Resistência

Sumário

à terapia baseada em cisplatina é uma das principais causas de falha do tratamento de câncer de ovário humano. Uma melhor compreensão dos mecanismos de resistência a cisplatina vai oferecer novos insights para novas estratégias terapêuticas para esta doença mortal. Akt e p53 são determinantes da sensibilidade cisplatina. Rictor é um componente do complexo mTOR cinase de proteína 2, que é necessária para a fosforilação de Akt (Ser473) e a activação completa. No entanto, a função exacta da rictor e a relação entre rictor e p53 na resistência à cisplatina permanece pouco compreendido. Aqui, usando sensível à p53 do tipo selvagem (OV2008 e A2780s), resistente a p53 do tipo selvagem (C13 * e OVCAR433), e p53 comprometida (A2780cp, OCC1 e SKOV-3) as células de cancro do ovário, demonstrámos que: (i) rictor é um determinante de resistência a cisplatina em células de cancro do ovário humanos quimiossensíveis; (Ii) cisplatina down-regula conteúdo rictor pela caspase-3 clivada e degradação proteossómica; (Iii) a regulação negativa rictor sensibiliza as células cancerosas do ovário quimio-resistentes à apoptose induzida por cisplatina de uma forma dependente de p53; (Iv) rictor suprime apoptose induzida por cisplatina e confere resistência ativando e estabilizar Akt. Estes achados ampliar o conhecimento atual sobre a base molecular e celular de resistência a cisplatina e proporcionar uma base racional para rictor como um potencial alvo terapêutico para o câncer de ovário resistente à quimioterapia

Citation:. Im-aram A, Farrand L, Bae SM, canção G, Song YS, Han JY, et al. (2013) O mTORC2 Component Rictor contribui para a resistência cisplatina em células de cancro do ovário humano. PLoS ONE 8 (9): e75455. doi: 10.1371 /journal.pone.0075455

editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de maio de 2013; Aceito: 15 de agosto de 2013; Publicação: 23 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Im-aram et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo programa Universidade World Class (WCU), através do Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia e financiada pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (R31-10056) e pelos Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde (M0P-126144). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do ovário

epitelial é a neoplasia maligna ginecológica mais letal entre as mulheres em todo o mundo [1]. Apesar dos avanços na nossa compreensão da biologia do tumor, a mortalidade global de câncer de ovário (OVCA) permanece elevado. Actualmente, a quimioterapia, em combinação com citorredução cirúrgica é a opção preferida de tratamento e derivados de cisplatina (CDDP: cis-diaminodicloroplatina) são de primeira linha terapêutica quimioterapêuticos. CDDP induz a morte celular citotóxica através da formação de adutos de DNA de platina, resultando em danos ao DNA e ativação de vias de apoptose [2].

O tratamento eficaz da OVCA é muitas vezes dificultada por diagnóstico tardio eo surgimento de resistência aos quimioterapia após ciclos sucessivos de tratamento. Resistência a quimioterápicos envolve mecanismos complexos que podem resultar de sinalização desregulada, reparação de DNA reforçada, alteram o metabolismo da célula cancerosa [3,4], o transporte da droga e do metabolismo [5], ea desregulação dos fatores de sobrevivência, incluindo FLIP, XIAP e Akt [6 -9]. Estes eventos celulares e moleculares alterar a resposta global da célula a agentes genotóxicos, como a CDDP e influência da célula para decisões pró-sobrevivência.

O alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) via tem emergido como um regulador crítico de celular metabolismo, crescimento, proliferação e sobrevivência. A sua aberração, que está presente em até 50% [10] de pacientes OVCA, tem sido demonstrado que confere resistência a um tratamento à base de CDDP e está associada com um prognóstico desfavorável [11-14]. A via mTOR envolve dois complexos de sinalização: mTORC1 e mTORC2. mTORC1 é sensível a síntese de rapamicina e proteína e controlos metabolismo celular, enquanto mTORC2 é essencial para a viabilidade das células [15]. mTORC2 também é conhecida por seu papel na fosforilação de Akt em Ser473 permitindo a ativação completa e degradação proteossómica [16-18]. ativação da Akt e /ou a sobre-expressão são um determinante da sensibilidade CDDP em OVCA humano. Akt ativação resulta na estabilização de uma série de inibidores de caspase [19,20] inibe a acumulação mitocondrial p53 e libertação de proteínas de morte [21,22], e atenua a fosforilação da p53 e a função nuclear [8]. Em contraste, a inibição Akt aumenta a fosforilação p53 (Ser

15) e sensibilidade CDDP [8,23].

O companheiro rapamicina-insensitive de mTOR (Rictor) é um componente essencial do mTORC2 complexa e é necessária para o seu funcionamento completo [24]. A sobre-expressão de rictor aumenta a actividade mTORC2 e promove o crescimento celular e a motilidade [25]. Por outro lado, a regulação negativa rictor suprime a proliferação celular e a formação de tumor em certos cancros [26-28]. Rictor também interage com a quinase ligada a integrina (ILK) para promover a sobrevivência de células de cancro através de Akt Ser473 fosforilação, e com PKCζ para a invasão de células de cancro e metástase [29,30]. Rictor é necessária para o desenvolvimento de cancro da próstata induzida por perda de PTEN [31]. Segmentação rictor induz a paragem do ciclo celular na fase G1 e diminui a expressão da ciclina D1 em células de câncer de mama, cólon e próstata [27,32]. Além disso, a sub-regulação de mTORC2 facilita a apoptose induzida por fármaco quimioterapêutico em células de cancro da mama [33]. No entanto, o papel de rictor da resistência a CDDP em OVCA permanece desconhecida.

p53 é uma proteína supressora de tumor que influencia efectores a jusante da apoptose através de ambas-transcrição dependentes e independentes de mecanismos [8,21]. É normalmente ativada por CDDP via fosforilação em Ser15 e Ser20, que são essenciais para as suas propriedades pró-apoptóticos, e supressão de murino duplo minuto 2 (MDM2) e sua ubiquitinação e degradação proteossómica [34-36]. Temos demonstrado recentemente que a perda da função p53 pela inativação ou mutação influencia negativamente a apoptose e quimio-sensibilidade [7,37]. As células que carecem de p53 funcional não conseguem inibir mTORC1 em resposta a danos no ADN [38]. No entanto, a coordenação e comunicação entre o estado de p53 e rictor na regulação da chemoresistance é mal compreendida.

No presente estudo, a hipótese de que rictor desempenha um papel importante na regulação da quimio-sensibilidade das células OVCA e que a sua down- regulação sensibiliza células OVCA quimiorresistentes para tratamento com CDDP, facilitando degradação proteossoma dependente de Akt, de um modo dependente de estado de p53. Os resultados deste estudo levantam a possibilidade de que rictor pode ser um alvo terapêutico para OVCA, embora a eficácia de tal pedido seja susceptível de ser dependente de status de p53.

Materiais e Métodos

Reagentes

RPMI 1640 e de meio DMEM /F12 de cultura, o soro bovino fetal (FBS), aminoácidos não essenciais, penicilina, estreptomicina, e anfotericina B eram da Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). CDDP, sulfóxido de dimetilo (DMSO), Hoechst 33248, aprotinina, ortovanadato de sódio (Na

3VO

4), fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) foram da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Os anticorpos policlonais de coelho: anti-fosfo-Ser

473-Akt, anti-fosfo-Ser

450-Akt, anti-Akt, anti-fosfo-Ser

15-p53, anti-PARP e coelho monoclonal anticorpo anti-rictor foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, CA, EUA). Monoclonal de rato anti-p53 e anti-GAPDH eram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA) e Abcam (Cambridge, MA, EUA), respectivamente. De cabra anti-ratinho e de anticorpos secundários anti-coelho foram de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, EUA). Rictor e p53 ARNsi foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, CA, EUA). ARNsi de controlo foi da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Lipofectamine 2000, RNase A, N, N, N ‘, N’-tetrametil-etano-1,2-diamina (TEMED), TRIzol e corante foram ROX de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). RNeasy Mini Kit foi de Qiagen (Valencia, CA, EUA). construções de adenovírus contendo os transcritos de WT-p53 e eGFP eram de Vector Biolabs (Filadélfia, PA, EUA). Epoxomycin lactacistina e foram da Merck Chemical (Gibbstown, NJ, EUA). Z-DEVD-FMK e Z-VAD-FMK eram de Tocris Bioscience (Ellisville, MO, EUA). Rictor e GAPDH RNA primário eram de Bioneer (Daejeon, Coreia do Sul) e caspase activa recombinante humana 3 era de BioVision (Mountain View, CA, EUA). PIPES, DL-ditiotreitol (DDT), etilenodiamina-tetracético (EDTA) e 3 [(3-cholamido-propil) dimethyallonio] -1-propanossulfonato hidrato (Chaps) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) .

As linhas celulares e Cultura

CDDP sensíveis (OV2008 e A2780s) e resistentes (C13 *, OVCAR-433, A2780cp, OCC-1, e SKOV3) linhas celulares OVCA humanos foram generosamente fornecidos pelos Drs. Rakesh Goel e Barbara Vanderhyden (Ottawa Hospital Cancer Center, Ottawa, ON, Canadá). As células foram mantidas em meio RPMI 1640 e DMEM /F-12, tal como anteriormente relatado [20,21,36]. A linha de células OV2008 e sua contraparte resistente C13 * são oriundos de adenocarcinoma de ovário endometrioid com diferenciação escamosa. células de OCC-1, A2780s e A2780cp originado a partir de tumores de carcinoma do ovário indiferenciadas. células SKOV3 eram de origem carcinoma de células claras [39] e as células foram OVCAR433 de cystadenocarcinomas serosa do ovário [23]. Após os tratamentos indicados, as células foram colhidas para análise.

Extracção de proteínas e análise de transferência de Western

Os procedimentos de extracção de proteína e a análise Western blot foram realizados como previamente descrito [40]. As membranas foram incubadas a 4 ° C durante a noite com anti-rictor (1: 100), fosfo-Ser

473-Akt (1: 1000), fosfo-Ser

450-Akt (1: 1000), p53 ( 1: 5000), fosfo-Ser

15-p53 (1: 1000) e PARP (1: anticorpos de 2000) e 1 h à temperatura ambiente para o anti-GAPDH (1: 10.000) e de coelho conjugado com HRP ou rato secundária anticorpos (1: 5.000-1: 10.000). GAPDH foi escolhida como controlo de carga uma vez que o seu conteúdo celular nas células OVCA examinados nos estudos actuais não é afectada pelo tratamento com CDDP. densidades banda foram analisadas para quantificação utilizando um ChemiDOC

TM XRS + (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA)

Avaliação da apoptose

A apoptose foi avaliada com base na morfologia celular utilizando o corante nuclear Hoechst 33258. O procedimento foi realizado tal como descrito anteriormente [20,36]. Um mínimo de 400 células por grupo de tratamento foram contados e que o contador foi cegado para evitar viés experimental

siRNA transfecção

células OVCA foram transfectadas com siRNA rictor (0-100 nM; 48 h). , p53 ARNsi (100 nM; 48 h), ou ARNsi de controlo (0-100 nM; 48 h) e tratadas em seguida com CDDP (0-10 uM; 24 h), como descrito anteriormente [20], e recolhidas para análise posterior .

infecção adenoviral

células

A2780cp e SKOV3 foram infectadas com adenovírus em peso de p53 (MOI = 10; 24 h; GFP como controlo) conforme anteriormente descrito [9,20]

.

In vitro actividade da caspase-3

O ensaio da actividade da caspase-3 in vitro foi realizada com lisados ​​de células inteiras de OV2008 como previamente descrito [23].

A análise estatística

os resultados são expressos como a média ± SEM de pelo menos três experiências independentes. A análise estatística foi realizada pelo teste t pareado, e unidirecional ou bidirecional ANOVA conforme apropriado, usando SigmaPlot® 12 (Systat Software Suite, IL, EUA). As diferenças entre os vários grupos experimentais foi determinada pelo teste post-hoc de Bonferroni. A significância estatística foi inferida a P 0,05.

Resultados

CDDP sub-regula conteúdo Rictor e induz a apoptose em células OVCA quimiossensíveis mas não resistentes

Para determinar se o conteúdo rictor é alterada durante o tratamento CDDP em OVCA, quimiossensíveis OVCA (OV2008 e A2780s) e resistente à quimioterapia (C13 *, * A2780cp, OVCAR433, OCC1 e SKOV-3) OVCA linhas celulares foram tratados com CDDP (0-10 uM; 24 h) e o teor rictor foi avaliada por imunotransf erência [Figura 1 ]. CDDP significativamente regulada para baixo conteúdo intacto rictor (200 kDa) e a apoptose induzida em quimiossensíveis (OV2008, *** P 0,001; e A2780s, ** P 0,01), mas não em OVCA resistente à quimioterapia, independentemente da concentração de CDDP (C13 *, A2780cp, OVCAR433, OCC1 e SKOV-3; p 0,05). Estes resultados demonstram que rictor não está sujeita a regulação negativa por CDDP em células OVCA quimiorresistentes, um fenômeno que pode contribuir para o fenótipo de resistência.

expressão da proteína Rictor é regulada em quimiossensíveis (OV2008 e A2780s), mas não resistente à quimioterapia, OVCA (C13 * e * A2780cp) durante o tratamento com CDDP (0-10 uM CDDP; 24 h). Diminuição do conteúdo rictor em OV2008 e A2780s após o tratamento CDDP foi associada com aumento da apoptose. teor de proteína rictor em resistente à quimioterapia OVCA (OVCAR433, OCC1 e SKOV3) não foi afetada pela CDDP. conteúdo rictor foi normalizado contra a GAPDH (carregamento de controle). Um Western blot representativo de três experiências independentes, é apresentada. Os resultados são apresentados como média ± SEM de três experiências independentes. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, # p 0,05 (vs CTL em células sensíveis). Hoechst 33258 coloração foi utilizado para avaliação da apoptose como mencionado nos procedimentos experimentais.

CDDP induz processamento rictor e quimio-sensibilidade em uma caspase-3 e dependente de proteassoma forma

Para determinar se rictor induzidas pela CDDP sub-regulação pode ser devido a processamento pós-tradução, que inicialmente investigada a possibilidade de a clivagem dependente de caspases de rictor em OV2008 e A2780s quando tratados com o inibidor da pan-caspase Z-VAD FMK (10 uM) antes ( 30 min) e durante a CDDP desafio (0-10 uM; 24 h). células OV2008 tratadas com a CDDP sozinha exibiram uma rictor intacta (200 kDa) e dois produtos clivados imunorreactivo que migraram a 160 kDa e 130 kDa [Figura 2]. CDDP diminuiu o teor rictor intacta e a proteína de 160 kDa, mas aumentou marcadamente os níveis de banda de 130 kDa. Embora o tratamento de A2780s com CDDP também resultou na sub-regulação de rictor intacta (200 kDa), o nível da proteína de 160 kDa foi marcadamente elevada, enquanto que o de 130 kDa não foi significativa afectada. Pré-tratamento das células com o inibidor de caspase atenuou significativamente as alterações induzidas pela CDDP em conteúdo rictor intacta e clivada em ambas as células sensíveis (p 0,05 e P 0,01 em OV2008 e A2780s, respectivamente, Figura 2), sugerindo que a CDDP para baixo -regulates rictor em parte pelo aumento da actividade da caspase e que a clivagem de caspases em diferentes locais de consenso pode ser envolvido. Além disso, o pré-tratamento das células com o OVCA específico inibidor da caspase-3 Z-DEVD-FMK produziram resultados semelhantes, indicando que a caspase-3 está envolvida no processamento de rictor induzidas pela CDDP. Curiosamente, enquanto que a CDDP induziu apoptose em ambas as linhas celulares quimiossensíveis, pré-tratamento das células, quer com a pan-caspase ou específico inibidor da caspase-3 atenuada esta resposta, sugerindo que a CDDP induz processamento rictor por caspase-3 e desregulação deste processo confere quimiorresistência em células OVCA

OV2008 e A2780s foram pré-tratadas com z-VAD FMK (10 uM) e Z-DEVD FMK (50 uM) durante 30 minutos antes e durante a CDDP de desafio. (0-10 uM; 24 h) e conteúdo rictor e apoptose foram avaliados. células OV2008 tratadas com a CDDP sozinha exibiram uma rictor intacta (200 kDa) e dois produtos clivados (160 kDa e 130 kDa). CDDP diminuiu o teor rictor intacta e proteína de 160 kDa, mas marcadamente aumento dos níveis de banda de 130 kDa. Tratamento de A2780s com CDDP resultou numa regulação negativa do rictor intacta, mas aumentou o nível da proteína de 160 kDa e não teve nenhum efeito sobre a proteína de 130 kDa. Pré-tratamento das células com o inibidor da pan-caspase (Z-VAD) ou o inibidor específico da caspase-3 (Z-DEVD) atenuou de forma significativa as alterações induzidas pela CDDP em conteúdo rictor intacta e clivada em ambas as células sensíveis, e CDDP- apoptose induzida foi significativamente mas não completamente atenuado pela presença dos inibidores em ambas as linhas celulares quimiossensíveis. conteúdo rictor foi normalizado contra a GAPDH (carregamento de controle). Os resultados são apresentados como média ± EPM (n = 3 e n = 5 em OV2008 e em A2780s, respectivamente). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 (vs respectivos controlos). Hoechst 33258 coloração foi utilizado para a avaliação da apoptose como indicado nos procedimentos experimentais.

Para determinar se a degradação proteossómica desempenha um papel na rictor induzidas pela CDDP sub-regulação, células OV2008 foram cultivados [30 min pré tratamento; 24 h durante o tratamento com CDDP (0-10 uM)] com os inibidores de proteassoma epoxomycin (10 nM) e lactacistina (4 uM). Considerando que a CDDP sozinha significativamente regulada negativamente rictor intacta e a apoptose induzida, como seria de esperar, a presença dos inibidores bloqueou completamente rictor induzidas pela CDDP sub-regulação e significativamente, mas não apoptose completamente atenuado, tal como evidenciado pela clivagem de PARP e a morfologia nuclear (P 0,001; Figura 3:. A)

A. células OV2008 foram pré-tratados (30 min) com os inibidores de proteossomo [epoxomycin (10 nM) e lacytasystin (4 ^ M)] e submetido a desafio CDDP (0-10 uM; 24 h). conteúdo rictor e apoptose foram analisados ​​por transferência de Western e a avaliação da morfologia nuclear. Ambos epoxomicina e lactacistina bloqueou eficazmente a degradação induzidas pela CDDP rictor (P 0,001), mas apenas parcialmente atenuada apoptose. B. células OV2008 foram cultivadas nas mesmas condições que em A, mas pré-tratadas com inibidor de proteassoma e /ou Z-DEVD (50 uM). Não se observou qualquer efeito sinergético entre os dois inibidores. C. A incubação de lisado de células inteiras OV2008 (30 min, 30 ° C) com o recombinante activa da caspase-3 (5-20 ug /ml) resultou na clivagem Rictor como evidenciado pela diminuição do teor de rictor intacta (200 kDa) e o aumento na clivado formas (130 kDa e 160 kDa). Os resultados são apresentados como média ± SEM de três experiências independentes. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 (vs respectivos controlos). Hoechst 33258 coloração foi utilizado para avaliação da apoptose como mencionado nos procedimentos experimentais.

Em seguida investigado se o processamento rictor pela atividade da caspase-3 e degradação proteossómica ocorre em vias separadas. células OV2008 foram cultivados [30 min de pré-tratamento; 24 h durante o tratamento com CDDP (0-10 uM)] com inibidores de proteossoma e /ou específico inibidor da caspase-3. Os mesmos resultados foram observados quando um inibidor estava presente. No entanto, foi observado nenhum efeito adicional quando ambos os inibidores foram utilizados em conjunto [Figura 3: B]

Além disso, para fornecer mais evidências de que o processamento rictor induzida por tratamento com CDDP é lisados-3 dependente de caspase, toda a partir de células. células OV2008 foram usadas para executar uma

em

ensaio de actividade in vitro caspase-3. O

in vitro

dados estava de acordo com o obtido a partir da experiência de linha celular [Figura 3: C]. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que CDDP sub-regula rictor intacta ao nível da proteína através de caspase-3 clivada e degradação proteossómica.

Rictor knockdown sensibiliza OVCA quimio-resistentes à apoptose induzida por CDDP

para estabelecer o papel da rictor na quimiorresistência OVCA, expressão rictor numa linha celular OVCA resistente à quimioterapia em peso de p53 (C13 *) foi silenciados por ARNsi (0, 50 e 100 nM; 48 h) antes do tratamento com CDDP (10? M; 24 h), e a apoptose foi avaliada. rictor intactas e as suas formas clivadas foram significativamente regulada negativamente por siARN de um modo dependente da concentração. Uma diminuição significativa na rictor intacta e clivada rictor foram observadas a 50 nM (P 0,05) e uma redução aproximada de 30% a 100 nM, independentemente da presença de CDDP. Estes resultados não só confirmaram que a 160kDa e 130 bandas imunorreactivas kDa foram efectivamente produtos de rictor clivado, mas também demonstrou que rictor knockdown induziu apoptose (p 0,05), bem como o aumento da apoptose induzida pela CDDP de um modo dependente da concentração (p 0,001) [Figura 4]. Estes resultados sugerem que rictor é um importante determinante da resistência a CDDP em OVCA

C13 * células foram transfectadas com ARNsi rictor. (0-100 nM; 48 h) e cultivadas com ou sem a CDDP (10? M; 24 h ). Rictor knockdown aumentou significativamente a apoptose induzida por CDDP em células C13 * de um modo dependente da concentração. Os resultados são expressos como média ± SEM de três experiências independentes. * P 0,05, *** p 0,001 (vs respectivo CTL siRNA). Hoechst 33258 coloração foi utilizado para avaliação da apoptose como mencionado nos procedimentos experimentais.

resposta apoptótica para CDDP seguinte rictor infra-regulação é dependente de status p53

O supressor tumoral p53 é um importante mediador da apoptose induzida por CDDP [9,22]. Uma vez que aproximadamente 50% dos pacientes OVCA transportar

TP53

mutação do gene (s) [41], que é de interesse para determinar se a apoptose induzida em células de CDDP quimiorresistentes seguintes knockdown rictor é dependente da presença de uma p53 funcional . Para investigar esta possibilidade, a expressão rictor em linhas celulares OVCA quimiorresistentes com variando o estado de p53 (p-p53, C13 * e OVCAR433; p53 mutante, OCC1 e A2780cp; p53 nulo, SKOV3) foram silenciados com ARNsi rictor (100 nM de ARNsi, 48 h) antes do tratamento com CDDP (0-10