticas intraepiteliais gerar câncer do ponto de vista molecular. Nós demonstramos a necessidade de acumulação de alterações transcriptomic durante a progressão da PanIN para PDAC, tanto no epitélio e no estroma circundante. Uma assinatura 76-gene identificado de progressão PDAC apresenta um conjunto de candidatos rico para o desenvolvimento de marcadores precoces de diagnóstico e /ou de vigilância, bem como novos potenciais alvos de prevenção /terapêutico para ambos adenocarcinoma pancreático familiar e esporádica

citação.: Crnogorac-Jurcevic t, Chelala C, Barry S, T Harada, Bhakta V, Lattimore S, et al. (2013) Análise molecular de Lesões Precursoras em Familial cancro do pâncreas. PLoS ONE 8 (1): e54830. doi: 10.1371 /journal.pone.0054830

editor: Hana algul, Technische Universität München, Alemanha |

Recebido: 15 Março, 2012; Aceite: 17 de dezembro de 2012; Publicação: 23 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Crnogorac-Jurcevic et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi suportada por CRUK (https://www.cancerresearchuk.org/). TCJ é financiado pela Higher Education Funding Council para a Inglaterra (HEFCE); https://www.hefce.ac.uk/. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é a quarta principal causa de morte por câncer nos Estados Unidos e sua freqüência tem vindo a aumentar nos últimos anos [1]. Devido à falta de sintomas clinicamente evidentes a maioria dos pacientes apresentam uma doença disseminada e são em grande parte incurável. A taxa de sobrevivência muitíssimo baixo poderia ser grandemente melhorada por métodos eficazes de detecção precoce, ao passo que o cancro ainda é cirurgicamente curável, com uma “janela de oportunidade” para o diagnóstico precoce (por exemplo, a fase de pré-metastática do cancro), sendo, de acordo com uma recente relatório, mais de uma década [2]. Tais métodos de diagnóstico quase certamente irá incluir a análise molecular, e ainda muito poucos estudos de grande escala para investigar o processo de desenvolvimento precoce de câncer de pâncreas foram realizados.

Um paradigma amplamente aceito é que PDAC desenvolve através de uma série de precursor lesões chamado PanINs (neoplasia intra-epitelial pancreáticas). Com base no grau de atipia celular e nuclear, estas lesões progridem a partir PanIN-1, caracterizado por hiperplásico epitélios ductal colunar sem atipia nuclear, através PanIN-2, que mostra displasia de baixo grau, para PanIN-3 (carcinoma

in situ), o que mostra displasia de alto grau de [3]. A linearidade desta progressão ainda não é claro, embora, com base em vários relatórios que mostram frequentes pancreáticas intraepiteliais-1 lesões em pessoas saudáveis ​​e tendo em conta a baixa prevalência de PDAC associado com PanIN-1, essas lesões em fase inicial são provavelmente indolente na natureza . Em contraste, com base em dados moleculares disponíveis, PanIN-2 e -3 lesões são altamente propensos a ser os verdadeiros precursores PDAC [4], [5].

Um dos principais obstáculos para o estudo detalhado da evolução PDAC é obtenção de material clínico de lesões pancreáticas intraepiteliais, o que é uma tarefa particularmente difícil uma vez que os pacientes são largamente assintomático e estas alterações ductais são tipicamente focal. Na verdade, PanIN-2 e -3 lesões são achados normalmente aleatórias em seções patológicas de espécimes com malignidade franco e muitas vezes não são registradas em avaliação histopatológica de rotina

. Neste estudo, a fim de reconstruir a história natural da a doença, analisamos o tecido pancreático fresco congelado que tinha displásicos PanIN-2 e focais PanIN-3 lesões como as alterações histológicas mais avançadas no pâncreas, sem um câncer que o acompanha. Isto é crítico como o uso de lesões displásicas de casos de adenocarcinoma podia arriscar a inclusão de defeitos de campo e cancerisation duto que estão ausentes em espécimes que são ainda livre do câncer. O referido material não seria aleatoriamente disponíveis; foi obtido a partir de pacientes de alto risco que herdam câncer de pâncreas e estão participando de um programa de vigilância do câncer desenvolvido na Universidade de Washington [6], [7].

O estudo de famílias em que o câncer é herdada de forma autossômica dominante tem fornecido recursos consideráveis ​​para a base molecular da doença; cancros pancreáticos herdadas representar até 10% de todos os cancros pancreáticos [8], [9]. Analisamos quatro coortes familiares câncer pancreático (FPC), Família X [10] e três pedigrees adicionais (aqui denominado famílias não-X) e contrastou-los com pâncreas normal e câncer pancreático esporádica. Família X tem uma forma rara, altamente penetrante, autossómica dominante de CPE que é caracterizada por uma mutação da linha germinativa no gene palladin, uma proteína que regula embrionário motilidade celular e invasão [11]. As famílias FPC não-X eram uma população heterogénea com o estado mutacional da linha germinativa desconhecida; sem mutações foram detectadas em CDKN2A (dados não mostrados) e outros ensaios de BRCA2, ATM PALB2 e não foi realizada devido à baixa prevalência geral destas mutações genéticas em FPC e a quantidade insuficiente do material.

O transcriptómica e proteômica [12] perfis de PanINs humanos avançados de tais famílias é fundamental para revelar as alterações moleculares subjacentes à progressão para PDAC e pode fornecer um quadro para a elaboração de novos vigilância, prevenção e modalidades de tratamento.

resultados

As linhagens de quatro diferentes famílias de CPE com, pelo menos, dois membros afectados são mostrados na Figura 1. Três famílias mais pequenas (a, b e c) tem, para além PDAC também outros tumores malignos sólidos, enquanto família de X (X) , que é caracterizada por a doença de início precoce e frequentemente precedidos por endócrino (Diabetes mellitus) e insuficiência exócrina [10], [13] é afectada apenas por PDAC. Os pacientes a partir dos quais foram obtidas amostras são circulados na Figura 1; informações clínicas dos pacientes estão resumidos na Tabela 1.

(A-C) famílias não-X e (X) Família X.

Figura 2 mostra que PanINs familiares assemelhava PanINs esporádicos; No entanto, enquanto as áreas de adjacentes pâncreas, aparentemente normal (marcados com *) foram observadas nos espécimes não-X, pronunciada atrofia acinar generalizada, fibrose e aparência multicística só foi visto em X. Família

O painel superior mostra a histologia de três membros não-X-famílias (A1, B1 e C2). Imagens no topo mostra PanIN-1 e -2 lesões (ampliação x 100); e as imagens no show de fundo PanIN-3 lesões de família B e C; ampliação de × 200). O painel inferior mostra a histologia de três diferentes membros da família X: X1, X5 e X6 no topo mostrar sua aparência bruta (ampliação × 20); imagens no show de fundo PanIN-1 de amostra X1 (ampliação x 100); e pancreáticas intraepiteliais-3 lesões de X5 e X6 (ampliação x 200). * Indica histologicamente adjacente tecido aparentemente normal.

Whole transcriptoma análise

A expressão gênica de 13 amostras pancreáticas intraepiteliais foi comparado com perfis de dados de biópsias inteiras do pâncreas de doadores normal (N1 a 4, dois amostras replicadas) e PDAC esporádica (PDAC1 a 6). agrupamento hierárquico não supervisionado mostrou uma clara separação das amostras em quatro grupos distintos; não-X e Família X PanINs caiu em dois grupos distintos, sendo o primeiro mais perto de amostras normais, enquanto PDACs formado um único cluster distante (figura S1).

Os genes mais comumente-regulada em todos os PanINs comparação às amostras normais foram AGR2, S100P, TFF1, LDLR e emp1 e sub-regulada foram OLFM4, REG3G, REGL1 e ASNS. Quando as amostras pancreáticas intraepiteliais foram comparados com PDACs, os genes mais comumente-regulada nos cancros foram POSTN, COL1A2, SULF1, FN1, IGHM, VCAN e XIST, e estes regulada foram PGC e PPY.

A Venn diagrama na Figura 3A mostra o número total de mudanças de gene entre os três comparações (não-X, X e PDAC) versus pâncreas normal e demonstra o menor número total de genes expressos diferencialmente entre os não-X vs pâncreas normal em comparação com a da família de X vs tecido normal. Enquanto isto é parcialmente devido à presença dos restantes tecidos de aparência normal que era mais abundante nas amostras não-X, como a proporção de genes desregulados para dividir em Família X e PDACs esporádicos (900/2292, 39%) foi maior do que em não famílias -X (125/443, 28%), este poderia também estão na base da maior agressividade da Família-X PanINs, manifestado em sua apresentação clínica mais cedo. Isso também foi visto usando a análise de comparação múltipla de IPA: o mais significativo ‘Molecular e funções celulares “, que constituem a maioria das marcas de câncer [14] (Figura 4A) estão a ser cada vez mais afetadas durante a progressão neoplásica do PanIN-2/3 para o PDAC e são consistentemente mais altos em Família X do que em famílias não-X. De nota, os gráficos mostram a importância dos módulos, em vez de o número de genes ou direção de suas mudanças afetados

(A) diagrama de Venn mostra o número de sondas comuns e únicas na progressão PDAC.; (B) Heatmap de 93 sondas comumente desregulados (76 genes) é mostrado à direita. Cada coluna representa um tipo de comparação e cada linha representa uma sonda do gene. O nível de cima e para baixo-regulação é representada pela intensidade da cor vermelho e verde, respectivamente.

(A) Os módulos funcionais significativas comumente alteradas durante a transição do pâncreas normal para PanIN e PDAC são mostrados. (B) as diferenças nas vias canônicas mais significativamente afetadas entre PanINs e amostras PDAC são apresentados. As linhas horizontais paralelas ao eixo-x em ambas as imagens indicam um P = 0,05 limiar.

Além dos recursos comuns, as diferenças entre os não-X e espécimes X PanINs e PDAC também foram observados, particularmente no ‘sétima marca do câncer’, funções imunes [15], [16]. As vias canónicas mais afectados são mostrados na Figura 4B. A classificação mais alta ‘Apresentação do Antígeno’ foi predominantemente afetados em famílias não-X, com a diminuição dos principais componentes de máquinas apresentadoras de antígenos (CD74, HLA-A /B, HLA-DMA, HLA-DRA /B1, HLA-DQA1 /B1, HLA-DPA1 /B1). Em contraste, a apresentação do antigénio na família X apareceu mais semelhante ao pâncreas normal, enquanto PDAC foi caracterizado por a regulação positiva do HLA-B, HLA-DPA1, HLA-DQA1, HLA-DRB4, TAP2, bem como genes envolvidos na migração de apresentadoras de antígenos células ou seja DMBT1 e CD29, que não são alteradas no PanINs familiares. migração de células dendríticas e recrutamento de macrófagos foram também regulada para baixo em famílias diferentes de X (diminuição da CXCL12, CXCR4, VCAM-1 e expressão ICAM2).

resposta imune humoral foi também significativamente afectada em famílias diferentes de X, com menor expressão de RGS1 (desenvolvimento de células B, proliferação e activação de [17]) e o sistema de complemento, ou seja, C3, C1QA /B /C, C4B, CFB e SERPING1 (Figura 4B). Em contraste, EBF1, IL7R e PRDM1 /BLIMP1 foram sobre-regulada apenas na Família X, enquanto que a sobre-regulação de POU2AF1 e BCL6 (crescimento de células B, a maturação e a formação de centros germinais) [18]) foi observado em ambos PanIN-X e as amostras PDAC. Em PDAC somente, C3, C1S, e CD55 foram up-regulada e PDAC foi caracterizado por uma resposta pró-inflamatória forte (up-regulação da TGFB1, TGFBR1, STAT2, STAT6, SPP1, LIF). Como BCL6 foi recentemente mostrado ser um dos 12 genes estromais que podem distinguir pré-invasivo de doença invasiva em carcinoma esofágico com base em perfis do estroma microdissecados apenas [19], que foram seleccionados para esse gene validação em tecidos pancreáticos. Nós mostramos que o aumento do nível de transcrição BCL6 ( 2 vezes) visto em PanIN-X e PDAC, é contribuído pela imunorreactividade nuclear forte nas células inflamatórias do estroma (Figura 5A). De 24 lesões pancreáticas intraepiteliais em TMA1, 16 (67%) apresentada infiltrado inflamatório, nove das quais (56%) (2/2 PanIN-1, 4/7 PanIN-2 e 3/7 PanIN-3) células positivas BCL6 composto. De 15 casos PDAC, 13 (87%) compreenderam infiltrado inflamatório; 11 destes (85%), incluindo quatro cancros com PanINs, mostrou BCL6 imunorreactividade.

(A) Imagens representativas de células positivas BCL6 (coloração castanha) no estroma na vizinhança de lesões pancreáticas intraepiteliais são mostrados na dois painéis de topo (tanto ampliada × 100); duas imagens de baixo mostram infiltrado inflamatório de células imunorreactivas BCL6 em dois casos PDAC (ampliação de × 100 e × 50, respectivamente). (B) a expressão nuclear HMGB1 (coloração marrom) foi observada em todos os compartimentos do pâncreas, incluindo estromal infiltrado imunológico: painéis superiores mostram PanIN-1 (à esquerda) e 2 (direita) (ampliação × 50, inserir e segunda x100 painel); painéis inferiores mostram PanIN-3 (esquerda) e PDAC (direita) (ampliação × 100 e × 50, respectivamente).

Um teste padrão molecular associado a danos prototypic (DAMP) de HMGB1 de sinalização /2 era também evidente, predominantemente em PanIN-X e PDAC (Figura 4B); isso sinaliza Caminho através RAGE [20]. Para determinar a localização e a expressão de HMGB1, IHC foi realizada análise (Figura 5B). A imunorreactividade nuclear foi observada em ambas as células exócrinas e endócrinas, bem como no componente do estroma imune. HMGB1 expressão foi observada em 67% (16/24) de PanINs (3/4 pancreáticas intraepiteliais-1, 2-pancreáticas intraepiteliais 5/10 e 8/10 PanIN-3) a partir de TMA1, em todos os PanINs encontrados dentro de 15 casos em 13 e PDAC /15 (87%) lesões PDAC (dois casos PDAC sem expressão /fracos eram pouco diferenciado). De nota, expressão HMGB1 já tem sido associado com várias doenças cancerosas (para revisão ver [21]). Em PDAC, HMGB1 soro foi relatado recentemente para correlacionar com palco, ressecabilidade e início vs tarde PDAC [22]

A superfamília DAMP também inclui genes S100, vários dos quais foram up-regulamentados em PanIN-X:. S100A4 , S100A6, S100A7A, S100A10, S100A13 e S100A16. A desregulação da S100A2 e S100A11 foi adicionalmente, visto na PDAC, enquanto S100P foi geralmente regulada para cima em todas as lesões pancreáticas intraepiteliais (X e não-X) e PDACs, fundamentar ainda mais a importância dos genes S100 no desenvolvimento e progressão de CPE como visto na esporádica casos [23], [24]. Outras vias canônicas cuja importância aumenta com a progressão do câncer foram citoesqueleto e motilidade /invasão ( ‘citoesqueleto de actina sinalização “,” Regulamento da motilidade à base de actina por Rho’ e ‘Ephrin sinalização’) (Tabela S1); adesão ( “sinalização de integrina ‘,’ sinalização ILK ‘e’ sinalização FAK ‘) (Tabela S2); e resposta do estroma, com uma maior expressão de genes e o número de ECM visto como PanINs progredir para PDAC (Figura 4B). Um grande número destes agrupadas dentro de ‘activação de células fibrose e estreladas hepáticas “(Tabela S3) e pode, potencialmente, representar a ativação de células estreladas pancreáticas, que foram relatados para ter perfis muito semelhantes às células estreladas hepáticas [25]. Além disso, além de COL1A1, COL1A2 e COL3A1, outros colágenos (COL4-6A2 e COL12A1), e genes de ECM (BGN, VCAN, DCN, SPARC, SPON1 e THBS1) foram regulados positivamente em lesões PanIN-X e PDACs; em PDACs, envolvimento do estroma foi caracterizado por uma ainda maior diversidade de colagénios (COL10A1, COL11A1, COL14-16A1 COL18A1 e foram, adicionalmente, visto), e de expressão ainda mais elevado do que em lesões PanIN-X dos genes ECM mencionados acima. Importante, COL11A1 foi recentemente demonstrado ser um marcador específico de células estreladas pancreáticas [26], o que indica que a sua acumulação é particularmente pronunciada em PDAC. acumulação significativa de metalo-proteinases de matriz e cisteína-proteinases já foi observada em lesões PanIN-X ,, com o aumento dos níveis de MMP1, MMP2 e MMP19, e CTSC, CTSE e CTSK, respectivamente. proteases adicionais (MMP7, MMP9, MMP11, MMP14, MMP28 e CTSA e CTSB) foram desregulados somente em espécimes PDAC.

amostras Família X diferiam tanto não-X PanINs e PDACs na desregulamentação de um número de genes envolvido na sinalização de insulina e diabetes (INSR, IRS1 e 2, IGF1, IGFBP2-BP7, CASR, ADIPOQ e NR5A2); Isto é ilustrado na Figura S2 e S3, com acompanhamento de discussão).

Comparação de PanINs familiares com dados da PDACs esporádica

As comparações múltiplas de nossos dados com relatórios publicados anteriormente foram alcançados usando banco de dados Expressão pâncreas (https://www.pancreasexpression.org/). Quando os dados de não-X e X PanINs foram comparados com perfis publicados a partir PanINs microdissecadas de PDACs esporádicas [5], [27], 44 e 185 genes desregulados foram compartilhadas, respectivamente (Tabela S4). Três dos genes comumente desregulados foram validados com sucesso por QRT-PCR: AGR2, S100P e EGR1. Além disso, a maior expressão de Fos em Família X e PanINs maioria dos PDACs também foi confirmada (Figura 6)

análise de qRT-PCR validada a expressão diferencial para AGR2, S100P, FOS e EGR1 pancreáticas intraepiteliais em lesões primárias.: PanA1, B1-3 e C1,2 representam famílias não-X, enquanto PanX1 e 3 pertencem a amostras Família X; PDAC1-7 representam sete espécimes PDAC diferentes.

Quando não-X e X pancreáticas intraepiteliais dados foram comparados com perfis PDAC esporádicos dissecados e granel (referências estão listados no banco de dados Expressão pâncreas), cerca de 5% e 25 % de sobreposição foi visto, respectivamente. Isso é menos do que foi visto em nosso PanIN vs comparação PDAC, e é em grande parte atribuída a diferentes plataformas e de técnicas experimentais utilizadas.

Por fim, não-X e transcriptomes X pancreáticas intraepiteliais foram comparados com o nosso PanIN-3 proteoma [ ,,,0],12], 46/900 (5%) e 132/900 (15%) de proteínas combinando os transcritos de ARN, respectivamente; estes dados validam de forma independente os nossos resultados no nível de proteína (Tabela S5A e B).

Common PanIN-PDAC gene progressão assinatura

O heatmap na Figura 3B e Quadro S6 exibir as 93 sondas que representam 76 transcrições comumente diferencialmente expressos em todas as comparações (X vs normal, não-X vs normal, PDAC vs normal).

Mais de 10 diferentes enzimas eram comumente regulada para baixo, incluindo os envolvidos na síntese e catabolismo de amino ácidos (ASNS, BCAT1, EPR, SARS, yars, PSAT1); Além disso, a desregulamentação de vários transportadores de soluto aponta para um transporte deficiente de aminoácidos (SLC1A2, SLC1A4, SLC25A22). mudanças de expressão em SLC20A1, um symporter fosfato dependente de sódio e potássio (KCTD14 canal tetramerisation de domínio contendo-14) sugere prejudicada transporte de íons também.

genes estromais comumente expressa incluem COL1A1, THBS1, FMOD e SERPINE1 através todos Panin lesões e PDAC. COL1A1, um importante componente de desmoplasia pancreático promove a invasão e metástase em PDAC [28]. A expressão aumentada de THBS1 é um preditor prognóstico do aumento da capacidade de invasão em PDAC [29] e está correlacionada com a progressão da metaplasia-displasia e cancro do esófago em [19]. Além disso, THBS1 também aumenta a expressão de SERPINE1 [30], que é fracamente regulada para cima em ambos os não-X e X PanINs e fortemente sobre-regulada em PDAC. Portanto, enquanto estes genes do estroma ter sido previamente associado com PDAC, mostra-se que eles já são sobre-expressos em lesões pancreáticas intraepiteliais antes da formação do cancro.

Um dos principais reguladores da via de NF-kB, NFKBIZ, é vista desregulamentado em todos PanINs. A sua sobre-regulação pode contribuir para o aumento da inflamação do pâncreas que favorece a progressão do tumor [31]. A expressão de um receptor de interleucina, IL22RA1, foi diminuída em PanINs e PDACs, mas como este gene é expresso principalmente nas células dos ilhéus [32], a perda de células dos ilhéus poderia explicar este resultado. CXCL12 também foi acometido; que desempenha um papel na cancerígenas se espalham /metástases através da interação com seu receptor CXCR4. Ambos CXCL12 e CXCR4 foram regulados negativamente em não-X PanINs, enquanto apenas CXCL12 é regulada nas lesões PanIN X, e os níveis de CXCR4 são normais. Em contraste, PDACs mostraram um aumento dos níveis de CXCR4; . Este é um recurso bem estabelecido de muitos tipos de câncer [33] e é um preditor de sobrevida pobre em PDAC [34]

Vários fatores de transcrição também foram encontrados regulado para cima em ambos os PanINs e PDACs: KLF3, KLF6 e EGR1.

Finalmente, REG3G e REGL, marcadores de lesão pancreática [35] foram consistentemente sub-expressas em ambos os PanINs e PDACs, e indicar perda de células acinares durante o desenvolvimento PDAC.

In silico

comparação de nosso 76 comumente diferencialmente expressos PanIN /transcrições PDAC com nossos esporádica e familiar PanIN-3 dados de proteômica ([12], e dados não publicados) destacou a expressão de nove dos 76 genes também no nível de proteína: ACTA2, AGR2, AHCY, COL1A1, COPB2, HSPA5, HSPA8, S100P e TFF1, proporcionando assim uma validação independente de nossos dados de perfil. Embora se tenha anteriormente demonstrado que a AGR2 é expresso em ambas PanINs esporádica e familiar [36], que aqui adicionalmente validado TFF1 por IHC utilizando secções derivadas de tecidos da família X (Figura 7). Isto demonstrou a expressão quase universal de TFF1 nas lesões precursoras familiares (5/10 pancreáticas intraepiteliais-1, 9/9 pancreáticas intraepiteliais-2 e 4/4 PanIN-3) como se mostra anteriormente em casos esporádicos [37].

o painel (a) mostra PanIN-1 sem imunoreactividade TFF1, (B) e (C) PanIN-2 e (D) 3-PanIN lesão no centro com expressão forte TFF1 (todos X100 ampliada).

Discussão

Enquanto descrição precoce das lesões precursoras PDAC remonta à década de 1950 [38], e a hipótese de que a hiperplasia atípica e carcinoma

in situ Quais são precursores para PDACs é mais do que 30 anos [39], o consenso PanIN nomenclatura foi estabelecida há relativamente pouco tempo [3].

Apesar de vários histológica detalhada e estudos clínicos [40], e um relatório de aumento da prevalência de lesões pancreáticas intraepiteliais tanto esporádica [41 ] e os pacientes PDAC familiares [42], o nosso conhecimento dos eventos moleculares subjacentes nessas lesões precursoras é ainda limitada. Isto é principalmente devido à inacessibilidade de espécimes pancreáticas intraepiteliais.

Aqui, analisamos PanIN-2/3 lesões de espécimes Pancreatectomia derivados de FPC

sem

a presença de carcinoma invasivo, o que é crítico como muitas vezes é difícil distinguir entre os verdadeiros PanIN-3 lesões e cancerisation de condutas por câncer invasivo bem diferenciado na amostra que contém ambos. Apenas dois estudos de pequena escala semelhantes têm sido relatados em lesões pancreáticas intraepiteliais detectados na ausência de cancro: Zhang et al [43] analisados ​​mutações KRAS e expressão de proteína de p53, p16 e ciclina D1 em PanINs no pâncreas heterotópico livre de tumor de pacientes PDAC e Baumgart et al [44] analisadas amostras pancreáticas intraepiteliais a partir de um paciente com pancreatite crónica que tinha pancreáticas intraepiteliais 3-lesões; Ambos os estudos fornecem evidência direta para o modelo de progressão PanIN-PDAC. As análises moleculares abrangentes apresentado aqui não só fornece suporte definitiva do modelo de progressão, mas também nos permitiu investigar as vias moleculares subjacentes e avaliar as semelhanças entre as lesões precursoras esporádica e familiar em uma escala de todo o genoma.

Embora a prevalência semelhante de mutações “assinatura” em amostras PDAC esporádica e familiar tenha sido previamente relatada [45], e analisa mutação na família X conformados com esses dados [6], que agora mostram que no nível transcriptoma, lesões pancreáticas intraepiteliais em nossos casos familiares também sofreram alterações semelhantes às vistas em cancro esporádico. Com base na comparação dos dados de SEER (Vigilância Epidemiologia e Resultados Finais) do banco de dados e dados sobre PanINs familiares de Brune et al [46] Schwartz e Henson [47] sugeriu que PDACs familiares podem ter caminhos semelhantes ou que se sobrepõem aos de casos esporádicos. Nós agora fornecer evidências moleculares que este é realmente o caso

Dois estudos transcriptoma de PanINs esporádicos na definição de câncer pancreático foram relatados.; Prasad et al [27] em comparação microdissecadas PanIN-1B /2 lesões com ductos normais; Buchholz et al [5] usou material de microdissecção para comparar PanINs de todos os graus às condutas normais e PDACs, mostrando um aumento constante no número de transcrições diferenciais com displasia avançada. Estes estudos utilizaram feito por encomenda e matrizes de ADNc à base de oligo, respectivamente, com material fluorolabelled amplificado a partir de PDACs esporádicos; usamos cobertura muito maior matrizes Affymetrix com o material sem amplificação do primário enriquecido PanIN-2/3 lesões que ocorreram na ausência de câncer. A sobreposição entre os genes nos três estudos foi de cerca de 4% para PanINs não-X e 18% para a Família X PanINs. Considerando-se a congruência limitada relatado entre os estudos de perfis [48] e as diferenças entre os três conjuntos de dados, este é, de facto, uma boa quantidade de sobreposição. A descoberta de genes comuns através de tais estudos díspares prova que estes genes são robustos uniformemente desregulado durante a progressão PanIN.

Com base no volume de alterações na transcrição PanINs derivados de Família X e famílias diferentes de X, com cerca de 40% de transcritos diferenciais compartilhados com PDAC, as lesões pancreáticas intraepiteliais na família X apareceu mais molecularmente em sintonia com câncer. Essas mudanças de transcrição espelhar tanto o histopatológico ea imagem clinicamente mais agressivos, como PDAC na família X desenvolve ~ 20 anos anteriores (média de 40 anos de idade) e câncer em famílias não-X 5-10 anos anteriores (média de 54 anos) do que em cancro esporádico

as diferenças mais acentuadas entre as lesões pancreáticas intraepiteliais a partir da família de X e X famílias não foram vistos na resposta imunitária:., enquanto a resposta inflamatória em famílias diferentes de X foi geralmente deficiente, com sub-representação significativa de genes na apresentação de antigénio e vias de resposta humoral, o perfil de resposta imune em Família X foi em muitos aspectos semelhante ao PDAC. Curiosamente, aumento da regulação do KIT, a sua KITLG ligando /SCF e TPSAB1 triptase foram já visto em Família X PanINs. Kit é um proto-oncogene associadas com vários tumores que aumenta a proliferação e invasão de linhas celulares de cancro pancreático [49]; KITLG /SCF e TPSAB1 são marcadores de mastócitos indicando uma infiltração precoce do estroma circundante PanINs com mastócitos. Um meio pró-inflamatório composto de macrófagos e mastócitos foi mostrado para promover o crescimento e invasão [50] do cancro, [51]; a inibição de células mastro tem sido proposta como uma estratégia terapêutica para PDAC [52]

A diferença mais notável visto entre os PanINs reflecte a histologia da família de X, que mostra uma extensa alteração desmoplásica.; este foi caracterizado com tanto maior expressão e aumento do número de genes associados de estroma, indicando que o estroma co-evolui com elementos epiteliais nas lesões precursoras PDAC. Descobertas similares foram relatados em lesões mamárias precursores, onde extensas alterações de expressão de genes no estroma estão associados com carcinoma ductal in situ (CDIS) [53]. aumenta ainda mais significativas na expressão de genes estromais foram vistos em nossos dados PDAC; a importância do estroma na biologia do cancro pancreático esporádica é bem reconhecido [54], [55]. Todos juntos, estes dados indicam que a co-operação mudar de transcrição, tanto do tumor e seu microambiente pode alterar dramaticamente a história natural da doença e que o monitoramento ambos os compartimentos também pode fornecer um melhor preditor da evolução do câncer de pâncreas no ambiente familiar.

Setenta e seis genes comuns foram uniformemente afetada ao longo da evolução da doença e parece ser fundamental para a progressão neoplásica em câncer pancreático, independentemente de saber se é esporádica ou familiar. Dentro deste conjunto de genes, destacam-se dois genes, S100P e AGR2, que com COL1A1 mostram o mais elevado sobre-expressão em ambas as lesões pancreáticas intraepiteliais e PDAC na análise atual, bem como em nossos dados publicados anteriormente. Ambos já foram envolvidos no desenvolvimento e na progressão da PDAC esporádica: Expressão S100P aumenta com o grau PanIN [24], e AGR2 é uniformemente expressa desde os primeiros lesões PanIN-1 [36], [56]. Como estas duas proteínas são expressas também em lesões familiares que representam alvos diagnóstico, prevenção e terapêuticas promissoras.

Os 76 genes comuns observados são marcadores de lesões displásicas que fundamentam a progressão neoplásica, que, assim, propor que este perfil neoplásica núcleo pode ser úteis na monitorização da progressão PanIN e pode formar uma base para a concepção de um teste molecular para ser utilizado em conjunto com SUE vigilância /MRCP. Embora o número de membros afetados nos aumentos de parentes do risco de desenvolvimento PDAC, dados os riscos variados para PDAC entre famílias com síndromes clínicas heterogéneas, é um desafio para diferenciar os pacientes que irão desenvolver a progressão neoplásica rápida daqueles com a doença estável e para identificar quais grupos irão beneficiar mais de um programa abrangente de vigilância câncer pancreático. Atualmente, se EUS anormal e descobertas MRCP justificar um diagnóstico do tecido, uma pancreatectomia parcial com exame histopatológico detalhada é executada. A inclusão de um ensaio molecular adicional, sensível, pode ser instrumental na decisão sobre como proceder (ainda mais a vigilância contra pancreatectomy).