Sumário
AS1411 (anteriormente conhecido como AGRO100) é um aptâmero DNA ricas em guanina 26 nucleotídeos que forma uma estrutura guanina quádruplo. AS1411 tem mostrado promissor utilidade como tratamento para o cancro em fase I e fase II de ensaios clínicos sem causar grandes efeitos colaterais. AS1411 inibe o crescimento de células tumorais através da ligação a nucleolina que é aberrante expresso na membrana de células de muitos tumores. Neste estudo, utilizou-se uma técnica simples para conjugar um agente quimioterapêutico largamente utilizado, a doxorrubicina (Dox), para AS1411 para formar um medicamento de DNA sintético O aducto (DDA), denominado como AS1411-Dox. Nós demonstrar a utilidade de AS1411-Dox no tratamento do carcinoma hepatocelular (HCC), avaliando a entrega direccionada de Dox de células Huh7
in vitro
e num modelo de xenoenxerto de murinos de HCC.
citação: TL Trinh, Zhu L, Xiao X, W Puszyk, Sefah K, Wu Q, et ai. (2015) A Synthetic Aptamer-Drogas aduto de terapia direcionada cancro do fígado. PLoS ONE 10 (11): e0136673. doi: 10.1371 /journal.pone.0136673
editor: Ratna B. Ray, Universidade de Saint Louis, Estados Unidos
Recebido: 12 Março, 2015; Aceito: 06 de agosto de 2015; Publicação: 02 de novembro de 2015
Direitos de autor: © 2015 Trinh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
financiamento:. os autores agradecem o Instituto Nacional de Heath para a concessão de financiamento para este projecto R01 CA133086 a (CL) e (WT). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Até agora, os únicos tratamentos curativos para o cancro do fígado são transplante hepático ou ressecção do tumor. Muitas vezes, o câncer de fígado é detectado na fase final e não há atualmente alguns tratamentos quimioterápicos disponíveis. Sorafenib e doxorrubicina são drogas que formam a base dos tratamentos de quimioterapia sistémica usados para tratar câncer de fígado. No entanto, estes tratamentos são o desenvolvimento do tumor atraso paliativos e apenas e progressão. Estes tratamentos não segmentados de câncer de fígado não são muito bem sucedida, e pode causar a doença iatrogênica devido aos efeitos colaterais off-alvo. Portanto, abordagens de tratamento que especificamente tecido tumoral são altamente desejáveis. A terapia direcionada obter a entrega selectiva de agentes terapêuticos mediados por elementos de reconhecimento que se pode ligar com elevada afinidade a receptores sobre-expressos em células cancerosas alvo [1]. elementos de reconhecimento possíveis incluem; anticorpos [2], vitaminas [3,4], designadamente os aptâmeros [5]. aptâmeros de ácido nucleico são (ss) oligonucleótidos de cadeia simples com conformações intramoleculares originais com a capacidade de reconhecer alvos moleculares específicos. aptâmeros de oligonucleotídeos são normalmente isolado através Evolução Sistemática de Ligandos por Enriquecimento Exponencial (SELEX) [6,7]. aptâmeros específicos das células cancerosas podem ser isolados directamente utilizando células cancerosas vivas, utilizando células-SELEX [8]. Aptâmeros têm muitas vantagens sobre outros elementos de reconhecimento [9]. SELEX é normalmente mais eficiente e rentável do que o desenvolvimento de anticorpos. características vantajosa de aptâmeros de oligonucleótidos incluem; facilidade de síntese automatizada, facilidade de modificação de porções funcionais, alta estabilidade, vida de prateleira longa, baixa imunogenicidade, e a facilidade de desenvolvimento antídoto por síntese de ADN anti-sentido [10,11]. Essas vantagens fazem aptâmeros uma abordagem atraente para aplicações biomédicas ou clínicos, incluindo terapia-alvo.
Os conjugados de medicamentos e elementos de reconhecimento (por exemplo, conjugados anticorpo-fármaco) têm sido intensamente estudada por empresas farmacêuticas líderes a fim de alcançar alvo terapia [2,12]. Os aptâmeros, devido às suas vantagens inerentes, espera-se que desempenham um papel importante na entrega direccionada de agentes terapêuticos no futuro. A facilidade de site-specific modificação química de aptâmeros facilita muito a conjugação com as drogas, incluindo quimioterápicos e fotossensibilizantes, ou com nanomateriais, como nanotubos de carbono ou nanopartículas de ouro [13,14]. Além disso, os aptâmeros de ácido nucleico são altamente estável, proporcionar oportunidades valiosas para conceber conjugados aptâmeros-terapêutico através de uma variedade de reacções químicas ou pela formação de complexos físicos. Nós desenvolvemos uma tecnologia sintética aducto-DNA droga (DDA) para a conjugação de ADN-droga fácil e eficiente, inspirado pelos adutos formados naturalmente entre os ácidos nucleicos e os vários produtos químicos, tais como os formados entre o ADN genómico e Dox durante a administração de Dox. DDAs são estáveis a temperaturas relativamente baixas (por exemplo, 4 ° C) durante o armazenamento a longo prazo, mas são capazes de libertar as drogas em temperaturas fisiológicas (cerca de 37 ° C). Notavelmente, a espinha dorsal do ADN de DDAs também é resistente a nucleases clivagem, muito provavelmente devido ao impedimento estérico prevenção de nuclease de ligação. Os recursos combinados da tecnologia DDA torná-lo uma abordagem promissora para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento do câncer de fígado alvo.
Neste trabalho, nós nos concentramos em AS1411 (AGRO100), um aptâmero DNA conhecida, atualmente em II dos ensaios clínicos de fase para o tratamento de leucemia mielóide aguda (LMA) e de carcinoma de células renais (RCC) [15,16]. Vários estudos têm mostrado que a nucleolina se liga AS1411 membrana plasmática, que é altamente expresso por muitos tipos de células de cancro, e induz a apoptose de células de tumor [17-19]. Embora os efeitos da AS1411 foram avaliados em muitos tipos de câncer, a potência terapêutica deste aptâmero é muitas vezes limitada. Para abordar esta questão, aqui nós desenvolvemos um aduto AS1411-doxorrubicina (AS1411-Dox) para combinar a capacidade de segmentação de AS1411 ea potência terapêutica de Dox. Avaliou-se a utilidade de AS1411 e AS1411-Dox em um modelo de carcinoma hepatocelular (HCC). Os resultados identificar o aduto AS1411-Dox como um novo medicamento para o tratamento de HCC.
Materiais e Métodos
Ética declaração
As amostras foram obtidas com a aprovação da Universidade de Florida Gainesville Health Science Center Institutional Review Board (IRB-01). tumor emparelhados e os tecidos do fígado não tumorais foram utilizadas neste estudo. Também obtido aprovação separado para a geração do HCO2 linha celular (desenvolvida a partir de um tecido HCC VHC /livre de HBV no nosso laboratório). Não há órgãos de doadores foram obtidos a partir de prisioneiros executados ou outras pessoas institucionalizadas. consentimentos informados por escrito foram obtidas de todas as disciplinas. Todos os estudos com animais foram aprovados pela Universidade da Flórida Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).
preparação de ADN Aptamer
Todas as sondas de ADN foram sintetizados num sintetizador de DNA ABI3400 /RNA (Applied Biosystems , Foster City, CA, EUA). A biotina foi acoplada na extremidade 5 ‘de sondas de ADN para análise de citometria de fluxo. As sequências completas foram então desprotegido em AMA (hidróxido de amónio /40% de metilamina aquosa a 1: 1) a 65 ° C durante 30 min e depois purificado por HPLC de fase inversa (ProStar, Varian, Walnut Creek, CA, EUA) sobre uma coluna C-18 utilizando acetato de trietilamina a 0,1 M (TEAA, Glen Research Corp.) e acetonitrilo (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) como o eluente. Os produtos de DNA foram secos e, em seguida, destritilado por dissolução e incubando produtos de ADN em 200 pL de ácido acético a 80% durante 20 minutos. Os produtos de DNA foram então precipitados destritilado com NaCl (3 M, 25 mL) e etanol (600 mL). UV-vis as medições foram realizadas com um Cary Bio-100 UV /Vis espectrómetro (Varian) para a quantificação da sonda.
cultura celular
Todas as linhas de células de cancro excepto HCO2 foram obtidas a partir da American Type Culture Colecção (Manassas, VA). HCO2 foi desenvolvido a partir de um /tecido HCC livre de HBV HCV em nosso laboratório. Hu767, uma amostra de hepatócitos primários, foi obtido a partir de um dador saudável de Cellz directa (Raleigh, NC). As células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (inactivado pelo calor, Gibco) e 100 UI /mL de penicilina-estreptomicina (Cellgro) a 37 ° C numa atmosfera húmida com 5% de CO
2 . A densidade das células foi determinada antes de cada experiência utilizando um hemocitómetro.
Preparação e caracterização de AS1411-Dox aducto
Utilizando um protocolo modificado [20], AS1411-Dox aducto foi preparado por incubação de Dox (500 ^ M), o ADN (20