Abstract
Os produtos naturais tornaram-se fontes de desenvolvimento de novas drogas para o tratamento de Câncer. Para procurar compostos candidatos que inibem o crescimento de câncer de fígado, componentes de
Chloranthus serratus
foram testados. Aqui, nós relatamos que shizukaol D, um sesquiterpeno dimérica de
Chloranthus serratus
, exerceu um efeito de inibição do crescimento de células de câncer de fígado em uma maneira dose e tempo-dependente. Nós demonstramos que shizukaol D células induzidas a sofrer apoptose. Mais importante ainda, shizukaol D atenuada sinalização Wnt e reduziu a expressão de genes alvo endógenas Wnt, o que resultou na diminuição da expressão de β-catenina. Coletivamente, este estudo demonstrou que shizukaol D inibiu o crescimento de células de câncer de fígado, modulando Wnt via
Citation:. Tang L, Zhu H, Yang X, Xie F, Peng J, Jiang D, et al. (2016) Shizukaol D, um sesquiterpeno dimérico Isolado da
Chloranthus serratus
, reprime o crescimento de células cancerígenas do fígado através da modulação Wnt Sinalização Caminho. PLoS ONE 11 (3): e0152012. doi: 10.1371 /journal.pone.0152012
editor: Chunming Liu, da Universidade de Kentucky, United States |
Recebido: 19 de dezembro de 2015; Aceito: 21 de fevereiro de 2016; Publicação: 24 de março de 2016
Direitos de autor: © 2016 Tang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Projeto Key National Sci-tech especial da China (2013ZX10002010) ea National Science Foundation Natural da China (. não 81.301.855) . Os financiadores deste estudo não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de fígado é a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. Em pacientes com cancro do fígado, os tratamentos cirúrgicos oferecer uma alta taxa de resposta completa e oferecem um potencial de cura [2]. No entanto, ressecabilidade do tumor pode ser limitada pela extensão do tumor, localização, e disfunção hepática subjacente em fases tardias da doença; como tal, a ressecção só é viável numa minoria de pacientes [3]. Até à data, em pacientes com carcinoma hepatocelular avançado (HCC), apenas sorafenib foi mostrado para aumentar as taxas globais de sobrevivência de forma eficiente [4]. Mesmo nos Estados Unidos, a incidência de carcinoma hepatocelular triplicou, enquanto a taxa de sobrevida em 5 anos manteve-se abaixo de 12% [5]. Assim, são urgentemente necessárias estratégias alternativas para o tratamento deste tipo de tumor agressivo.
Nos últimos anos, um número crescente de pesquisadores têm se interessado na triagem de produtos naturais para potenciais agentes anti-câncer, incluindo chineses Medical Herbs (CMH) .
Chloranthus serratus
, que pertence à família
Chloranthaceae
, é uma erva perene que é distribuído principalmente em todo o norte da China, Coréia e Japão. Devido à sua reputação no sentido de facilitar a circulação de sangue e de dispersão estase de sangue, uma série de compostos foram isolados a partir de
Chloranthus serratus
, incluindo treo-1- (1-metoxi-2-hidroxipropil) -2-metoxi-4 , 5-metilenodioxibenzeno e eritro-1- (1-metoxi-2-hidroxipropil) -2-metoxi-4,5-metilenodioxibenzeno [6], serralabdanes A-e [7] e serratustones Um -B [8]. sesquiterpenoids do tipo Lindenane são reconhecidos como o símbolo taxonômica característica do
Chloranthaceae
família. Muitos destes sesquiterpenóides exibem bioactividades anti-inflamatórios favoráveis. Por exemplo, chloramultilide B possui atividades inibitórias contra
Candida albicans
e
Candida parapsilosis
com valores MIC igual a 0,068 mmol /L [9]. Além de avaliar os seus efeitos anti-inflamatórios, mais estudos têm-se centrado sobre as actividades do sesquiterpenoids sobre as células cancerosas. A dimérica sesquiterpeno cycloshizukaol A tem sido mostrado para inibir acentuadamente o ICAM-1 nas células HL-60 de uma maneira dependente da dose [10], e antrocin, um sesquiterpenlactona, induz a morte celular por apoptose de linhas de células de bexiga humana cancro 5637 através de ambos vias de sinalização extrínsecos e intrínsecos [11]. O crescimento efeitos inibitórios de xanthorrhizol, um sesquiterpeno do rizoma da
Curcuma xanthorrhiza
, contra as células cancerígenas do cólon humano HCT116, estão relacionados com a paragem do ciclo celular e indução de apoptose [12].
Shizukaols são uma série de derivados típicos dímero sesquiterpeno. Shizukaol A foi isolado pela primeira vez a partir de
Chloranthus japonicus
em 1990 [13]. Shizukaol D (conforme mostrado na Figura 1) foi isolado a partir de
Chloranthus serratus
[14]. Estudos anteriores sobre a bioatividade da shizukaol D são extremamente limitadas e têm-se centrado principalmente sobre as suas actividades anti-inflamatórias [15]. Também tem sido mostrado para inibir o conteúdo lipídico dependente da AMPK em células hepáticas [16] e para aumentar o consumo de glicose nas células L6 [17].
Neste estudo, vários isolamentos de
Chloranthus serratus
foram testados quanto aos seus efeitos sobre as células cancerosas. A partir desses isolamentos, shizukaol D foi encontrada para induzir a inibição do crescimento e atenuam Wingless-Int (Wnt) sinalização de via em células de câncer de fígado.
Materiais e Métodos
Chemicals e plasmídeos
Shizukaol D (Figura 1) foi isolado a partir de
Chloranthus serratus
de acordo com um método previamente publicado [14] pela Bio Bli Ltd.com. Seguindo este, o composto foi preparado como um estoque 100 mmol /L em sulfóxido de dimetilo (DMSO) e armazenada a 4 ° C. Os anticorpos primários que foram utilizados na transferência de Western incluídos anticorpos para PARP (sinalização celular), PRL (sinalização celular), p-PRL (sinalização celular), Dvl2 (sinalização celular), Axin2 (sinalização celular), β-catenina (BD) , a GSK-3β (sinalização celular), p-GSK-3β (sinalização celular), β-actina (Sigma) e GAPDH (Abmart). Um plasmídeo de tipo selvagem β-catenina (p-β-catenina) foi preparado através da inserção de um gene que codifica β-catenina num plasmídeo pcDNA3.0, ao passo que um plasmídeo β-catenina mutante (Mut-β-catenina) foi preparado através da inserção de um β-catenina gene de codificação com mutações no S33A, S37A e T41A em pcDNA3.0.
linhas de células e cultura de células
As linhas de células humanas de câncer SMMC-7721, SK-HEP1 e HepG2, foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC). linhas celulares adicionais, incluindo o foco, HEK-293T, L Wnt-3A e QGY-7703, foram adquiridos a partir do Instituto de celular Biblioteca da China. células SMMC-7721, foco e HepG2 foram cultivadas em células Meio de Eagle (DMEM, Invitogen) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibico), e SK-HEP1 e QGY-7703 modificado por Dulbecco foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Invitogen) suplementado com FBS a 10%. G Wnt-3Awas cultivadas em DMEM com G418, para se obter meio condicionado Wnt3a. Todas as células foram cultivadas a 37 ° Cin numa incubadora humidificada com 5% de CO
2.
CCK-8 ensaio
respostas de células para shizukaol D foram avaliadas utilizando 2- (2 -metoxi-4-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (sal monossódico 2,4-dissulfofenil) -2H- tetrazólio num kit de ensaio modificado de CCK-8 proliferação celular (Roche Diagnostics, IN). As células foram plaqueadas em placas de 96 poços e em seguida expostos a uma gama de concentrações de D shizukaol por períodos de tempo variáveis. O meio de cultura foi removido antes da adição de 90 uL de meio fresco (sem FBS) e 10 uL de contagem celular solução Kit-8 para cada poço. As placas foram incubadas durante um período adicional de 2 horas a 37 ° C, após o que a absorvância foi medida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas (modelo 550, Bio-Rad, CA). A percentagem de inibição relativamente a um controlo não tratado é ilustrado. Cada experiência foi realizada pelo menos três vezes, independentemente.
Avaliação de células sub-G1
células focais foram plantadas em placas de 6 poços e incubadas em DMEM com 0, 12,50, 25,00 ou 50,00 umol /L de Shizukaol D durante 48 horas. DMEM com 1,00% de DMSO foi usado como um controlo. As células foram fixadas e coradas em solução salina tamponada com fosfato (PBS, 140 mmol /L de NaCl, 2,7 mmol /L de KCl, 10 mmol /L de Na
2HPO
4 e 1,8 mmol /L KH
2 PO?
4, pH = 7,4) contendo 50 ug iodeto de propídio /ml e 0,03% de Triton X-100 antes de serem analisadas por citometria de fluxo (FCM, FAC estrela Além disso, Mod-Fit V2.0 lt; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ ).
Colónia ensaio de formação de
As células foram tratadas com 3,13, 6,25, 12,50 ou 25,00? mol /L Shizukaol D durante 48 horas antes de serem plaqueadas em placas de 6 poços a uma densidade de 500 células por poço e cultivadas em meios normais durante 7-10 dias até as colónias formadas que continham mais do que 50 células. Uma solução de DMSO a 0,1% foi definida como um controlo. Após fixação com 4% polymethanol durante 10 minutos, as colónias foram coradas com violeta de cristal a 1,0% durante 30 minutos.
análise Western blot
As células foram lisadas em tampão de lise celular (Cell Signaling). Após centrifugação, os sobrenadantes foram colhidos, e a proteína total foi sujeito a 10% SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose (GE). A membrana foi bloqueada com leite desnatado a 5% durante 1 h, incubados durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários, e, em seguida, incubadas com anticorpos secundários. A ligação do anticorpo foi detectada usando quimioluminescência aumentada (GE). A membrana foi corada com Ponceau S (Sigma) e sondada com β-actina ou GAPDH anticorpo para confirmar o carregamento e a proteína de transferência equivalente.
Imunofluorescência coloração
células em cultura foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante 10 minutos. Após isto, as células foram tratadas com 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 20 minutos. As células foram ainda incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos específicos para a p-catenina (BD) e lavou-se três vezes com PBS antes da incubação durante 2 horas à temperatura ambiente com anticorpos secundários. Após lavagem com PBS, lamelas (que continha as células) foram, em seguida, montado em DAPI contendo meios de montagem (Beyotime, NC) e fotografada em um microscópio confocal Zeiss.
luciferase repórter ensaio
HEK -293T células foram cultivadas em meios contendo 20 mmol /L de LiCl antes transfectadas com os repórteres de sinalização Wnt TOPflash ou FOPflash como previamente descrito [18]. Após isto, as células foram tratadas com 6,25 e 12,50 pmol /L shizukaol D durante 24 h. plasmídeo de Renilla foi incluído em todas as transfecções relacionados. Os dados são representados como valores normalizados TOP /FOP flash.
Quantitative real-timePCR
O ARN total foi extraído a partir de células cultivadas, utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) e o ADN foi removido por DNase (Promega) . A transcrição reversa foi realizada utilizando transcriptase inversa SuperscriptII (Takara). Quantitative PCR em tempo real (QPCR) foi realizada utilizando coloração com SYBR Green I (Takara) em um sistema iCycleri QTM (BioRad) de acordo com os protocolos do fabricante. Os níveis de expressão de genes foram normalizadas para os níveis de GAPDH interno. As condições foram as seguintes:. 38 ciclos de três passos de PCR (95 ° C durante 40 s, 60 ° C durante 50s e 72 ° C durante 30 segundos), após a desnaturação inicial (95 ° C durante 5 min)
Estatísticas
Os dados apresentados ± como desvio padrão foram pelo menos três conjuntos de experimentos independentes. A análise do teste T foi usada para determinar a significância das diferenças estatísticas. As diferenças foram calculadas pelo SPSS e consideradas significativas para P . 0,05
Resultados
A inibição do crescimento de células cancerígenas do fígado por shizukaol D
Este estudo foi iniciado para testar a citotoxicidade de produtos naturais isolados de
Chloranthus serratus
em diferentes tipos de células cancerosas. Shizukaol D (Figura 1) foi o composto mais eficaz entre os que têm sido relatados. ensaio de cromatografia em fase líquida (Fig S1), ensaio MHz (Fig S2) e HPLC (Fig S3) confirmou a estrutura de shizukaol D e a sua pureza. Um ensaio CCK-8 foi subsequentemente utilizado para verificar o efeito de inibição do crescimento de células shizukaol D em cancro do fígado, incluindo a incidência, HepG2, QGY-7703, SMMC-7721 e de células SK-HEP1 linhas, a várias concentrações (0-200 umol /EU). As células exibiram sensibilidade diferente para shizukaol D (Tabela 1). Como um controlo positivo, o IC
50 de doxorrubicina (Dox) em células foco foi medido como sendo de 0.23μmol /L, e o IC
50 de 5-FU (5-fluorouracilo), o qual era uma utilizada agente para tumores malignos do aparelho digestivo [19], foi medida a ser superior a 20 mmol /L.
Devido à sua maior sensibilidade em relação ao shizukaol D, Foco células e SMMC-7721 foram utilizados na experiências subsequentes. Detectamos os efeitos inibidores de crescimento de shizukaol D com concentrações crescentes. A proliferação de ambas as células foi largamente afectado pelo tratamento de shizukaol D em concentrações baixas, e este efeito foi aumento dose seguinte mais óbvia (Fig 2A). O crescimento de células de foco com tratamento shizukaol D também diminuiu de um modo dependente do tempo. A proliferação de células exibiram uma diminuição gradual ao longo de um curso de 96 horas após o tratamento com shizukaol D com concentrações de 12,50 mmol /L e 25,00 mmol /L, com o DMSO, como um controlo negativo (Figura 2C). A mesma tendência foi também observada em células SMMC-7721 (Fig 2D). Com o aumento da concentração de shizukaol D, Foco células tornou-se redondo, flutuou e até mesmo mortos em campo claro (Fig 2E). Além disso, o ensaio de formação de colónias indicou que a formação de colónias em células SMMC-7721 foi reduzida com a exposição a concentrações crescentes de shizukaol D (Fig 2F e 2G). As colónias de células SMMC-7721 eram dificilmente detectável quando a concentração de shizukaol D atingiu 12,50 nmol /L, o que sugere uma capacidade diminuída de proliferação de células com tratamento shizukaol D (Figura 2F e 2G). Curiosamente, o efeito de shizukaol D em células SMMC-7721 foi mais do que a 5-FU (5-fluorouracilo), especialmente quando foram usadas as concentrações superiores a 6,25 mmol /L (Fig 2B). Em resumo, estes resultados indicaram que shizukaol D inibiu o crescimento de células de cancro do fígado.
(A-D). As células foram de sementes em uma placa de 96 poços e tratadas com uma concentração de série shizukaol D. A proliferação celular foi medida por ensaio de CCK-8. (A) A viabilidade dos Focusand SMMC-7721cells diminuíram quando as células foram tratadas com concentrações crescentes de shizukaol D durante 48 h. (B) A viabilidade diminuiu mais rapidamente quando tratados com shizukaol D do que tratado com mesma concentração de 5-FU em SMMC- 7721 células durante 48 h. A viabilidade celular diminuiu no foco (C) e as células tratadas por shizukaol D de uma forma dose-dependente do tempo e SMMC-7721 (D). (E) A versão transparente de células Focagem tratada com 0,00, 12,50, 25,00 e 50,00 pmol /L de shizukaol D durante 48 horas. ensaio de formação (F) Colônia de células SMMC-7721. As células foram tratadas com 0,00, 3,13, 6,25, 12,50 e 25,00 pmol /L de D shizukaol durante 48 horas e as células para cada concentração foram recolhidos, respectivamente, e plaqueadas em placas de 6 poços, como 500 /poço. As células foram cultivadas com meio normal durante 10 a 15, em seguida, d. (G) Estatísticas da clonagem de eficiência na Figura 2F. **: P 0,01. Os valores são apresentados como médias ± SD
Shizukaol D induziu apoptose em células de câncer de fígado
Bright-campo imagens de células mostrou que shizukaol D induzida aumento da morte celular com gradientes de concentração, o que levou -nos que shizukaol D poderia conduzir a apoptose celular. Testámos vários marcadores de apoptose em células de cancro do fígado que foram tratados com shizukaol D em concentrações de 0-50 umol /L shizukaol D. Os resultados indicaram que a relação sub-G1 de células foco que foram incubadas com shizukaol D aumentou de 7,49 ± 0,59 para 21,38 ± 1,80 (Fig 3A). Sub-G1 é uma porção de pico antes do pico G1 em FCM, o que implica a formação do corpo por apoptose. Western blot confirmou que a PARP clivada foi observada quando a concentração de D shizukaol conseguido e ao longo 12.50μmol /L, enquanto que a quantidade de pró-PARP diminuiu (Figura 3B). Assim, a função de inibidor do crescimento de shizukaol D foi mediada através de indução de apoptose.
(A) As estatísticas da razão de sub-G1 de Focagem por FCM. As células foram incubadas com shizukaol D durante 48 horas antes de ser recolhido e diluído em PBS com 50 ug /ml de PI e 0,03% de Triton X-100. **: P 0,01. Os valores são expressos como média ± D.P.. (B) análise por Western blot da expressão da PARP. células focais foram tratados com shizukaol D para 48 hbefore recolhido e, em seguida, a proteína total foi sujeito a 10% SDS-PAGE e transferidos para a membrana de nitrocelulose. β-actina anticorpo foi usado para confirmar a carga equivalente.
Shizukaol D atenuou a Wnt via
Para explorar o mecanismo subjacente à apoptose, várias vias de sinalização foram avaliados utilizando ensaios de repórter de luciferase. Encorajador, β-catenina /atividade repórter TCF4, que foi medida com genes repórter abrigando locais TCF4 vinculativas, em grande parte diminuído em resposta a shizukaol tratamento D (Fig 4A). Em 20-40% dos doentes de HCC, β-catenina mostra a sua acumulação nuclear e actividade regulada positivamente potencial [20]. β-catenina é uma das principais características da activação da via Wnt /β-catenina e o método mais direto de inibir a via de Wnt é alvejar β-catenina por siRNA [21]. Curiosamente, em nosso estudo, a análise western blot mostraram níveis β-catenina foram diminuídos em uma dose e forma dependente do tempo em ambos os Focus (Fig 4B) e as células SMMC-7721 (Fig 4C). Esta redução nos níveis de proteína foi ainda confirmada por imunofluorescência (Fig 4D). Além disso, foram detectados vários mediadores cruciais da via de sinalização Wnt e encontrou a regulação para baixo consistente de Dishevelled 2 (Dvl2) e Axin2 (Fig 4E). Além disso, a fosforilação de LRP6 co-receptor mostraram uma redução nos níveis de proteína. No entanto, a GSK-3β, um regulador negativo que contribui para a p-catenina degradação, não se alterou. Finalmente, examinámos os genes-alvo via de sinalização Wnt por PCR em tempo real (qRT-PCR). C-Myc, ciclina D, TCF-1, LEF1, Wnt3a e FGF18 foram significativamente reprimido por shizukaol D, mesmo no ponto de tempo anterior (Figura 4F), confirmando a actividade β-catenina impedida. No seu conjunto, os resultados acima demonstraram shizukaol D restringe a sobrevivência celular através da repressão /actividade da via Wnt β-catenina.
(A) D Shizukaol TOPflash diminuição da actividade e da actividade TOPflash atenuada em células HEK-293T cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 50 mmol /L de LiCl. plasmídeo de Renilla foi incluído em todas as transfecções como controlo. células tratadas com shizukaol D. (D) Análise por imunofluorescência da β-catenina em células de cancro do fígado com 10μmol /L shizukaol D (BC) análise Western blot da expressão de expressão β-catenina no foco (B) e SMMC-7721 (C) tratamento durante 24 h. Vermelho: coloração para β-catenina ativo, azul: coloração nuclear por DAPI. Superior: células foco; inferior: células SMMC-7721. (E) Análise Western blot da expressão de genes alvo endógenas Wnt. células SMMC-7721 foram tratadas com 20μmol /L shizukaol D durante 24 h antes de GAPDH collectedand foi definido como controlo. nível de expressão (F) ARNm de Wnt genes endógenos alvo, c-myc, ciclina D, TCF-1, LEF1, Wnt3a e FGF18, por qPCR. O ARN total de células SMMC-7721 foi isolado depois de tratada por 20μmol /L shizukaol D para 6 ou 12 horas, e, em seguida, foi transcrito reversamente em ADNc. GAPDH foi fixada como controlo. **: P 0,01. Os valores são apresentados como médias ± SD
Wnt ativação da via compensado a viabilidade das células de câncer de fígado
Existem inúmeras maneiras de ativar a via Wnt, como a adição de proteína Wnt3a para meios de cultura celular ou aumentando a expressão de β-catenina. A viabilidade das células SMMC-7721 recuperou quando eles foram cultivadas com meio condicionado-Wnt3a, independentemente de se eles foram simultaneamente serem incubados com 6,25 ou 12,50? Mol /L de shizukaol D, embora a viabilidade celular não atingir o nível de controlo ( Figura 5A). Um método alternativo de activação da via Wnt é através de transfecção com o plasmídeo que expressa β-catenina. Após incubação em 12,5 umol /L de shizukaol D durante 48 horas, a viabilidade das células SMMC-7721 que tinham sido transfectadas com os plasmídeos que expressam quer WT-β-catenina ou Mut-β-catenina aumentou significativamente em comparação com células transfectadas com um veículo vazio (pcDNA3.0 plasmídeo). Western blot mostrou WT-β-catenina ou Mut-β-catenina transfecção produziram aumento proteínas β-catenina em células de controlo que SMMC-7721 (Fig 5B). Além disso, as células que foram transfectadas com o plasmídeo Mut-β-catenina exibiram viabilidade ligeiramente maior do que aquelas transfectadas com WT-β-catenina. Estes resultados sugerem que a activação de Wnt via compensa para a viabilidade de células de cancro do fígado que foram tratados por shizukaol D.
Actviation de Wnt via resgatado efeito inibidor de shizukaol D em células do cancro do fígado. (A) A viabilidade celular das células tratadas SMMC-7721 por shizukaol D aumentou quando incubadas com meio condicionado Wnt3a. (B) A viabilidade celular das células tratadas SMMC-7721 por shizukaol D aumentou quando transfectada com WT-β-catenina ou Mut-β-catenina. A expressão da proteína β-catenina de amostra correspondente foi analisada por Western blot e ilustrado abaixo. β-actina anticorpo monoclonal foi utilizado para confirmar o carregamento equivalente.
Discussão
Os produtos naturais muitas vezes se tornam fontes de novas drogas [22]. Desde a década de 1940 até o presente, um total de 85, ou 48,6%, dos agentes terapêuticos que tenham sido aprovados pela FDA e organizações semelhantes para o tratamento do cancro ou eram produtos naturais ou derivados de produtos naturais [23]. Aqui, mostramos que shizukaol D, um sesquiterpeno dimérica isolado do
Chloranthus serratus
, inibição do crescimento induzida em células de câncer de fígado. Apenas um único relatório anterior tem discutido a citotoxicidade de shizukaol D, em que a citotoxicidade dos extractos isolados a partir de
Chloranthus japonicus
foram avaliadas, e o IC
50 valor de D shizukaol contra SMMC-7721 verificou-se ser 13,71 ± 1,68 mmol /L [24]. Neste estudo, o IC
50 valor da shizukaol D contra SMMC-7721 foi encontrado para ser 8,82 ± 1.66μmol /L, que estava perto de os resultados do relatório anterior e provou a confiabilidade dos nossos métodos.
Além disso, testou-se uma série de células de cancro do fígado e verificaram que a inibição do crescimento induzida por shizukaol D era ambas, e dependente do tempo (Figura 2), dependente da dose. Várias linhas celulares de cancro do fígado exibiu maior sensibilidade para este composto, especialmente Focagem células. O efeito inibitório de shizukaol D em células de cancro do fígado foi de acordo com os resultados da eficiência de formação de colónias (Figura 2F e 2G) .A inibição de crescimento que foi causada por shizukaol D foi significativa em comparação com a causada pelo 5-FU, especialmente quando as concentrações excedeu 6,25? mol /L (Fig 2B). 5-FU é um análogo da pirimidina que tem sido utilizado para tratar pacientes com cancro; tem sido administrado sistemicamente para o tratamento de cancros anal, da mama, da pele, do esófago, do estômago, do pâncreas e colo-rectais. Apesar de a citotoxicidade induzida por shizukaol D não foi robusto às 24 h após o tratamento, ainda que excedeu induzida por 5-FU e, por conseguinte, a optimização de shizukaol D pode servir como uma direcção promissor para o desenvolvimento de agentes anti-tumorais novos.
para descobrir o mecanismo subjacente à inibição do crescimento observada, um sistema de repórter de luciferase foi usado para avaliar a variação em diferentes vias de sinalização de células que estão envolvidos na proliferação celular. Os resultados indicaram que shizukaol D atenuada Wnt sinalização da via (figura 4A) de um modo semelhante ao XAV939, que foi demonstrado ser um potente inibidor da via Wnt /β-catenina sinalização [25]. A via Wnt é uma via de desenvolvimento chave que também está envolvida na patogénese de vários tipos de cancro [26], e que apresenta uma potencial via de alvo para a intervenção terapêutica em doentes com HCC [27]. sequenciamento de próxima geração (NGS) revelou que a via de sinalização Wnt é um driver oncogênico chave em pacientes com CHC [28]. A via de sinalização Wnt também está envolvido em apoptose em células citopáticos. In vivo, o tratamento com IFN-a inibe a2B /β-catenina /TCF via Wnt e promove a morte celular programada [29]. Dois componentes da via de sinalização Wnt, AXIN2 e FRA1, foram encontrados para exibem diminuição da expressão durante a apoptose de células estreladas hepáticas [30]. No nosso estudo, shizukaol D aumentou a razão de células sub-G1, que são produtos da apoptose (Fig 3A), bem como a quantidade de 89kD clivado PARP (Fig 3B), que é um substrato da protease relacionada com a apoptose caspase 3 [31]. As expressões de genes alvo via Wnt, tais como C-myc, ciclina D, TCF-1, LEF1, Wnt3a, FGF18, foram significativamente reprimido por shizukaol D (Figura 4E). Estes dados sugeriram que a morte celular e a apoptose em células de cancro do fígado tratados com shizukaol D foram associadas com a atenuação da via Wnt.
Além disso, transferência de Western revelou que a expressão de β-catenina em células de cancro do fígado diminuiu em ambos uma forma tempo e dose-dependente (Figura 4B e 4C) .A proteína β-catenina, que é codificada pelo gene CTNNB1, desempenha um papel importante na sinalização canónica via Wnt. Na ausência de sinalização Wnt, o β-catenina proteína citosólica é orientada e degradada por um complexo multi-proteína que inclui AXIN1, APC, e GSK3b CK1 [32]. A activação da cascata de sinalização de Wnt perturba o complexo degradação β-catenina, em seguida, as proteínas β-catenina acumular-se no citoplasma e translocar para o núcleo. β-catenina atos nuclear como um fator de transcrição ativando genes alvo a jusante, tais como c-myc, ciclina D1 [33, 34] e suvivin [35]. Uma diminuição na expressão de β-catenina acompanhou a inibição do crescimento de células de cancro do fígado que foi induzida pelo tratamento com D shizukaol, o que implicava que a inibição de crescimento resultante da modulação da via Wnt.
Para determinar se a activação da via Wnt prévia para shizukaol D tratamento resgatou os efeitos observados, dois métodos diferentes foram utilizados neste estudo para activar a via: as células de câncer de fígado foram cultivadas em meios condicionados-Wnt3a ou foram alternativamente transfectadas com plasmídeos que codificam β-catenina. Em ambos os casos, a viabilidade das células aumentou após o tratamento com shizukaol D (Figura 5A e 5B). A viabilidade das células após a transfecção com wt-β-catenina foi ligeiramente reduzida em comparação com a transfecção com MUT-β-catenina, que pode ser porque S33A, S37A e T41A são cassetes reguladoras GSK3 [36] e são vulneráveis a shizukaol D. No entanto, Wnt percurso activação não compensar os efeitos da shizukaol D em células do cancro do fígado total e, por conseguinte, mecanismos adicionais de inibição de crescimento pode ter efeitos ao mesmo tempo. A recuperação da viabilidade em células de câncer de fígado que foram tratados com shizukaol D após a ativação da via de sinalização Wnt verificado que Wnt via é um alvo potencial de shizukaol D e supressão da via Wnt pelo composto leva à redução da proliferação e sobrevivência de células de câncer de fígado linhas.
compostos naturais têm sido mostrados como sendo úteis tanto individualmente como em combinação com as terapias comuns na prevenção da progressão de tumor e o tratamento de tumores malignos humanos [37]. Com base em nossos resultados, shizukaol D, um sesquiterpeno dimérica isolado do
Chloranthus serratus
, pode servir como um potencial candidato para o tratamento de câncer de fígado, embora a identificação de seu alvo directo requer uma investigação mais aprofundada.
Conclusões
em resumo, os nossos dados demonstram que shizukaol D exerceu um efeito inibidor sobre o crescimento de células de cancro de fígado de uma forma dose e dependente do tempo, que foi, em parte, como um resultado da sua modulação de a via de sinalização Wnt.
Informações de Apoio
S1 Fig. A massa spectrometryof shizukaol D.
doi: 10.1371 /journal.pone.0152012.s001
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S2 Fig. Os espectros de 1H NMR de shizukaol D.
doi: 10.1371 /journal.pone.0152012.s002
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S3 Fig. A HPLC de shizukaol D.
doi: 10.1371 /journal.pone.0152012.s003
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Reconhecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Chave Sci-Tech Nacional Projeto especial da China (2013ZX10002010) ea National Science Foundation Natural da China (no. 81301855). Os financiadores deste estudo não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.