Abstract

fundo e métodos

proteínas da família Pim são quinases oncogênicas implicados em vários tipos de câncer e envolvidos na regulação da proliferação celular, sobrevivência, bem como a motilidade. Aqui nós investigamos a capacidade de quinases Pim para promover o crescimento metastático de células de câncer de próstata em dois modelos de xenotransplante de cancro da próstata humano. Nós também avaliaram a eficácia dos inibidores de Pim selectivos para antagonizar estes efeitos.

Resultados

Os dados levantados mostram que o crescimento tumorigénico de ambos por via subcutânea e xenoenxertos de cancro da próstata ortotopicamente inoculados é reforçada pela superexpressão estável de quer Pim-1 ou PIM-3. Além disso, a PIM-sobre-expressam tumores da próstata ortotópicos são altamente invasivo e capaz de migrar, não só para os gânglios linfáticos de drenagem próximos da próstata, mas também para os pulmões de modo a formar metástases. Quando os ratos são tratados diariamente xenoenxertados com o inibidor selectivo PIM-DHPCC-9, ambos os volumes, bem como a capacidade metastática dos tumores são drasticamente diminuído. Curiosamente, o crescimento metastático PIM-promovido dos xenoenxertos ortotópicos está associado com angiogénese e linf melhorada. Além disso, a expressão forçada Pim também aumenta a fosforilação do receptor de quimioquinas CXCR4, que pode permitir que as células de tumor para migrar para os tecidos, tais como os pulmões, que expressam o ligando de quimiocina CXCL12.

Conclusões

Os nossos resultados indicam que Pim superexpressão melhora as propriedades invasivas das células cancerosas da próstata

in vivo

. Estes efeitos podem ser reduzidos por o inibidor selectivo PIM-DHPCC-9, que pode atingir os tecidos tumorais, sem efeitos colaterais graves. Assim, Pim-alvo terapias com DHPCC-9-like compostos podem ajudar a prevenir a progressão de carcinomas da próstata locais para fatalmente doenças malignas metastáticas

Citation:. Santio NM, Eerola SK, Paatero I, Yli-Kauhaluoma J, Anizon F, P Moreau, et ai. (2015) Pim Quinases promover o crescimento de Migração e metastático de cancro da próstata xenoenxertos. PLoS ONE 10 (6): e0130340. doi: 10.1371 /journal.pone.0130340

Editor do Academic: Jeffrey K. Harrison, da Universidade da Flórida, Estados Unidos

Recebido: 20 de novembro de 2014; Aceito: 19 de maio de 2015; Publicação: 15 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Santio et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Academia da Finlândia (concessão 121533 para PJK, conceder 269,541 para PH), Programa TULI da Universidade de Turku (PJK), Fundação Sigrid Juselius (PH), FinPharma Programa de Doutorado (NMS), Emil Aaltonen Foundation (NMS), organizações de câncer para a Finlândia Ocidental (NMS), Fundação Orion-Farmos Research (NMS), Fundação finlandesa Cultural (NMS), Fundação Universidade Turku (SKE) e Walter och Lisi Wahls Stiftelse för Naturvetenskaplig Forskning (JYK). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Johanna Tuomela foi empregado por Pharmatest Services Ltd, por um período durante o estudo. Pharmatest não têm qualquer papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. O papel específico de JT é articulada na seção “autor contribuições ‘

Conflito de interesses:. Johanna Tuomela foi empregado por Pharmatest Services Ltd, por um período durante o estudo. Não há patentes, produtos em desenvolvimento, ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão do JT a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Pirkko Härkönen é um membro do Conselho Editorial PLOS, mas isso não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O

pim

a família de genes foram primeiro identificados como locais de integração proviral de Moloney vírus da leucemia murina [1], mas foram mais tarde foi mostrado para ser envolvido no desenvolvimento de malignidades linfóides humanas, bem como tumores sólidos [2]. As proteínas codificadas pelos três

PIM

genes da família são cinases de serina /treonina-específico que foram mostrados para promover a tumorigénese, aumentando tanto a proliferação e sobrevivência de células [2,3]. Mais recentemente, e outros também têm implicado los na regulação da migração e invasão das células cancerosas aderentes [4-6], enquanto que os resultados dos estudos clínicos mostram associação de níveis anormalmente elevados de Pim quinases com neoplasias malignas mais de origem epitelial [7 -9].

por causa de seus papéis emergentes no desenvolvimento do câncer, quinases Pim tornaram-se altamente atraente como alvos terapêuticos [10-12]. Há também razões fisiológicas e estruturais para justificar quinases Pim como alvos de drogas. Em primeiro lugar, não é esperado inactivação de quinases PIM para causar efeitos secundários graves, uma vez que os ratinhos deficientes em todos os três membros da família Pim são viáveis ​​[13]. Em segundo lugar, as características estruturais únicas dentro da região de charneira de ligação entre os lóbulos N- e C-terminais em volta da bolsa de ligação ao ATP tornar as quinases Pim constitutivamente activo e permitir concepção de inibidores altamente selectivos [14]. Temos recentemente identificados inibidores da quinase Pim potentes e selectivos nos dois grupos não relacionados estruturalmente dos compostos, pirrolocarbazoles tetracíclicos [15] e tricíclicos benzo [

CD

] azuleno [16]. Temos também funcionalmente validado-los em ambos os

in vitro Comprar e ensaios baseados em células [6, 17].

xenotransplantes tumorais proporcionar excelentes ajustes fisiológicos para estudos pré-clínicos de prova de conceito, tanto para identificar alvos terapêuticos e avaliar

in vivo

eficácia dos compostos de segmentação-los. inoculação subcutânea de PC-3 de células de cancro da próstata que sobre-expressam quer Pim-1 ou Pim-2 em ratinhos imunodeficientes anteriormente foi mostrado resultar em tumores maiores [18], mas os dados comparáveis ​​em PIM-3 tem faltado como prova também directa para o capacidade de Pim quinases contribuem para a formação de metástases. No entanto, a informação a partir de ensaios de motilidade à base de células, bem como dados clínicos ligar a regulação positiva de quinases PIM para a migração de células de cancro, invasão e comportamento mais maligno [4-9]. Além disso, a PIM-1 tem sido mostrado para regular a via /CXCL12 quimiocina CXCR4, que desempenha um importante papel na migração e invasão de ambos os leucémicas [4, 19] e células de cancro da próstata [20-23].

neste estudo, avaliaram os efeitos de quinases Pim e seus inibidores usando ambos os modelos do rato xenoenxerto subcutâneo e ortotópicos de cancro da próstata humano. Nós demonstramos que a PIM-1 sobre-expresso ou PIM-3-cinases não só promover o crescimento de xenoenxertos PC-3 derivado de células, mas também propriedades metastáticas de tumores induzidos ortotopicamente, e compostos que PIM-inibidoras podem prevenir estes efeitos. Mostramos também que o crescimento metastático Pim-promovido está associada com aumento da angiogênese, lymphangiogenesis e fosforilação CXCR4.

Resultados

Pim-3 quinase aumenta o crescimento e as propriedades metastáticas de xenoenxertos de cancro da próstata

para investigar a capacidade de Pim-3 para promover o crescimento de tumores e metástases em

in vivo

condições, estabelecemos uma linha de células de câncer de PC-3 /Pim-3 próstata estável expressando Pim-3 humana, juntamente com tomate como uma fluorescente marcador de follow-up. A fim de avaliar o potencial tumorigénico de a linha de células PC-3 /PIM-3, em comparação com a linha de células transfectadas por simulação de PC-3 de controlo, as células foram inoculadas por via subcutânea em camundongos machos nus atímicos. Durante o período de acompanhamento de até 24 dias, os volumes dos tumores foram medidos tanto com um paquímetro e pela imagem fluorescente de expressão tomate. Após o sacrifício, tumores e amostras de tecidos foram excisadas para fluoro- e análises morfométricas. Estas revelaram que a PIM-3 que sobre-expressam xenoenxertos tinham crescido significativamente mais rápido do que as células transfectadas por simulação, apesar de os tumores tinham permanecido local, sem quaisquer sinais de metástases (Fig 1A e 1B). Os volumes de tumor medidos manualmente correlacionada com as zonas determinadas por imagiologia fluorescente (Fig S1). Para analisar ainda mais as propriedades de crescimento desses tumores, células mitóticas foram coradas a partir de amostras de tecidos embebidos em parafina. Curiosamente, a proporção de células mitóticas foi claramente mais elevada nos tecidos de tumor PIM-3 que sobre-expressam que nos controlos (Fig 1C e S1 FIG). As diferenças nos volumes dos tumores também podem ser detectados a partir de exames de todo o tumor usados ​​para análise das células mitóticas (Fig S1). Simultaneamente com as experiências subcutâneas, as células foram cultivadas durante três semanas sem selecção de antibiótico para confirmar a estabilidade do PIM-3 sobre-expressão (Fig S1).

linhas celulares derivadas de PC-3-que tinham sido transfectadas de forma estável com um vazio vetor (C) ou um vector expressando o PIM-3 (P3) foram subcutaneamente ou ortotopicamente injectadas em ratinhos nus atímicos. Tumores e tecidos isolados foram corados com hematoxilina e eosina para visualização de sua estrutura. colorações adicionais foram realizadas com anticorpo anti-fosfo-histona H3 para visualizar o número de células mitóticas. Nas experiências subcutâneos, a formação do tumor foi seguido por imagiologia de fluorescência de expressão de tomate (A) e os tamanhos aproximados de tumor foram medidos por palpação, em diferentes pontos de tempo (B). Após 24 dias, os ratinhos foram sacrificados e os seus tumores e tecidos foram recolhidos. São mostrados os valores médios de todas as secções do tumor totalmente visualizado usando números indicados (

n

) de ratos após a coloração das células mitóticas (C). Nas experiências ortotópicos, as células estáveis ​​PC-3 foram deixadas a crescer nas próstatas de três semanas. Em seguida as células mitóticas (castanho) foram analisados ​​a partir das imagens de amostra (D), enquanto metástases (indicadas por setas) foram contadas a partir de nódulos linfáticos de drenagem da próstata e pulmões (E).

Uma vez que os xenoenxertos subcutâneos tinha não invadido no corpo, continuamos nossos estudos com um modelo de cancro da próstata ortotópico, onde era esperado que o microambiente do tumor a ser mais favorável para o crescimento metastático [24-26]. No primeiro conjunto de experiências-piloto, controle ou Pim-3-superexpressão células foram inoculadas em ortotopicamente as próstatas de ratos machos nus. O crescimento tumoral foi seguido durante um período de três semanas, após o que os animais foram sacrificados e os tumores juntamente com os órgãos seleccionados foram recolhidas. Neste estudo, não existem grandes diferenças nos volumes dos tumores foram detectados. No entanto, a análise de amostras de tecido embebidas em parafina não só revelou o potencial mais elevado mitótico das células PIM-3 que sobre-expressam, mas também a sua capacidade de invadir os pulmões (Figura 1D e 1E). Por contraste, o comportamento metastático mais suave das células de controlo falsamente transfectadas confirmou as nossas observações anteriores sobre a capacidade das células parentais PC-3 a invadir os nódulos linfáticos de drenagem da próstata, mas raramente para órgãos mais distantes [25-26].

inibição Pim é tolerado pela embriões de peixe-zebra e ratos adultos

os resultados promissores com invasiva Pim-3-superexpressão tumores ortotópicos nos levou a realizar um outro conjunto de experimentos, onde também testados os efeitos da inibição Pim pela pirrolocarbazole tetrac�lico DHPCC-9 [6] eo benzo tricíclicos [

cd

] azuleno BA-1a [17]. Para comparação, nós também estabelecida uma outra linha de células PC-3 que sobre-expressam estável humano PIM-1.

Antes da experimentação com animais, a eficácia e toxicidade dos inibidores de PIM-selectivos foram testados em ensaios baseados em células e

in vivo

. Ambos os inibidores eficientemente antagonizou os efeitos pró-migratórias de PIM-1 e PIM-3, e diminuição da migração de todas as linhas de células estáveis ​​a uma extensão similar (Figura S2). Dentro do período de seguimento de 24 horas de cura da ferida de ensaio, a viabilidade celular foi apenas ligeiramente afectada, enquanto que ambos os inibidores reduziu dramaticamente em todas as linhas de células por um ponto de tempo de 72 h mais tarde. Quando o

in vivo

segurança dos inibidores foi analisada com embriões de peixe-zebra dentro de seu ambiente aquático, tanto DHPCC-9 e BA-1a foram bem tolerados, enquanto nosso controle citotóxica composto BA-2c [17] levou à maciça problemas de desenvolvimento e morte (S3 figo e S1 tabela). No entanto, as caudas ligeiramente curvos e sacos pericárdica ampliadas foram observadas em embriões tratados com 10 uM DHPCC-9 (Fig S3), sugerindo que a actividade Pim adequada é necessária para o desenvolvimento embrionário normal. No entanto, estes dados não permitem conclusões fiáveis ​​sobre a segurança dos inibidores em organismos adultos.

testes de segurança adicionais foram então realizadas com ratos adultos. No entanto, com as altas concentrações necessárias para estes testes, única DHPCC-9 pode ser suspenso em DMSO, enquanto BA-1a era solúvel somente em N, N-dimetilacetamida (DMA).

Durante um de dez dias inicial período de seguimento, DHPCC-9 tratamentos (50 mg /kg) não causou grandes mudanças no comportamento do mouse, a área de injeção ou peso corporal (S4 Fig). Em contraste, os tratamentos à base de DMA (25 mg /kg) causou um comportamento ligeiramente agitados e diminuição do peso corporal. Além disso, o DMA parecia induzir a formação de tecido de cicatriz na área de injecção. Depois disso, testes de segurança foi mantida com pequenas quantidades de DMA (10-20 mg /kg), o que não causam quaisquer alterações visíveis na área de injeção, o comportamento do rato ou ganho de peso durante os 17 dias de follow-up (S4 Fig). Com base nestes resultados, a 50 mg /kg de DHPCC-9 em 20 ul de DMSO e 20 mg /kg de BA-1a em 10 ul de DMA foram decididas para ser usado diariamente para testar os seus efeitos sobre ortotópico próstata PIM-3 que sobre-expressam xenotransplantes.

inibição Pim reduz o crescimento metastático Pim-dependente de xenoenxertos de próstata ortotópicos

no segundo conjunto de experiências ortotópicos, PC-3 ou células transfectadas por simulação superexpressão de forma estável Pim-1 ou Pim -3 foram ortotopicamente inoculados nas próstatas de ratos machos nus. Os ratinhos com xenoenxertos de PIM-3 que sobre-expressam foram divididos aleatoriamente em 4 grupos e administrado com doses diárias dos inibidores ou volumes iguais de DMSO ou de DMA como controlos. Rato comportamento e ganho de peso foi seguido durante o experimento, mas sem grandes alterações relacionadas com o inibidor foram detectados (S5 Fig). Após o sacrifício, os tumores foram excisados ​​e os ratos sem tumores foram excluídos de análises (S2 tabela). Para confirmar a estabilidade das linhas de células,

ex vivo

varrimento foi realizado para detectar sinais de tomate em tumores (FIG) S6, enquanto imuno-histoquímica foi usado para visualizar as células de tumor xenoenxerto que expressam proteínas PIM a partir de construções de V5-marcados ( Fig S7).

Quando os volumes dos tumores foram calculados, Pim-sobre-expressam tumores foram novamente significativamente maior do que aqueles formados por células simuladamente transfectadas (Fig 2A e 2D). No entanto, os xenotransplantes Pim-1 não pode ser diretamente comparado com os outros, uma vez que ratinhos que transportam-los não tinha obtido qualquer tratamentos químicos. DHPCC-9 tratamento diminuiu significativamente o volume de tumores de PIM-3 que sobre-expressam, o que sugere que este composto tinha sido capaz de alcançar o tecido tumoral e inibir a actividade de PIM-3 lá (Figura 2B e 2D). Em contraste, a BA-1-A não mostrou qualquer eficácia em termos de redução do volume do tumor (Figura 2C e 2D). Aparentemente, este composto não tinha atingido o seu tecido alvo, como também sugerido pela presença de um precipitado amarelo em torno do local da injecção.

PC-3-derivados de células transfectadas de forma estável (Mock = C, Pim-1 = P1, PIM-3 = P3) foram inoculadas em ortotopicamente as próstatas de ratos pelados atímicos. Os ratinhos foram tratados diariamente com DMSO ou DMA (tratamentos de controlo) ou com inibidores de Pim (50 mg /kg de DHPCC9 em DMSO ou 20 mg /kg de BA-1a em DMA). Após três semanas de tratamento, os ratinhos foram sacrificados e os seus volumes de tumor foram medidos. Primeiro, os volumes foram comparados entre os números indicados (

N

) de ratinhos sem inibidor tratamentos (A). Em seguida, os volumes dos tumores derivados de animais tratados com inibidor foram comparados com os tumores de animais com tratamentos de controlo apropriado de DMSO (B) ou DMA (C). Antes de fixação do tumor, imagens representativas foram tomadas (D). Mais tarde em secções de tumor embebidas em parafina foram coradas com anticorpo anti-H3-fosfo histona para visualizar as células mitóticas (castanho). São mostrados os valores médios combinados de todas as seções totalmente fotografada tumorais de tecido de grupos de controle DHPCC-9-tratados e tratados com DMA DMSO ou, bem como imagens representativas de Pim-3-sobre-expressam tumores (E).

as taxas de mitose também foram medidos a partir de secções de tecido derivadas dos tumores ortotópicos. Enquanto nas experiências subcutâneas e no primeiro conjunto de experiências ortotópicos, havia células claramente mais mitóticas em tumores formados por PIM-3 que sobre-expressam as células, em comparação com células falsamente transfectadas (Fig 1C e 1D), no segundo conjunto ortotópico as diferenças eram menores (Figura 2E). No entanto, o tratamento com DHPCC-9 tinha diminuído o número de células mitóticas em Pim-3 xenotransplantes (Fig 2E).

Uma vez que a fluorescência tomate derivado não era forte o suficiente para revelar claramente as micrometástases (S6 FIG), análises histológicas foram realizadas com secções de tecido a partir de rins, baço, fígado, pulmões, bem como os nódulos linfáticos de drenagem da próstata. Após a coloração com hematoxilina e eosina, metástases foram procurados a partir de amostras de tecidos diferentes, mas especialmente a partir de gânglios linfáticos e pulmões. Curiosamente, enquanto que mais de metade da maioria dos PIM-1 ou PIM-3 xenoenxertos simuladamente transfectadas e tinha sido capaz de metástases nos nódulos linfáticos de drenagem da próstata, só as células que sobre-expressam PIM-tinham invadido, tanto quanto para os pulmões (Fig 3a- 3C, S3 Tabela). Ainda mais interessante, DHPCC-9 tratamento teve formação eficiente inibido de metástases em ambos os órgãos. Ambas as áreas metastáticas e necróticas foram medidos, mas não havia nenhuma ligação clara à atividade Pim (S6 Fig), sugerindo que uma vez que um tumor metastático é formado, as células tumorais podem adquirir outras propriedades, além de atividade Pim para suportar seu crescimento.

diferentes órgãos foram colhidos a partir de ratinhos com xenoenxertos de tumor da próstata ortotópico formados por células PC-3 que sobre-expressam de forma estável um vector vazio (C), PIM-1 (P1) ou PIM-3 (P3). secções de tecido embebidas em parafina foram coradas com hematoxilina e eosina e analisadas para a presença de metástases. Mostram-se imagens representativas (A) do nodo linfático e de secções de pulmão (células tumorais indicadas por setas). As propriedades metastáticas de xenoenxertos de ratinhos tratados com DHPCC-9, BA-1a ou os seus solventes foram também analisadas. São mostrados os percentuais de camundongos positivos tanto para metástases linfáticas (B) ou metástases pulmonares (C) em cada grupo.

Para visualizar a vasculatura dos tumores ortotópicos, vasos sanguíneos e linfáticos foram coradas. Depois de análises quantitativas, um aumento significativo foi detectado nas áreas de vasos sanguíneos por tumor nos xenoenxertos formadas pelas células PIM-sobre-expressam, em comparação com as células de controlo (Fig 4A). Um pouco menores diferenças foram detectados também nas áreas de vasos linfáticos (Figura 4B). No entanto, após o tratamento com o inibidor de Pim DHPCC-9, as zonas de ambos sangue, bem como vasos linfáticos foram diminuiu significativamente (Figura 4A-4D).

propriedades angiogénicas da próstata xenoenxertos ortotópicos (Mock = C, PIM-1 = P1, PIM-3 = P3) foram analisados ​​por coloração imuno-histoquímica de secções de tecido embebidas em parafina com anticorpos anti-CD34 (vasos sanguíneos) e anti-m-LYVE-1 (vasos linfáticos). São mostrados áreas médias de todo o sangue analisado (A) e vasos linfáticos (B), juntamente com imagens representativas (vasos em marrom) (CD) de secções de tecido do tumor totalmente trabalhada.

Pim-1 e Pim -3 melhorar a fosforilação e a superfície da célula expressão de CXCR4

A proteína do receptor de quimiocina CXCR4 foi anteriormente implicado na migração de células PC-3 e a interacção com as células endoteliais [20-23]. Além disso, em células hematopoiéticas PIM-1 tem sido demonstrado que fosforila CXCR4 em Ser339, e, assim, promover a expressão na superfície celular de CXCR4 e a sua interacção com o ligando de quimiocina CXCL12 [4]. Além disso, mostrámos previamente inibição Pim ou silenciamento para reduzir eficazmente a invasão de células de PC-3 em direcção meio condicionado MG-63 de células de osteossarcoma, onde o principal é quimioatractor CXCL12 [6, 23]. Para saber se Pim /CXCR4 interação desempenha um papel também no nosso modelo de xenoenxerto de cancro da próstata, que começou por avaliar se havia diferenças no estado de fosforilação de CXCR4 entre as nossas linhas celulares estáveis. Por transferência Western, observou-se um aumento acentuado nos níveis de CXCR4 Ser339 fosforilada em ambos os PIM-sobre-expressam linhas celulares estáveis ​​em comparação com a linha celular de controlo (Figura 5A). Além disso, uma diminuição nos níveis de CXCR4 fosforilados foi observado após o tratamento de células PC-3 parentais com o inibidor DHPCC Pim-9 (Fig 5B).

A fosforilação de CXCR4 em S339, bem como níveis Pim foram analisados ​​por western blotting no estábulo PIM-1 (P1), PIM-3 (P3) ou vector de controlo PC-3 (C) que sobre-expressam ou células da linha de células PC-3 parentais tratados com 0,1% de DMSO ou 10 ^ M DHPCC-9. São mostrados os resultados de uma experiência representativa com controlos de carga e os marcadores de peso molecular (kDa) (A-B). A capacidade dos membros da família Pim para fosforilar CXCR4

in vitro

foi analisada incubando marcado com GST Pim-1, PIM-2 (P2) ou Pim-3 (P3) proteínas com fragmentos marcado com GST (P1) de tipo selvagem (WT) ou Ser339 Ala (SA) CXCR4 mutante humana. CXCR4 fosforilado foi detectado por fosfo (Ser339) -CXCR4 anticorpo e carga de proteína por coloração de Ponceau S. São mostrados os resultados de uma experiência representativa (C). A localização e o sinal de intensidade de expressão global fosforilada contra CXCR4 foi analisada por imunofluorescência (IF) de coloração de células transfectadas de forma estável tratados com 0,1% de DMSO ou 10 ^ M DHPCC-9. A experiência foi controlada por amostras paralelas coradas apenas com o anticorpo secundário (-aB). Colorações foram repetidas duas vezes e pilhas de imagens foram obtidas por microscopia confocal de pelo menos 30 células por amostra de cada ensaio. São mostradas as intensidades de sinal de colorações fosfo-CXCR4 em comparação com os níveis globais de CXCR4, juntamente com imagens representativas de colorações CXCR4 (D-E) fosfo-CXCR4 e. A fosforilação e localização de CXCR4 também foi analisado por coloração imuno-histoquímica de secções de tecido embebidas em parafina a partir de tumores de próstata orthopic. É mostrado o aumento relativo da quantidade de células fosfo-CXCR4-positivos em comparação com a expressão de CXCR4 em geral medidos por varrimento de todo tumor. PBS em vez do anticorpo primário foi usado como controlo negativo. Imagens representativas foram levados para visualizar as diferenças na fosfo-CXCR4 (marrom escuro) colorações (F).

Uma vez que a sobre-expressão estável de ambos os Pim-1 ou Pim-3 fosforilação CXCR4 claramente reforçada, queríamos comparar o

in vitro

actividades dos três membros da família Pim no sentido CXCR4. Portanto, incubadas Pim proteínas marcadas com GST em conjunto com o C-terminal de 46 aa fragmentos GST-tag de CXCR4 (WT) ou da sua forma mutante S339A (SA), em que o resíduo serina tinha sido substituído por um resíduo de alanina. Quando o

in vitro

fragmentos fosforilados foram detectados com o anti-fosfo (Ser339) -CXCR4 anticorpo, tornou-se evidente que tanto Pim-1 e Pim-3, mas não Pim-2 pode fosforilar CXCR4 em Ser339 ( Figura 5C). Diferenças semelhantes também foram detectados em células PC-3, após sobre-expressão transitória Pim, ao passo que o inibidor de Pim DHPCC-9 eficientemente inibida fosforilação CXCR4 lá (Fig S8).

Em seguida realizou-se colorações de imunof luorescência para visualizar a localização de CXCR4 proteínas nas linhas de células PC-3 estável que tinham sido tratadas durante 24 h com DMSO ou DHPCC-9. Enquanto CXCR4 foi expressa ubiquamente, a sua forma fosforilada reconhecido pelo anticorpo anti-fosfo (Ser339) -CXCR4 anticorpo exibido expressão mais associada a membrana, em amostras tratadas com DMSO, mas sim dispersa e mais fraca expressão citoplasmática em amostras tratadas DHPCC-9 (Figura 5D e 5E). Embora ambos Pim-1 e Pim-3 aperfeiçoado os sinais de fosfo-CXCR4, em comparação com os níveis globais de CXCR4, a inibição Pim eficiente reduziu-los, resultando também na expressão nuclear ligeiramente mais forte do CXCR4 (Fig 5D e 5E).

para analisar o papel da CXCR4 fosforilação no nosso

In vivo

experimentos, utilizamos a imunohistoquímica para medir as quantidades relativas de células tumorais da próstata ortotópicos positivos para CXCR4 fosforilada. A comparação dos sinais de fosfo-CXCR4 para os sinais médios CXCR4 em cada tumor revelou que ambos PIM-1 e PIM-3 tinha aumentado significativamente as quantidades relativas de fosfo-CXCR4, enquanto que a inibição Pim por DHPCC-9 tinha diminuído ainda abaixo do nível observado nas amostras simuladamente transfectadas (Figura 5F). Ao todo, tanto o

in vitro

e

in vivo

dados sugerem que os tumores com superexpressão Pim-1 ou Pim-3 pode aproveitar a /via quimiocinas CXCR4 CXCL12 a se espalhar para outros órgãos, como os pulmões.

Discussão

Aqui nós mostramos que as células PC-3 de cancro da próstata superexpressão quer Pim-1 ou Pim-3 cinases formar tumores de xenoenxerto maiores do que as células parentais PC-3. Estes resultados estão bem em linha com as observações anteriores sobre a capacidade de Pim-1 e Pim-2 para aumentar o crescimento de PC-3 xenotransplantes derivados de células subcutâneas de câncer de próstata [18], enquanto aqui demonstramos que Pim-3 também é igualmente eficaz . Mais Curiosamente, quando ortotopicamente inoculada em próstatas de rato, as células que sobre-expressam um ou PIM-PIM-3 têm uma maior capacidade de metastizar das tumores baseada próstata para outros órgãos tais como os pulmões. Além disso, um dos compostos de PIM-inibidores testados, DHPCC-9, é capaz de diminuir o crescimento do tumor PIM-dependente, bem como a formação de metástases, sem efeitos colaterais graves, sugerindo que é capaz de penetrar nas células tumorais para inactivar quinases Pim lá.

Embora tenhamos mostrado que quinases Pim são capazes de promover a motilidade das células de câncer de próstata [6], o presente estudo é o primeiro a demonstrar efeitos semelhantes também sob

in vivo

condições . Isto é de interesse, uma vez que as células PC-3 ortotopicamente anteriormente inoculados foram mostrados para migrar a partir da próstata e para os sacrais ilíacas nódulos linfáticos de drenagem da próstata locais, mas raramente em qualquer outro lugar [24-26]. Estes resultados foram confirmados nos nossos estudos, onde o crescimento metastático foi observada nos nodos linfáticos de drenagem da próstata da maioria dos ratinhos portadores de tumores. No entanto, apenas os xenotransplantes Pim-sobre-expressam foram capazes de metástase para os pulmões, enquanto não foram detectadas metástases em outros tecidos recolhidos.

Para abordar os mecanismos tumorigênicos impulsionado por quinases Pim e oposição pela inibição Pim, amostras de tecido de os tumores de xenoenxerto primários foram analisados ​​por imuno-histoquímica para os marcadores de actividade mitótica, angiogenicity e invasividade. aumentos PIM-dependentes foram observadas ligeiras na proporção de células mitóticas e nas áreas de vasos linfáticos, enquanto que a regulação positiva mais significativa foi detectada na formação de vasculatura tumoral e na expressão e fosforilação da superfície celular de CXCR4. Por outro lado, todos estes parâmetros foram fortemente diminuída pelo inibidor selectivo PIM-DHPCC-9. Assim, estas observações podem explicar não só o crescimento aumentada de tumores que sobre-expressam cinases pim, mas também as suas propriedades metastáticas.

O /via de quimiocina CXCR4 CXCL12 é essencial para o tráfico de linfócitos e especialmente para homing de células estaminais hematopoiéticas para o medula óssea [19, 27]. Além disso, a quimiocina CXCL12 é constitutivamente expressa em vários outros órgãos, incluindo nódulos linfáticos e pulmões e pode, assim, não apenas atraem as células hematopoiéticas, mas também a migração de células de cancro que exibem muitas vezes os níveis elevados de expressão do receptor de CXCR4 nas suas superfícies celulares. Além disso, o CXCR4 pode suportar a sobrevivência do tumor e.g. através da promoção da vascularização do tumor.

PIM-1 sobre-expressão tem sido associada com a expressão de superfície celular regulada positivamente de CXCR4 em malignidades hematopoiéticas tais como leucemia mielóide aguda [4], linfoma difuso de grandes células B [28] e leucemia linfocítica crónica [29]. A cauda intracelular de CXCR4 pode ser fosforilada

in vitro Restaurant at Ser339 por Pim-1 quinase [4] e por Pim-3, como mostrado aqui, mas não por Pim-2. Curiosamente, Ser339 está entre os vários resíduos de serina-alvo por receptores de G-proteína quinases (GRKs), resultando em endocitose do receptor [30]. Em contraste, a fosforilação dependente de PIM-CXCR4 foi relatado de conduzir a um aumento externalização do receptor, permitindo que as células que migram em direcção a um gradiente de CXCL12 [4]. Em células PC-3, CXCR4 níveis de superfície são relativamente baixas, a menos que as células são tratadas com o ligando de CXCL12, o que também aumenta claramente as propriedades invasivas de estas células [20-23]. Assim, enquanto os estudos adicionais sobre os efeitos das cinases do PIM CXCR4 em células PC-3 cultivadas na ausência ou na presença de CXCL12 seria de interesse, pode-se já especular que a interacção PIM-CXCR4 ajudou nossas células tumorais ortotópicos PIM-overexpressing para formar metástases para os nódulos linfáticos de drenagem da próstata e dos pulmões, ao passo que o microambiente do tumor em torno dos tumores subcutâneos pode não ter sido suficiente permissiva para promover a invasão.

uma vez que a CXCL12 /CXCR4 via é um alvo terapêutico atractivo , vários compostos de moléculas pequenas têm sido desenvolvidos que ou bloquear a interacção da quimioquina ao seu receptor ou inibir a sinalização a jusante a partir do receptor [19, 27]. resultados promissores já foram obtidos a partir de ensaios clínicos que visam aumentar a quimio-sensibilidade de malignidades hematopoiéticas, mas inibidores CXCL12 /CXCR4 também pode ajudar a reduzir o potencial metastático de tumores sólidos. Um problema com estes inibidores é que eles induzem uma supra-regulação de contra-regulação dos receptores CXCR4 na superfície celular, resultando em respostas única de curta duração. Por isso, pode ser mais eficiente para bloquear externalização do receptor CXCR4 por inibidores de Pim-seletivas que também podem ter menos efeitos secundários prejudiciais.

Aqui nós mostramos preliminar

in vivo

segurança e eficácia de dados por um inibidor de Pim-seletiva, o pirrolocarbazole DHPCC-9, enquanto que o benzo [

cd

] azuleno BA-1a acabou por ser muito insolúvel. DHPCC-9 não apresentaram quaisquer efeitos citotóxicos em ratos, apesar de algumas malformações foram detectados nos embriões de peixe-zebra em início de carreira. Estes resultados sugerem que pelo menos uma inibição de curto prazo da actividade de PIM podem ser bem tolerada em organismos adultos e que pode mesmo ser possível utilizar doses mais elevadas deste inibidor para ampliar os efeitos observados. Pode também ser vantajoso combinar inibição Pim com outros tratamentos que afectam a sobrevivência celular ou a motilidade.

Dados de experiências de cura de feridas baseados em células indicam que DHPCC-9 é capaz de bloquear a motilidade de PC-3 de cancro da próstata células [ ,,,0],6]. Como mostrado, também neste estudo, isto não é simplesmente devido à proliferação diminuída, uma vez que a viabilidade celular não foi substancialmente reduzido durante o período de acompanhamento de 24 horas de recuperação de feridas.