Abstract

Fundo

Após diagnóstico de câncer, a terapia para o paciente é em grande parte dependente da origem do tumor, em especial quando um tumor metastático está a ser tratada. No entanto, casos tais como metástases atípico, os tumores pouco diferenciados, ou mesmo um número limitado de células de tumor pode levar a desafios na identificação da origem. Além disso, cerca de 3% a 5% do total de doentes de tumor sólido não terá que ter a sua origem tumoral identificado durante a sua vida. O Theros CancerTYPE ID® é projetado para identificar a origem do tumor com um objetivo, processo rápido e padronizado.

Metodologia e principais conclusões

Este é um estudo retrospectivo cego para avaliar o desempenho do Theros CancerTYPE ID® na população chinesa. No total, 184 (FFPE) amostras embebidos em parafina fixadas em formalina de 23 origens de tumor foram coletados do banco de tecidos de Fudan University Shanghai Cancer Center (FDUSCC). Um processo de enriquecimento de células tumorais padrão foi utilizado, e os resultados foram comparados com predição diagnóstico de referência, o que foi confirmado por dois patologistas experientes no FDUSCC. Todas as 184 amostras foram analisadas com sucesso, e não há amostras de tumor foram excluídos devido a problemas de qualidade da amostra. No total, 151 amostras foram previu corretamente. A taxa de concordância foi de 82,1%. Um teste de Qui-quadrado de Pearson mostra que não há diferença entre este estudo e o teste de avaliação anterior realizado por bioTheranostics Inc. Nenhuma diminuição estatisticamente significativa foi observada em qualquer grupo ou metástase de tumores com altos graus.

Conclusões

foi obtido um resultado comparável com o trabalho anterior. Especificamente, as amostras com uma pontuação elevada probabilidade ( 0,85) tem uma grande chance (índice de concordância = 95%) de ser previu corretamente. Não foi observada diferença de desempenho entre as amostras primários e metastáticos, e não foi observada diferença entre os três tipos de tumores. A utilização de captura a laser micro-dissecção (LCM) faz com que o Theros CancerTYPE ID® acessível a quase todos os doentes oncológicos com diferentes status de tumor

Citation:. Wu F, Huang D, Wang L, Xu Q, Liu F, Ye X, et al. (2012) 92-Gene Profiling Molecular na Identificação de Câncer de Origem: um estudo retrospectivo na população chinesa e desempenho dentro de diferentes subgrupos. PLoS ONE 7 (6): e39320. doi: 10.1371 /journal.pone.0039320

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 17 Janeiro, 2012; Aceito: 23 de maio de 2012; Publicação: 22 de junho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores têm a seguinte participação: FW, QX, FL, XY e XM são os empregados da empresa bioMérieux. Theros CancerTYPE ID é comercializado pela bioMérieux. Não existem patentes ou outros produtos em desenvolvimento a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

Aproximadamente 10% a 15% de câncer pacientes são definidos como pacientes com câncer metastático quando diagnosticada pela primeira vez [1]. Informações sobre a origem do tumor é importante em decisões de tratamento. O diagnóstico preciso do local primário permite aos clínicos para determinar o estágio do câncer; cirurgia pode ser aplicado, em alguns casos, e mais radioterapia e quimioterapia ou terapia específica do local também pode ser benéfica para os pacientes. Um estudo retrospectivo de 879 doentes apresentaram um aumento no tempo de sobrevivência em pacientes para os quais o principal local foi [2] identificado. No entanto, a metástase atípico ou tumores pouco diferenciados podem apresentar desafios na identificação da origem do tumor

.

Aumento esforços têm sido feitos para rastrear a origem de um tumor usando diferentes habilidades e tecnologias. Em alguns casos, um patologista experiente vai saber a resposta examinando hematoxilina e manchado de eosina (H E) slides. A imuno-histoquímica (IHQ) é um teste de rotina no departamento de patologia e, por vezes, fornecer informações úteis ao nível da proteína.

No entanto, mesmo com um painel de expansão de anticorpos, ainda não é possível obter uma conclusão convincente com IHC de forma independente, e o diagnóstico pode ser mais difícil de tumores de grau elevado. Uma meta-análise de quatro estudos mostraram que IHC identificou corretamente a origem do tumor de 66% das amostras [3]. Alguns testes de DNA, incluindo a perda de heterozigosidade análise (LOH), análise de microssatélites e análise de mutações de oncogene, pode ser utilizado para mostrar a origem clonal de uma malignidade. Com a evolução dos critérios de diagnóstico, ferramentas e tecnologia, a maior parte das lesões de cancro primário pode, finalmente, ser identificados após uma série de procedimentos demorados. No entanto, cerca de 3% a 5% do total de doentes de tumor sólido não irá ser capaz de ter a sua origem tumoral diagnosticada com precisão antes do início do tratamento ou mesmo durante a sua vida [4], [5].

Recentemente, diferente molecular análises de definição do perfil de expressão de ARNm ou miARN foram desenvolvidos para identificar o local primário [6], [7], [8], [9], utilizando microarrays ou em tempo real tecnologia de PCR. Vários mRNAs críticos ou miARNs foram perfilado no local metastática de tumores, e os resultados indicaram a possível sítio primário. resultados de validação para estes ensaios moleculares foram publicados, e as taxas de sucesso foram de aproximadamente 75,6% a 89%.

O Theros CancerTYPE ID® é um ensaio baseado em PCR em tempo real que pode ser usada para identificar a origem de cancro metastático e determinar o tipo patológico de um tumor sólido. Um total de 92 genes, incluindo 5 de referência e 87 genes específicos do tumor, foram detectados em amostras FFPE de slides.

A 1

Versão st de Theros CancerTYPE ID® foi projetado e testado em 2006 [6 ]. Um total de 578 amostras de tumor foram escolhidos para desenvolver uma base de dados global. A pontuação possibilidade foi dada após o teste como uma medida de quão semelhante a amostra testada foi a 32 origem do tumor e subtipos histológicos na base de dados de referência. resultados de validação mostrou uma taxa de sucesso de 87% na classificação dos 32 tipos de tumores e dentro de 119 amostras FFPE. Além disso validação foi demonstrada na identificação de espécimes de 20 pacientes reais CUP pelo menos 2 meses mais cedo do que o seu reconhecimento primária latente, ea maioria destes espécimes eram de tumores pouco diferenciados. Este estudo mostrou que 15 das 20 amostras foram classificadas com precisão e correspondia aos sítios primários latentes posteriormente identificados [10].

Theros CancerTYPE ID® (versão 2) foi posteriormente desenvolvido. A base de dados de referência do tumor foi expandido para 2,206 amostras, e o algoritmo associado foi modificado para permitir a previsão dos 30 tipos de tumores principais e 54 subtipos histológicos. Mais importante ainda, um método de enriquecimento de tumor, captura de laser de micro-dissecção (LCM), foi utilizado. Esta adição torna a tecnologia aplicável quando as células tumorais limitados estão disponíveis. Em um conjunto de teste separada de 187 amostras tumorais FFPE representando 28 dos 30 tipos de câncer principais, Theros CancerTYPE ID® (versão 2) mostrou uma sensibilidade geral de 83% [11].

Neste estudo, pretendemos para avaliar o desempenho do Theros CancerTYPE ID® (versão 2) na população chinesa. Foi realizado um estudo retrospectivo cego no qual foram selecionados 184 amostras FFPE de FDUSCC, PCR em tempo real foi realizada em Xangai, e os dados brutos gerados foram analisados ​​por bioTheranostics em San Diego. Os resultados de previsão foram gerados por bioTheranostics. O desempenho do ensaio dentro de vários subgrupos, incluindo diferentes tecnologias e características do tumor, foi comparado.

Materiais e Métodos

Design Estudo

Este é um estudo retrospectivo cego para avaliar o desempenho do Theros CancerTYPE ID® na população chinesa. amostras FFPE de 23 origens tumorais foram selecionados a partir FDUSCC. A história clínica e H E lâminas foram confirmadas por pelo menos 2 patologistas experientes. As células tumorais foram dissecados a partir de lâminas FFPE por raspagem ou LCM. Após a digestão com proteinase K durante a noite, um protocolo padrão foi aplicado para isolar e RNA transcrição reversa. Um tempo real Taqman painel de PCR 92-gene foi então utilizado para cada amostra. Os dados de PCR foram gerados e enviados para o laboratório pelo CLIA bioTheranostics Inc. para análise. Os dados foram gerados usando um método previamente descrito sem saber qualquer informação clínica, com exceção de sexo e localização órgão em que foram obtidos os tecidos [6], [11].

Um total de 184 amostras de 23 foram seleccionados tipos principais de tumor para este estudo, e estas amostras são descritas na Tabela 1. estas amostras foram separados em 2 grupos para análise de acordo com a dificuldade de avaliação clínica e prática: 139 amostras de 17 tipos de tumores foram classificados em grupos, em que o foram identificados sítio primário (n = 102, 73,4%) e local de metástase (n = 37, 26,6%). Os restantes 45 amostras de 6 tipos de tumores, incluindo sarcoma, neuroendócrino, mesotelioma, pele, melanoma e cancro do linfoma, poderia surgir em muitas partes do corpo ou em vários órgãos; Por conseguinte, não é fácil determinar com exactidão o local primário ou origem do tumor. Por exemplo, o linfoma pode ser encontrada em ambos os lados do diafragma, quando diagnosticado, e a origem exacta não pôde ser determinada. Além disso, estes 6 tipos de tumores não estão no relatório da Theros CancerTYPE ID®. Nós decidimos comparar estes 45 amostras separadamente para os seus tumores primários e metastáticos. As características clínicas dos pacientes são ilustradas na Tabela 2.

Pacientes e Tumor amostras

Um total de 184 amostras de tumor foram obtidos a partir do banco de tecidos de FDUSCC. tipos de tumores que não estavam na lista de diagnóstico Theros CancerTYPE ID® não foram incluídos, e bloqueia FFPE antes de 2008 também não foram incluídos neste estudo. Os diagnósticos foram feitos com base na necessária revisão histórico médico, exame físico, exames de imagem e workup patológica completa, incluindo H E coloração. Todos os casos foram revistos e diagnosticada por pelo menos dois patologistas.

Para cada amostra, um mínimo de 300 células tumorais deve ser obtida após dissecção. Não há outros critérios de inclusão especiais, tais como o peso, a representação do tumor e taxa de necrose mínima, foram necessárias devido à tecnologia dissecção usado.

FFPE Slides e células tumorais Enriquecimento

As amostras foram embebidos em parafina com um protocolo e FFPE padrão armazenados no banco de tecidos de FDUSCC. A H E desliza para cada bloco de tumor foram examinadas para confirmar a existência de células tumorais. As amostras com uma área de tumor grande e células tumorais alta conteúdo sem necrose estão preparados para dissecção manual. Outras amostras, com grandes áreas interferentes, tais como as células normais, as áreas necróticas, fibrócitos, e infiltrações de linfócitos, ou com a representação do tumor baixa e várias células tumorais discretas sob o microscópio foram marcadas durante LCM [12]. blocos FFPE foram preparados para cada tratamento como três lâminas não coradas 10 mícrons de vidro (para raspar) ou slides de membrana (por LCM) e um H corrediça E-manchada. A continuação do tratamento incluiu desparafinização, circulando a área do tumor (apenas para raspar) ou coloração (apenas para LCM) e proteinase K digestão durante a noite.

No total, as células tumorais de 127 espécimes foram dissecados por LCM, e os restantes 57 amostras foram raspadas.

extração de RNA e de pré-amplificação

Depois de proteinase K (Life Technologies, Inc.) tratamento durante a noite (16-20 horas), a extracção de RNA foi realizada com um Extração de RNA Zymo Kit (investigação Zymo) de acordo com o protocolo recomendado. Em seguida, 10 ul de RNA purificado foi tratado por DNAse (Life Technologies, Inc.) para eliminar a contaminação de ADN do genoma no processo de PCR. Após transcrição reversa por iniciadores hexâmeros aleatórios poli-T e, uma etapa de pré-amplificação foi realizada com um kit ABI pré-AMP (Life Technologies, Inc.).

TaqMan PCR Ensaio

Theros CancerTYPE ID® (versão 2) é um ensaio de PCR em tempo real baseada em Taqman que detecta o nível de expressão de genes 92 e 30 distingue tipos de tumores. Dentro desses 92 genes, 5 genes de referência com expressão estável em todo o amplo espectro de tecidos são usados ​​para escalar e QC. Os restantes 87 genes foram expressos em vários tumores. Aproximadamente 80% destes genes têm anotação funcional, incluindo factores de transcrição de ligação a DNA, as proteínas da membrana celular e vários marcadores tumorais bem caracterizados [6].

O ensaio foi processado com pré-fabricadas ABI 384 placas. Quatro amostras foram aplicadas a cada placa 384. Para controlar a qualidade de experiências, um controlo negativo e um controlo positivo são utilizados com cada conjunto de experiências. O controlo negativo substitui a amostra real com H

2O, e o controlo positivo é um ARN humano universal adquirido à Stratagene, Inc. pares de iniciadores e sondas MGB Taqman foram concebidos para produzir um fragmento amplificado de menos de 80 pb e sintetizados por Sangon Biotech (Shanghai). A alíquotas de amostras pré-amplificado foi realizada num volume de 10 ul numa placa pré-fabricada 384. As amplificações foram realizadas com um sistema ABI 7900HT RT-PCR com as seguintes condições: 50 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 10 minutos, e 45 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos e 60 ° C durante 1 minuto. Os dados brutos foram gerados com as configurações padrão.

Análise de Dados

Os dados brutos foram identificados com local da biópsia e sexo e enviado para bioTheranostics, Inc., sem qualquer outra informação clínica. Com o algoritmo KNN (K vizinho mais próximo), os perfis de expressão as amostras foram comparadas com uma base de dados pré-estabelecida. Um relatório padrão foi gerado para cada amostra e enviado de volta. O relatório incluiu um resultado de previsão com uma pontuação de probabilidade indicando a similaridade das amostras testadas para os dados de perfis na base de dados. Os relatórios padrão e diagnóstico clínico foram comparados para calcular a taxa acordo. Estatísticas entre vários subgrupos, como alta e baixa qualidade RNA, LCM e raspagem, site principal e site de metástase, bem e pobre diferenciação, também foram descritos para demonstrar o desempenho do Thero CancerTYPE ID®. O desempenho do Thero CancerTYPE ID® Versão 1 e Versão 2 também foi comparado e descritos.

Resultados

Performance do ensaio

As 184 amostras foram compostas por 23 tipos de câncer dentro do Theros CancerTYPE ID® lista de trabalho. Calculou-se a taxa de concordância entre o diagnóstico de referência e resultados de previsão Theros CancerTYPE ID® (Tabela 3). Uma taxa de concordância de 82,1% (151/184) foi conseguida para todas as amostras. Além disso, as amostras de adrenal, mama, células germinativas, GIST, intestinal, fígado, linfoma, câncer de próstata e de tireóide foram 100% corretamente classificados. Os espécimes de neuroendócrino, rim, pulmão, pele, vesícula biliar, melanoma e câncer de bexiga urinária mostrou uma taxa de concordância superior a 80%. Para cada tipo de câncer, foram calculadas a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) com as seguintes fórmulas:

Sensibilidade: a capacidade de prever verdadeiros positivos = true positivos /total de positivos observados

Especificidade:.. a capacidade de prever verdadeiros negativos = verdadeiros negativos /total de negativos observados

PPV: fração de verdadeiros positivos entre os aspectos positivos preditivos = verdadeiros positivos /número total do previsto positivos

NPV:.. fração de verdadeiros negativos entre os negativos preditivos = verdadeiros negativos /número total de negativos previstos

Média de Referência Gene Ct (ARG Ct) Valor e do Índice de Probabilidade

neste estudo, o RNA foi extraído de FFPE desliza por qualquer raspagem ou LCM. Estes métodos geralmente resultam na quantidade de ARN desfavorável e integridade. Por causa da escassez de estas amostras, não se verificar a qualidade de ARN depois de ter sido extraída. Depois de PCR em tempo real é executada, o valor de Ct média de 5 genes de referência é usado como uma indicação da qualidade do ARN. quantidade de ARN ou de baixa integridade vai levar a uma maior Ct, indicando uma condição de não-óptima dos materiais de ARN.

184 Estas amostras testadas ter uma ampla gama de valores de Ct de genes médio de referência, 21,7-36,3 (Figura 1). O teste de Kolmogorov-Smirnov mostrou que estes valores Ct foram ARG normalmente distribuído (

P

= 0,2). A média ea mediana foram 27,34 e 27,36, respectivamente. Um total de 29 amostras apresentaram valores Ct ARG dentro do intervalo de 21,7 a 25, e 26 deles foram correctamente previsto (89,7%). Para a gama de 25 a 30, 107 de 132 (81,1%) amostras foram previu correctamente. Para as amostras que têm uma maior ARG Ct ( 30), 18 de 23 amostras (78,3%) foram previu corretamente. Um teste de Pearson Chi-quadrado não mostrou diferença significativa entre os 3 grupos (

P

= 0,484).

Um histograma do número de amostras em comparação com genes de referência médios valor Ct mostra uma distribuição normal. É possivelmente devido à natureza da qualidade da amostra (quantidade e integridade) da LCM. Também esta distribuição normal suporta ponto de vista que o valor ARG Ct é um bom indicador para a qualidade da amostra.

A pontuação de probabilidade é um indicador da segurança classificação. Em nosso teste, a pontuação variou ,28-,96 (Figura 2). No total, 121 de 184 amostras (65,8%) apresentaram uma probabilidade pontuação superior a 0,85, entre os quais apenas a origem do tumor de 6 amostras foram classificadas erroneamente. A taxa de concordância foi de 95% (115/121). Os 63 espécimes restantes tiveram uma probabilidade pontuação inferior a 0,85, entre os quais 27 amostras foram classificadas erroneamente. A taxa de concordância é muito mais baixa (57,1%, 36/63).

Um histograma do número de amostras em comparação com pontuação de probabilidade mostra uma distribuição altamente tendenciosa. A maioria das amostras testadas têm uma probabilidade maior pontuação de 0,85 e tem uma taxa muito elevada concordância (95%).

A pontuação de probabilidade para todas as amostras têm uma correlação próxima de 0 (-0,003 ) com o valor Ct ARG. Um teste t mostrou nenhuma diferença no valor ARG Ct entre o grupo corretamente classificados e classificados erroneamente (

P

= 0,953). No entanto, a pontuação de probabilidade mostra uma diferença significativa entre os grupos corretos e incorretos (

P

= 1.794E-7).

Comparação de desempenho da Primária e Metástase site

Tal como anteriormente descrito, exceto para os tipos 6 tumorais (pele, sarcoma, melanoma, mesotelioma, neuroendócrino, e linfoma), 139 amostras foram representadas por 17 tipos de tumores. Destes, 102 (73,4%) eram do tumor primário e as metástases eram 37 (26,6%). A precisão da classificação para o site e metástase local primário foi de 86,3% (n = 102) e 73,0% (n = 37), respectivamente.

Para o grupo de metástases, foi avaliado o local da biópsia eo resultado previsão. Duas amostras dividiu o mesmo rótulo tipo de tumor. Ambas as amostras foram tumores gastro esofágico metástase para o ovário e foram previstos como câncer de ovário. Além disso, as células tumorais para ambos os espécimes foram isolados por LCM. Este erro de classificação poderia ser causada por erros técnicos em LCM. Após a remoção dos 2 amostras, a taxa de concordância do grupo de metástases foi de 77,1%.

Na prática clínica, muitos cânceres primários desconhecidos foram primeiramente identificadas nos gânglios linfáticos. Na maioria destes casos, havia células tumorais limitados e elevada contaminação a partir de linfócitos. Em nosso conjunto de dados, 19 amostras de tumor foram obtidas a partir de gânglios linfáticos. A precisão global foi de 68,4% (n = 19).

De acordo com o teste exato de Fisher, o desempenho do sítio primário, local de metástase e amostras de metástases em linfonodos não foi significativamente diferente (86,3%, 73,0% e 68,4% ;

P

= 0,060)

um teste ANOVA one-way no gene médio de referência valores de Ct e pontuações de probabilidade, não houve diferença significativa entre o local primário, metástase e grupos de metástases em linfonodos (ARG Ct.

P

= 0,726;. pontuação de probabilidade

P

= 0,996)

Comparação de desempenho da LCM e raspando

No total, 127 dos 184 espécimes foram dissecados por LCM para enriquecer as células tumorais nas secções, e os restantes 57 amostras foram raspadas. A taxa de concordância é de 91,2% (52/57) para o grupo de raspagem e 78,0% (99/127) para o grupo LCM, e esta diminuição no grupo LCM é estatisticamente significativa (

P

= 0,03).

Além disso, o valor ARG Ct do grupo LCM diminuiu significativamente por 2,48 (t-test

P

= 3.75E-11), em comparação com o grupo de raspagem (diferença média). Em geral, as amostras de LCM tem uma pontuação de 0,05 menor probabilidade do que as amostras raspar, e esta diferença também estatisticamente significativa (t-test

P

= 0,045).

grau do tumor e Performance do ensaio

dentro das 184 amostras, 90 têm informações grau do tumor (48,9%, 90/184) em seus relatórios patológicos. No total, 12 foram bem diferenciados (de baixo grau ou grau I), 28 foram moderadamente diferenciado (grau intermédio ou grau II) e 50 eram pouco diferenciado ou indiferenciado (de alto grau ou grau III).

A taxa de concordância é de 83,3% (10/12) no grupo de grau I, 75% (21/28) para o grau II e 76% (38/50) de grau III (Tabela 4). No entanto, as diferenças de desempenho não são estatisticamente significativas (teste exato de Fisher

P

= 0,884). O teste ANOVA mostrou também que tanto a pontuação de probabilidade eo valor ARG Ct não foram significativamente diferentes entre os três grupos (

P

= 0,298 para ARG Ct;

P

= 0,096 para a pontuação de probabilidade) .

Comparação de desempenho com o estudo prévio

Em um estudo anterior por Ma et al., o ensaio Theros CancerTYPE ID® (versão 1) foi avaliada testando 119 amostras tumorais FFPE. A precisão global foi de 82% no prazo de 32 tipos de tumores de 26 origens tumorais.

Em comparação com Thero CancerTYPE ID® (versão 1), Thero CancerTYPE ID® (versão 2) foi desenvolvido mais tarde. A base de dados de referência do tumor foi expandido para 2,206 amostras, e o algoritmo associado foi ajustado para permitir a previsão de uma lista actualizada de 30 tipos de tumores principais e 54 subtipos histológicos. No conjunto de teste de 187 amostras tumorais FFPE representando 28 dos 30 tipos de câncer principais, o Thero CancerTYPE ID® (versão 2) mostrou uma sensibilidade geral de 83% na validação anterior em uma população americana [11].

a fim de comparar o desempenho do conjunto de teste anterior de Ma et al., com os nossos dados gerados pelo ensaio Theros CancerTYPE ID® (versão 2), os tipos de tumor anteriores da ID CancerTYPE (versão 1) foram ajustados para se obter um tumor comparável tipo lista. Alguns subtipos de tumor da mesma origem, tais como carcinoma do pulmão de células pequenas, escamosas do pulmão, de células grandes do pulmão e adenocarcinoma, foram combinados juntos. Enquanto alguns outros tipos de tumores que não tinham sido testadas, tais como tumores do cérebro e meningioma, foram removidos. Finalmente, obteve-se uma lista de 18 tipos de tumor testados principais comuns para ambos os estudos. Além disso, o desempenho do ensaio foi comparado como ilustrado na Tabela 5.

A fim de comparar o desempenho geral do Thero CancerTYPE ID® (versão 2) realizado em população americana com o nosso estudo na população chinesa, 5 principais tipos de tumores que não foram testados neste estudo foram removidos para obter um comparáveis ​​23 tipos de tumores em 171 amostras.

a taxa acordo global é de 84,8% (89/105) para o primeiro conjunto de teste de Thero CancerTYPE ID ® (versão 1) e 84,6% (121/143) em nosso estudo. Um teste de Pearson Chi-quadrado mostra nenhuma diferença significativa (

P

= 0,975). (Tabela 5).

A comparação entre o conjunto de teste de 187 amostras e esse estudo mostrou uma taxa de concordância de 83,6% (143/171) versus 82,1% (151/184). Nenhuma diferença significativa foi encontrada (

P

= 0,697). (Tabela 6).

Discussão

Para determinar a origem de um tumor, os médicos devem rever a história médica, realizar exame físico cuidadoso, executar tipos diferentes de endoscopias e utilizar vários imaging dispositivos, como mamografia, tomografia, ressonância magnética ou PET. IHC também é um padrão atual de tratamento no diagnóstico do tumor. No entanto, mesmo com um painel de crescimento de anticorpos, a taxa de sucesso de determinação da origem do tumor não é totalmente satisfatória. A meta-análise mostrou que uma extensa propedêutica IHC identificou corretamente o local primário para 66% de todos os espécimes metastáticos [3]. A expressão de genes de perfis tem sido utilizado para a classificação do tumor em diversos estudos [6] – [9], [13]. No entanto, na prática clínica, os médicos vão encontrar todos os tipos de amostras de tumores, a partir do nó de linfa metástase para câncer primário, a partir de biópsia por agulha fina para ressecção de cirurgia, de bem diferenciado de tumores pouco diferenciados e com uma variedade de quantidade e integridade do RNA. Um ensaio de perfil molecular que pode ser aplicado a todos os tipos de amostras é necessária. Além disso, devido à complexidade e natureza quantitativa de tal tecnologia, um processo passo a inclusão de amostras e tratamento de amostra padrão deve ser aplicada para obter um resultado desempenho comparável e reproduzível.

Neste estudo, nós avaliamos o desempenho de o Theros CancerTYPE ID®, um PCR em tempo real baseada em 92-expressão de ARNm de gene painel de perfis, com 184 espécimes de tecidos FFPE de pacientes chineses. Este estudo é realizado de forma cega e independente em um laboratório externo, bioTheranostics Inc., utilizando amostras armazenadas no banco de tecidos de FDUSCC. Este estudo demonstrou que o ensaio CTID poderia ser cuidadosamente realizada fora do laboratório CLIA nos Estados Unidos, com diferentes amostras colhidas de população chinesa e mostrar um desempenho comparável. Além disso, nós também tentou explorar o efeito de vários subgrupos da amostra.

gene Publicado ensaios CUP com base em expressão muitas vezes têm alguns critérios de inclusão da amostra sobre a representação do tumor, necrose mínimo e qualidade de RNA total. . Por exemplo, na obra de Rosenfeld et al, a maioria das amostras incluídas ( 90%) tinha pelo menos 50% do tumor em área de secção, e foi necessário 5 ug de ARN total [9]. . Na obra de Monzon et ai, foi necessário um exame visual por patologistas, e, pelo menos, 60% e representação do tumor 20% de necrose foram incluídos [7], [8]. No estudo de avaliação anterior do Theros CancerTYPE ID® por Ma et al., O teor médio de tumor de todas as amostras foi de aproximadamente 65% [6].

Com a aplicação da LCM, Theros CancerTYPE ID® (Versão 2) é capaz de tratar os espécimes com células tumorais disseminadas, tais como o nó de linfa metástase. Nos nossos dados, apesar de uma diminuição de desempenho é observado no grupo de LCM, ainda apresentaram uma taxa de concordância de 78%.

No entanto, existem dificuldades técnicas quando usando LCM. Devido às células tumorais altamente dispersos e fraca representação de tumor em alguns espécimes, a baixa quantidade de ARN, a contaminação com as células vizinhas, tais como fibrócitos, linfócitos ou áreas necróticas, e a degradação do ARN durante a coloração e dissecção, os resultados de qRT-PCR pode ser alterado .

Em nossos dados, a baixa integridade e quantidade de RNA não afetou significativamente os resultados da classificação. Observou-se uma diminuição na sensibilidade com um aumento no valor Ct ARG, mas esta diferença não foi estatisticamente significativa. Além disso, não foram encontradas diferenças na ARG Ct entre o grupo corretamente classificados e classificados erroneamente.

A contaminação também foi encontrada em pelo menos 2 amostras. Ambas as amostras são gastro metástases tumorais esofágica para o ovário. As amostras foram tomadas a partir do local metastático, e ambos foram previstos como cancro do ovário. Considerando essas dificuldades técnicas, uma diminuição no desempenho da classificação de 91% em amostras de raspados para 78% em amostras de LCM parece inevitável.

Na prática clínica, metástases, muitas vezes aumentar a demanda para a origem do tumor primário a ser identificados rapidamente e com precisão. No entanto, muitos estudos anteriores já descrita a mudança em morfologia, IHC e ARNm de perfil. Esta mudança irá resultar em uma diminuição na precisão da classificação por patologistas ou testes moleculares baseados em perfis de expressão gênica. Em nossos dados, os tumores primários mostrou a maior sensibilidade, com uma taxa de concordância de 86,3%. Todos os 37 tumores metastáticos mostraram uma taxa de concordância de 73%. Para alguns pacientes, o único local metástase identificado é o linfonodo. Também foi calculado o índice de concordância dos espécimes 19 linfonodo metástases e obteve 68,4% de sensibilidade. No entanto, esta diminuição não é significativa (

P

= 0,06).

O grupo metástase tinha mais espécimes LCM. É difícil determinar se a queda de desempenho é causada principalmente por mudanças no perfil de expressão relacionadas com metástases ou contaminação durante LCM. Além disso, a dimensão limitada da amostra dentro do grupo metástase feito o resultado menos convincente.

o grau do tumor também podem alterar o perfil de morfologia e de expressão. Mal tumores diferenciados são por vezes difíceis de identificar e irá causar erros de diagnóstico. No entanto, em nossos dados, as amostras de tumores de 50 grau III tinha uma taxa de concordância de 76%, e as diferenças de desempenho entre os três graus não foram estatisticamente significativa (P = 0,884).

Anteriormente, duas validações foram realizados usando amostras para as quais a origem do tumor já foi identificada em população americana. Nosso estudo mostrou que o desempenho geral do Theros CancerTYPE ID® (Versão 2) na população chinesa são comparáveis ​​ao teste anterior, Theros CancerTYPE ID® (versão 1) [6] e o teste reenviado por Theros CancerTYPE ID® (versão 2) em população americana [11]. No entanto, o desempenho de alguns tipos de câncer, como de endométrio e de ovário, foi diminuída na população chinesa. Tumores, como câncer de pulmão e câncer de intestino mostrou um aumento no desempenho nestes testes de validação. No entanto, devido às amostras limitadas de cada tipo de tumor e histologia tipo, que é difícil de confirmar se esta diferença de desempenho foi causada por uma diferença entre o perfil de expressão de diferentes populações ou do tipo histológico testado.

Embora um total de 184 amostras foram incluídos no estudo, para certos tipos de tumor com pequenas amostras, a análise foram incapazes de alcançar o poder estatístico adequado. Tal como o câncer de adrenal, apenas 2 amostras foram testadas. estudo adicional com tamanho da amostra alargada para certos tipos de tumor em obras necessárias no futuro.

Conclusão

Foram avaliados o desempenho do Theros CancerTYPE ID® em 184 amostras tumorais chinesas de 23 tipos. O ensaio foi realizado de forma cega e independente. Um critério de inclusão da amostra a baixa foi definido (pelo menos 300 células tumorais), e nenhuma amostra foi excluído durante a inclusão ea fase experimental.

Um resultado comparável com o trabalho anterior foi gerado, com um desempenho total de 82,1%.