Abstract

A validação de biomarcadores candidatos muitas vezes é dificultada pela falta de um meio confiável de avaliar e comparação do desempenho. Apresentamos aqui um conjunto de referência de amostras de soro e plasma, para facilitar a validação de biomarcadores para o câncer pancreático ressecável. O conjunto de referência inclui uma grande coorte de pacientes com câncer pancreático fase I-II, recrutados a partir de 5 instituições diferentes, e os grupos de controlo relevantes. Nós caracterizado o desempenho do melhor biomarcador sorológico atual para o câncer de pâncreas, CA 19-9, usando amostras de plasma de referência definido para fornecer um referencial para estudos de biomarcadores futuras e promover o nosso conhecimento do CA 19-9 no câncer de pâncreas em estágio inicial e os grupos de controle. CA 19-9 pâncreas distintos dos grupos pancreatite saudáveis ​​e crônicas com uma sensibilidade média e especificidade de 70-74%, semelhante aos estudos anteriores usando todos os estágios do câncer de pâncreas. pancreatite crônica não apresentaram CA 19-9 elevações, mas os pacientes com obstrução biliar benigna tiveram elevações quase tão altos quanto os pacientes com câncer. Ganhamos informações adicionais sobre o biomarcador, comparando os dois ensaios distintos. Os dois CA 9-9 ensaios concordaram bem no desempenho geral, mas divergiram nas medições de amostras individuais, potencialmente devido a diferenças sutis na especificidade do anticorpo como revelado pela análise de matriz de glicanos. Assim, as promessas conjunto de referência ser um recurso valioso para validação de biomarcadores e comparação, e os dados CA 19-9 aqui apresentada será útil para benchmarking e para explorar as relações de CA 19-9

Citation:. Haab BB , Huang Y, Balasenthil S, Partyka K, Tang H, Anderson M, et al. (2015) Caracterização definitiva do CA 19-9 em ressecável do cancro do pâncreas Usando um conjunto de referência de soro e amostras de plasma. PLoS ONE 10 (10): e0139049. doi: 10.1371 /journal.pone.0139049

editor: Zoltán Rakonczay Jr., da Universidade de Szeged, Hungria

Recebido: 18 de junho de 2015; Aceito: 07 de setembro de 2015; Publicação: 02 de outubro de 2015

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho está disponível sob a licença Creative Commons CC0 domínio público dedicação

Data Availability:. Estão disponíveis no Informações de Suporte Os dados CA19-9

Financiamento: Este trabalho foi financiado pela Detecção Precoce Rede de Investigação do Instituto Nacional do Câncer (U01CA152653 para BB Haab, RE Brand, e P. Allen, e U01CA111302 para AM Killary, ML Frazier, e S. Sen). Os autores também gostaria de agradecer à Rede de Investigação Detecção Precoce para fornecer as amostras pancreáticas utilizados para este estudo

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os avanços no conhecimento sobre o câncer de pâncreas geraram entusiasmo sobre as perspectivas de progressos significativos contra esta doença mortal [1, 2]. Entre outras áreas, o campo tem testemunhado avanços na compreensão da iniciação genética e progressão da doença [3], o papel do estroma na promoção do cancro e na obstrução terapias sistémicas [4-7], e o papel de plasticidade no cancro celular [8]. Enquanto esta informação será fundamental para o desenvolvimento de terapias eficazes, melhorias na sobrevivência dependerá também de uma melhor detecção, diagnóstico e tratamento decisões baseadas nas características individuais do paciente. Precisamos avançar nossa capacidade de detectar um câncer pancreático em um estágio inicial, quando é potencialmente curável por ressecção cirúrgica, e precisamos de melhores maneiras de determinar a rota de atendimento que será mais eficaz para cada paciente.

biomarcadores moleculares promessa de fornecer informações tão precisas e específicas do paciente [9], mas seu desenvolvimento e execução é um desafio e lento. Na pesquisa do câncer de pâncreas, um grande gargalo para o desenvolvimento de biomarcadores moleculares são os recursos limitados para avaliar e comparar biomarcadores candidatos usando amostras coletadas nas fases iniciais de desenvolvimento do câncer, quando a ressecção para a cura é possível. Uma quantidade significativa de tempo geralmente é necessária antes de uma avaliação precisa de um biomarcador é possível e antes que as decisões sobre novos investimentos podem ser feitos. Mais frequentemente do que não, que prometem resultados em estudos iniciais não são fundamentados em estudos de acompanhamento, ou a realização de um biomarcador não é consistente entre estudos [10, 11]. É necessária uma abordagem coerente e sistemática para avaliar candidatos a biomarcadores.

Para atender à necessidade de a avaliação de biomarcadores de câncer de pâncreas, um grupo colaborativo dentro da Detecção Precoce Research Network (EDRN) desenvolveu recentemente um conjunto de referência das amostras humanas . A motivação para o desenvolvimento do conjunto de referência foi o de permitir uma avaliação definitiva de candidatos a biomarcadores para o câncer de pâncreas, para fornecer comparações precisas entre biomarcadores candidatos e para testar o uso combinado de biomarcadores diferentes. Um conjunto comum de espécimes, coletados sob rigorosos padrões em várias instituições e compreendendo as populações de pacientes mais relevantes para as necessidades clínicas, é necessário para atingir estes objectivos [12]. Vários princípios orientaram a criação do conjunto. O conjunto foi incluem amostras de várias instituições, de modo que não é representativo de uma única área geográfica; coleta de amostras foi de seguir um procedimento único, detalhado norma de funcionamento, para evitar a introdução de viés para o conjunto; os pacientes deveriam incluir muitos com cancro operável, que é o mais difícil de detectar ainda a mais importante para o potencial impacto positivo; e os sujeitos controle foram para incluir tanto as pessoas saudáveis ​​e pacientes com condições benignas do pâncreas, porque certas condições benignas pode ser difícil de distinguir de câncer de pâncreas e poderia causar elevações nos biomarcadores de câncer.

Em relação à população de pacientes, nós escolhemos para montar amostras de pacientes com estágio I ou II do câncer como confirmado pela patologia cirúrgica. Tais pacientes são elegíveis para tratamento cirúrgico e, em média, têm resultados significativamente melhores do que o resto dos pacientes com câncer pancreático. Detecção de câncer ainda mais cedo, isto é, no carcinoma in-situ ou PanIN-3, seria preferível a detecção em estágio I porque os pacientes com estágio I tipicamente ainda desenvolver recorrência após a cirurgia. Actualmente não temos uma maneira de confirmar rotineiramente a presença de PanIN-3, então a montagem de amostras de uma coorte de tais pacientes ainda não é possível. Uma abordagem alternativa utilizada anteriormente era montar amostras que tinham sido recolhidas antes do diagnóstico de câncer pancreático, identificados através da análise das informações de acompanhamento de estudos maciças de saúde pública para encontrar indivíduos que eventualmente desenvolveram câncer pancreático [13, 14]. Essas amostras são preciosos para explorar a viabilidade do rastreio para o cancro, mas eles não são concebidos para testar para a detecção prévia para o estágio I ou II, porque o estágio da doença não é conhecida. Além disso, por causa da dificuldade na obtenção de tais amostras, que normalmente são persistido por apenas um pequeno número de estudos. Por isso, prosseguiu a montagem de um conjunto de amostras que poderiam ser usados ​​para muitos estudos e que seria relevante para uma meta importante no tratamento do câncer de pâncreas, a detecção de mais casos de câncer em um estágio que é elegível para a cirurgia.

a 19-9 ensaio CA é o melhor biomarcador sorológico atual para o câncer de pâncreas. O anticorpo monoclonal CA 19-9 foi produzido contra uma linha celular de cancro colorrectal [15], e o antigénio liga-se uma estrutura de hidrato de carbono ligado a uma variedade de proteínas e lípidos [16]. Embora os níveis sanguíneos estão fortemente associados com o cancro do pâncreas, que é elevado em 70-80% de pacientes com cancro pancreático, e em cerca de 20% dos pacientes com condições benignas do pâncreas [17] -sua desempenho não é suficiente para o diagnóstico do cancro, tal como o risco de ambos os falsos diagnósticos positivos e negativos falsos é inaceitavelmente alto. Cerca de 5% dos pacientes com cancro pancreático, não elevar CA 19-9, devido a mutações da linha germinativa resulta em incapacidade para produzir o glicano [18], e um outro grupo de doentes não elevar CA 19-9 por razões desconhecidas. As elevações não específicos em CA 19-9 resultado principalmente da danificação do ducto biliar ou porções dos ductos pancreáticos que são revestidas com o antigénio CA 19-9. Novos biomarcadores para o diagnóstico de câncer resectable deve executar melhor do CA 19-9, tanto na sensibilidade e especificidade, seja como um único biomarcador ou, mais provavelmente em combinação.

Os objetivos do presente estudo foram 1) determinar a realização de CA 19-9 no conjunto de referência; 2) definir mais claramente o desempenho do CA 19-9 para a doença em estágio I-II e em referência às condições potencialmente confusão de obstrução biliar benigno e pancreatite crônica; e 3) comparar o desempenho e definir as origens das diferenças entre distintas CA 19-9 ensaios. O primeiro objetivo era necessário dar um ponto de referência pelo qual podemos comparar e avaliar candidatos a biomarcadores. O segundo objetivo foi necessário porque muitos dos estudos anteriores do CA 19-9 foram fortemente ponderada em direção câncer em estágio final, principalmente porque as amostras de pacientes com câncer em estágio final são mais facilmente disponíveis. Os pacientes com doença em estágio I-II têm o potencial para melhores resultados por meio de cirurgia, de modo a detecção precoce e preciso desse nível de doença é extremamente importante. O terceiro gol foi necessária porque os estudos anteriores do CA 19-9 no câncer pancreático tem resultados divergentes, provavelmente devido a diferenças nas especificidades dos anticorpos [19] ou diferenças nas plataformas de ensaio. É importante compreender as implicações dessas diferenças para as decisões para pacientes individuais. Além disso, mais informações sobre os glicanos ligados por cada anticorpo CA 19-9 potencialmente poderia ajudar a caracterizar os glicanos produzidos por pacientes com câncer e formular estratégias para a detecção de uma maior percentagem de pacientes do que possível agora.

Materiais e métodos

Os critérios de elegibilidade

Cada site conduzido coleta de amostras usando um protocolo e formulário de consentimento por escrito de que foram aprovação pela Institutional Review Board. Os indivíduos foram obrigados a fornecer por escrito, o consentimento informado. Os sites que participam na recolha da amostra eram da Universidade de Pittsburgh Medical Center, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, da Universidade de Michigan, a Universidade de Nebraska, e Saúde da NorthShore University (anteriormente conhecido como Evanston Northwestern Healthcare). Os seguintes critérios de inclusão foram necessários para os casos de cancro do pâncreas e controles. Os grupos controle incluiu pacientes crônicos pancreatite, pacientes obstrução biliar benignos agudos e indivíduos saudáveis.

casos de câncer pancreático.

Os indivíduos foram submetidos a ressecção pancreática curativo para um adenocarcinoma incluindo margens negativas e de preferência Fase 1 ou 2A (ausência de metástases linfáticas).

No antecedentes de qualquer outra doença maligna, exceto câncer de pele não melanoma por dez anos.

casos pancreatite crônica.

All sujeitos devem ter tido pelo menos dois dos critérios radiológicos listados abaixo, a menos que um sujeito tinha uma história de insuficiência pancreática exócrina, caso em que era necessário apenas um critério radiológico.

Ultra-sonografia abdominal que é consistente com pancreatite crónica por critérios radiológicos convencionais

abdominal TC consistente com pancreatite crónica por critérios radiológicos padrão (ou seja, calcificações, ducto pancreático dilatado, contorno irregular da glândula, lesões císticas).

colangiopancreatografia retrógrada endoscópica (CPRE) exame consistente com pancreatite crónica por critérios radiológicos convencionais (dilatada ducto pancreático principal tortuoso com ramos secundários irregulares, cálculos intraductal).

endoscópica ultra-som consistente com pancreatite crónica por critérios ultrassonográficos padrão.

calcificações pancreáticas identificadas na planície filme do abdômen.

Todos os indivíduos tinham um estudo de imagem do pâncreas dentro de 3 meses da inclusão no estudo que não sugerem uma massa pancreática.

Todos os indivíduos apresentaram uma história clínica estável em relação ao ano passado com nenhuma suspeita de câncer (perda de peso, icterícia, ou alteração dos sintomas abdominais).

Todos os indivíduos não tinha história prévia de qualquer outra doença maligna, exceto câncer de pele não-melanoma para o passado dez anos

Todos os indivíduos não tinham história familiar de câncer de pâncreas

benignos casos de obstrução aguda biliar

Todos os sujeitos preencheram todos os seguintes critérios clínicos…:

Elevação do nível de bilirrubina sérica maior que 2,0 mg /dL

sistemas biliares extra-hepáticas Dilated demonstrado no estudo de imagem

amostra de sangue obtida antes de qualquer intervenção corretiva.

Todos os indivíduos tinham obstrução biliar, que foi de etiologia benigna tal como a pedra ducto biliar comum ou estenose biliar benigna.

Os pacientes com colangite esclerosante primária (PSC) foram excluídos.

All indivíduos tinham um estudo de imagem completo realizado do pâncreas que não sugerem um câncer pancreático, como uma lesão de massa discreta.

Todos os indivíduos não tinha história prévia de qualquer outra doença maligna, exceto cancros não de pele melanoma nos últimos dez anos.

Todos os indivíduos não tinham história familiar de câncer de pâncreas.

controles saudáveis.

Todos os sujeitos preencheram os seguintes critérios.

Idade , raça e sexo correspondentes a casos de câncer de pâncreas qualificados.

No histórico familiar de câncer de pâncreas.

No história pessoal de pancreatite aguda ou obstrução biliar, tal como definido acima.

No dor abdominal concorrente.

Sem perda de peso inexplicada concorrente.

No antecedentes de qualquer outra doença maligna, exceto câncer de pele não-melanoma nos últimos dez anos.

não houve estendida seguir-se para além do momento em que as amostras foram enviadas para o final do período de recolha. Embora exista a possibilidade de que um ou mais dos controlos tinham cancro incipiente no momento da recolha da amostra, o efeito sobre o estudo provável seria negligenciável. Devido à forma como rara a doença é na população em geral, com um risco de tempo de vida de 1 em 71 pacientes, seria apenas prever-se que, no máximo, um destes pacientes em um risco da população em geral para PC nunca vai desenvolver um câncer em sua vida -time.

soro e coleta de plasma

Todas as coleções ocorreu após consentimento informado dos participantes e antes de qualquer cirurgias ou procedimentos. As amostras foram coletadas a partir de 21 de fevereiro de 2005 a 20 de Abril de 2011, e os experimentos foram realizados em 2013 e 2014. Todas as amostras de sangue foram colhidas de acordo com o procedimento operacional padrão EDRN. Todas as amostras foram congeladas a -70 ° C ou menos dentro de 4 horas de tempo de recolha. Quatro ml de soro e 2 mL de plasma (usando EDTA como anticoagulante) foram enviados a partir de sites para NCI biorrepositório participação em Frederick, Maryland. As amostras foram transferidas para o repositório de um modo que impedido o descongelamento utilizando técnicas transportador aprovado. As alíquotas foram enviadas em gelo seco para os locais que executam o CA 19-9 análises, e não há aliquotas foram descongeladas mais do que três vezes o total antes da utilização.

Os controlos saudáveis ​​foram recolhidas a partir de 4 para fora dos locais com 5 contribuições dos controles correspondentes às contribuições globais de cada local (Tabela 1). Nós monitoramos o recrutamento de controle para garantir que havia correspondência razoável dos controles para os casos em idade, raça e sexo, mas nós relaxamos o algoritmo um pouco com a pancreatite crônica devido à idade mais precoce de início em relação ao câncer de pâncreas.

Definições de estágios tumorais

os adenocarcinomas pancreáticos foram encenadas de acordo com os critérios do American Joint Committee on Cancer (AJCC) manual Staging 7

ª edição. Foram utilizadas as seguintes definições de extensão do tumor e do estado nodal: T1 = Tumor limitado ao pâncreas ≤ 2 cm em sua maior dimensão; T2 = Tumor limitada ao pâncreas 2 cm na sua maior dimensão; T3 = tumor se estende para além do pâncreas, mas sem envolvimento do eixo celíaco ou a artéria mesentérica superior; N0 = Sem metástase em linfonodo regional; e N1 = Regional metástases em linfonodos. As etapas foram definidas como: Estágio 1a = T1N0M0; Fase 1b = T2N0M0; Fase 2a = T3N0M0; e Fase 2b = T1-3N1M0.

CA 19-9 ensaios

Dois laboratórios corriam CA 19-9 ensaios em alíquotas de amostras de plasma que foram recebidas, sem qualquer informação de identificação. Um ensaio, o kit de EIA-1474 [Lote # RN-45868] de DRG International (Springfield, NJ), foi executado no laboratório do Dr. Killary de acordo com métodos anteriormente publicados [20]. O outro ensaio foi desenvolvido e executado no laboratório do Dr. Haab usando um protocolo publicado anteriormente [19, 21, 22]. No texto subsequente, que se referem ao primeiro como “Ensaio 1” e a segunda como “Ensaio 2. O kit” DRG nominalmente está aprovada apenas para soro, mas anteriormente foi utilizado para o plasma para obter resultados semelhantes aos obtidos usando soro [20]. Neste estudo, foram validados ainda mais a sua utilização com o plasma, confirmando equivalência estatística com o Ensaio 1 e com a plataforma Abbott Architect (ver resultados). Um subconjunto das amostras (n = 82) foi analisada utilizando o ensaio de CA 19-9 no Architect Immunoassay plataforma Abbott na Rede de Saúde da Universidade de Toronto, Canadá. Consulte o arquivo S1 para obter informações adicionais sobre os protocolos e as características do ensaio.

A análise estatística

Para cada grupo, foram comparadas as distribuições CA19-9 entre os dois CA19-9 ensaios utilizando o t pareado -test (em CA19-9 transformou-log) e o teste de classificações de Wilcoxon Signed. O coeficiente de correlação de Spearman entre os dois ensaios também foi computado. Para análises descritivas, geramos um boxplot para cada ensaio CA19-9 e cada grupo; as médias geométricas de ensaios individuais e seus intervalos de confiança Wald 95% também foram computados.

Para comparações de pares entre a obstrução biliar saudável, benigna, pancreatite crónica, e grupos de câncer, foi realizada de duas amostragens testes t ( sobre os valores CA19-9 transformou-log) e os testes de Wilcoxon Rank Sum. Além disso, para cada grupo de controlo e emparelhado caso, foi gerada uma estimativa não paramétrico das características de funcionamento de recepção curva (ROC) [23] e a área-sob-a-curva (AUC) para os ensaios individuais e CA19-9 para uma combinação linear dos valores transformados em logaritmo de os dois ensaios de derivados de modelos de regressão logística. O procedimento de bootstrap com reamostragem 500 vezes foi utilizado para a construção de intervalos de confiança das AUC de ensaios individuais, das diferenças em AUC entre os dois ensaios de CA19-9, e de a diferença na AUC entre os ensaios individuais e CA19-9 os ensaios combinados.

Para os ensaios individuais CA19-9, examinámos as sensibilidades e especificidades de corte utilizando o clínico de 37 U /mL, bem como um corte derivado que maximiza a soma de sensibilidade e especificidade. Nós também estimou sensibilidade e especificidade com base em combinações dos dois ensaios CA19-9 usar e /ou regras. O procedimento de bootstrap com reamostragem 500 vezes foi utilizado para a construção dos intervalos de confiança para a sensibilidade, especificidade e a soma de sensibilidade e especificidade.

experimentos e glycan array análise

O laboratório central para Glycan matriz Synthesis (parte do Consórcio para Glycomics funcionais, CFG) da Universidade de Emory realizados os experimentos de matriz de glicanos e análises primárias. A versão matriz usada aqui foi de 5,1, contendo 610 glicanos únicas. Os experimentos seguiram protocolos publicados [24]. Utilizou-se o programa de GlycoSearch [25] para analisar os dados de matriz de glicanos.

Resultados

do CA 19-9 no conjunto de referência

O conjunto de referência incluiu amostras de soro e plasma coletadas em cinco instituições diferentes no âmbito de um procedimento operacional padrão comum. As amostras são de 98 pacientes com câncer de pâncreas fase I-II, 62 pacientes com pancreatite crônica, 31 pacientes com obstrução biliar benigna, e 61 indivíduos de controle saudáveis ​​(Tabela 1).

Foi determinada a CA 19-9 valores nas amostras de plasma utilizando dois ensaios diferentes, um de um kit disponível comercialmente (referido como Ensaio 1), e a outra um sistema interno (referido como Ensaio 2). Foram utilizados dois ensaios diferentes, a fim de contabilizar potenciais diferenças entre ensaios, tendo em conta as observações anteriores de tais diferenças [26, 27]. Testamos a confiabilidade dos ensaios utilizados aqui por comparações com uma plataforma automatizada (Abbott Architect CA 19-9 Immunoassay) por 82 das amostras distribuídos em grupos de pacientes. Os valores dentro de cada um dos grupos de pacientes foram estatisticamente equivalentes entre todos os três ensaios, excepto para níveis ligeiramente mais elevados entre controlos saudáveis ​​para o ensaio 2 em relação com o ensaio de Abbott (Tabela A1 no ficheiro S3), e a discriminação de cancro a partir dos grupos de controlo foi de estatisticamente equivalentes entre todos os ensaios (Tabela B no arquivo S3 e Arquivo S1). Este resultado confirma a fiabilidade dos resultados obtidos utilizando ensaios 1 e 2 e a sua equivalência geral com plataformas automatizadas.

O primeiro examinadas as distribuições de valores para cada um dos ensaios nos diferentes grupos de pacientes (Figura 1A) . Os indivíduos saudáveis ​​e doentes com pancreatite crônica tiveram os mais baixos níveis; pacientes obstrução biliar benignos tinham níveis significativamente mais elevados (p-valor é inferior a 0,0001 e igual a 0,006 pelo teste de Wilcoxon Rank Sum, relativamente a indivíduos saudáveis ​​para o ensaio 1 e 2, respectivamente); e doentes com cancro tinham os níveis mais elevados (p 0,0001 em relação a indivíduos saudáveis ​​com base em ambos o teste t ou o teste de Wilcoxon Rank Sum para cada ensaio). Os dois ensaios mostraram tendências equivalentes. Os resultados detalhados sobre as médias geométricas dos ensaios individuais e os seus intervalos de confiança de 95% são apresentados na Tabela C em Ficheiro S3, e os valores de p para as comparações entre os grupos de pacientes são apresentadas na Tabela D no ficheiro S3.

A) CA 19-9 níveis em cada grupo. Nós apresentamos os valores de transformação logarítmica para melhor visualizar todas as gamas de valores. As caixas indicam os quartis das distribuições, as linhas horizontais nas caixas indicam as medianas, e as linhas tracejadas dar os intervalos, sendo os valores individuais indicados pelos círculos. A1, Ensaio 1; A2, Ensaio 2. B-D) do receptor-operador de característica (ROC), comparando todos os doentes com cancro pancreático para os grupos de controlo indicados. As lendas especificar a área sob as curvas (AUCs) para cada ensaio, com os intervalos dos intervalos de confiança de 95%.

Nós perguntou se os níveis de CA 19-9 foram diferentes entre o mais cedo estágios (fases Ia, Ib e IIa) e os pacientes em estágio posterior (IIb fase). Os níveis de CA19-9 não foram significativamente diferentes entre os dois grupos (p-valores com base em t-teste e teste de Wilcoxon Rank Sum); e os valores de área sob a curva (AUC) em análise-receptor-operacional característica (ROC) também não foram estatisticamente significativamente diferente entre os grupos para a diferenciação de câncer de indivíduos saudáveis ​​(S2 arquivo). Portanto nas análises posteriores foram agrupados todos os pacientes com câncer juntos.

Foi utilizado o AUC para determinar a capacidade da CA 19-9 para distinguir os grupos. Os ensaios CA19-9 foram melhor na hora de separar o câncer de grupos de controle saudáveis ​​(AUC iguais a 0,78, com IC 95% (0.70,0.84) para o Ensaio 1, e 0,76 (0,68, 0,83) para o Ensaio 2) (Fig 1B). Os ensaios também tiveram um bom desempenho na separação do cancro a partir de grupos de pancreatite crónica (AUCs igual a 0,73 com 95% CI (0,65, 0,80) para o Ensaio 1, e 0,77 (0,69, 0,83) para Ensaio 2) (Fig 1C), mas eles não foram eficazes na separação do cancro dos grupos obstrução biliar benigno (AUC igual a 0,56 com 95% CI (0,47, 0,67) para o Ensaio 1, e 0,62 (0,45, 0,71) para Ensaio 2) (Figura 1D). Não houve diferenças estatisticamente significativas na AUC entre os ensaios 1 e 2 em cada uma dessas comparações.

Para relacionar mais diretamente estes resultados para a prática clínica, nós examinamos as sensibilidades e especificidades dos ensaios CA19-9 no típico de corte utilizado, na prática, 37 U /ml, e em pontos de corte que deram quantias máximas de sensibilidade e especificidade (Tabela 2). No U /mL de corte 37, a média da sensibilidade acrescida especificidade variaram de 70 a 74 para a discriminação de cancro a partir dos grupos de controlo saudáveis ​​e pancreatite crónica. Para ambos os ensaios, um limiar inferior de sensibilidade grandemente aumentada com uma redução menor na especificidade, resultando em uma melhoria estatisticamente significativa na sensibilidade e especificidade média (Tabela 2).

Paciente-a-doente comparação do CA 19-9 ensaios

a análise acima mostra que o CA 19-9 desempenho é semelhante entre Ensaio 1 e Ensaio 2, quando avaliada sobre todos os pacientes, mas também queríamos saber como os dois ensaios de comparação para pacientes individuais. Uma comparação directa dos valores obtidos para cada paciente mostrou diferenças importantes para determinados pacientes (Fig 2). As discrepâncias entre os ensaios foram uniformemente distribuída; em alguns casos de Ensaio 1 foi maior, e em outros casos de Ensaio 2 foi maior.

A CA 19-9 valores de todos os sujeitos de Ensaio 1 e Ensaio 2 foram traçados em relação ao outro de log-transformados. Cada círculo indica uma amostra individual do paciente. A linha de tendência é o melhor ajuste dos mínimos quadrados linear e coeficiente de correlação de Spearman é de 0,74.

Em um nível prático, discrepâncias entre os ensaios única questão em relação aos pontos de corte utilizados na prática clínica. Portanto interrogado quantas vezes o status de uma amostra foi diferente entre Ensaio 1 e Ensaio 2 em relação ao ponto de corte (Tabela 3). Usando 37 U /mL como ponto de corte, 8 dos 53 pacientes com câncer (15%) elevados no ensaio 1 foram baixas em Ensaio 2, e 7 dos 52 pacientes com câncer (14%) elevados no Ensaio 2 eram baixos no Ensaio 1. sete dos 128 sujeitos de controlo (5%) não elevados no ensaio 1 foram elevados no ensaio 2, e 9 das 130 controlos (7%) não elevados no ensaio 2 foram elevados no Ensaio 1. as discrepâncias também estavam presentes utilizando um 100 L /cutoff mL. Assim, embora os dois ensaios dão geralmente o mesmo desempenho global, as diferenças eram evidentes para os pacientes individuais. Cada ensaio, ocasionalmente, deu resultados positivos falsos negativos ou falsos, em comparação com o outro.

Testando os ensaios CA 19-9 em combinação

Nós avaliamos se uma combinação dos dois ensaios deu melhores resultados do que quer isoladamente ensaio. Este conceito baseia-se na premissa de que, se os anticorpos em cada ensaio detectar optimamente subconjuntos distintos de pacientes, uma maior percentagem de pacientes seria detectada se os ensaios foram combinadas. Foi utilizada a regressão logística para derivar combinações lineares dos valores de transformação logarítmica dos dois ensaios, e avaliadas as AUC para a separação de câncer de cada um dos grupos de controlo com base na pontuação combinada. Combinando os dois ensaios não mostrou melhoria significativa para a distinção do cancro da saudável ou os grupos pancreatite crónica (Fig 1 e Tabela 2). Além disso, utilizando regras de combinação simples com base em E ou OU operadores, em ambos os pontos de corte optimizados ou o padrão de corte 37 U /mL, houve melhoria mínima na sensibilidade média e especificidade relativa para os ensaios individuais (Tabela 2). Portanto, embora os dois ensaios potencialmente identificar conjuntos de pacientes não sobrepostas (como sugerido pela ausência de correlação perfeita na figura 2), que não contribuem informação complementar, específico para o cancro.

diferenças de especificidade entre o CA 19-9 anticorpos

para mais informações sobre a origem das diferenças entre os ensaios poderia ser útil para optimizar a detecção de pacientes com câncer, minimizando a detecção de indivíduos controle. O antígeno nominalmente reconhecida pela CA 19-9 anticorpos é um glicano chamado sialil Lewis A [16], com a sequência Siaα2,3Galβ1,3 (Fucα1,4) GlcNAc, onde Sia é o ácido siálico, Gal é galactose, Fuc é fucose, e GlcNAc é N-acetilglucosamina. Sialil Lewis A é um membro do sistema de grupo sanguíneo de Lewis de glicanos em células vermelhas do sangue e uma variedade de glicoproteinas e glicolipidos [22, 28]. Embora sialil Lewis A é a principal glicano ligado por CA 19-9 anticorpos, outros glicanos pode ser ligado [19, 29]. Uma poderosa ferramenta para obter mais informação sobre o que outros glicanos um anticorpo liga-se à matriz de glicano [24, 30], o que permite as medições da ligação de uma proteína de muitas glicanos diferentes em paralelo. Por isso, dados de matriz de glicano obtido para os anticorpos utilizados nos ensaios 1 e 2.

Ambos os anticorpos ligados a canónica CA 19-9 antigénio-sialil Lewis A, mas com diferenças (Figura 3 e Figura 4). O anticorpo de Ensaio 2 (9L426) se liga mais fortemente do que o anticorpo de Ensaio 1 a dimérica sLea-Lea, como evidenciado pela melhor sinal à baixa concentração de 0,2 ug /ml, mas não mostrou qualquer ligação com a variante de ácido siálico Neu5Gc. É também ligado a sialil Lewis C (não fucosilados sialil Lewis A) na concentração relativamente elevada de 20 jig /mL. Em contraste, o anticorpo de Ensaio 1 (apenas o anticorpo de detecção foi disponíveis a partir do kit comercial) mostrou uma maior ligação a Neu5Gc, mas nenhuma ligação adicional para SLEC. Um terceiro anticorpo (clone M081221, Fitzgerald, Acton, MA), não é usado no ensaio 1 ou 2, mas incluídos para comparação, outros glicanos ligados em adição àqueles exibindo o antigénio CA 19-9 canónica. Este anticorpo reagiu com cross-glicanos contendo sialil Lewis X, um isómero de sialil Lewis A, em que a fixação da fucose e galactose para a estrutura do núcleo é ligado. Assim, os anticorpos CA 19-9 têm especificidades que se sobrepõem, mas distintas, incluindo a ligação a algumas estruturas para além do antígeno canônica CA 19-9.

Cada anticorpo foi incubada a 2 mcg /mL em uma matriz de glicanos contendo 610 glicanos distintas (array versão glicano 5.1 do Consórcio para Glycomics funcional). O gráfico inclui os glicanos que mostra os níveis mais elevados de ligação por qualquer dos anticorpos. Para cada anticorpo, normalizamos os valores de fluorescência matérias para definir o valor mais alto para 1. A lista especifica os glicanos incluídos na trama, e os rótulos acima das colunas indicam o motivo principal em cada glicano. DRG é o anticorpo de Ensaio 1, 9L426 é o anticorpo de ensaio 2, e M081221 é uma outra Lewis anti-sialil Um anticorpo incluído para comparação.

para cada anticorpo, a intensidade da ligação aos glicanos indicados, em