Abstract

MicroRNA 130b (miR-130b) é significativamente desregulada em vários tipos de tumores humanos. Neste estudo, utilizando um ensaio de microarray, que caracterizou a regulação positiva da expressão de miR-130b em amostras de cancro colorectal (CRC). No entanto, não há conhecimento limitado sobre os papéis de expressão de miR-130b aberrante em CRC. Os nossos estudos em células de CRC demonstrado que o miR-130b diminui significativamente a migração celular e invasão, mas não tem efeitos evidentemente sobre a proliferação celular e a apoptose. Nas células de miR-130b CRC e os espécimes de CRC sobre-expressão, observou-se uma diminuição do nível de proteína de integrina β1, que é considerado como uma molécula-chave envolvido na motilidade celular. A segmentação da região 3′-UTR do gene de integrina β1 por miR-130b foi revelada utilizando um ensaio de repórter de luciferase. A regulação da integrina β1 por miR-130b foi ainda mostrado usando os imita miR-130b e o inibidor de miR-130b. A motilidade deficiente das células superexpressão de miR-130b é recuperada em parte, pela expressão de integrina β1 a que falta a 3′-UTR. Além disso, o knockdown da integrina β1 também dá origem a uma redução na migração celular e invasão, que é semelhante à motilidade impedido devido à sobre-expressão de miR-130b em células de CRC. Além disso, as expressões inversos de miR-130b e β1 integrina foram observadas em amostras de CRC. Em resumo, estes dados demonstram que o miR-130b regula negativamente o seu alvo β1-integrina, que conduz à migração auditivos e invasão de células de CRC

citação:. Zhao Y, Miao L, Li Y, Isaji t, J Gu , Li J., et al. (2014) Migração microRNA 130b Suprime e invasão de células de câncer colorretal através da regulação negativa do integrina β1. PLoS ONE 9 (2): e87938. doi: 10.1371 /journal.pone.0087938

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 07 de novembro de 2013; Aceito: 03 de dezembro de 2013; Publicação: 03 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China Grant 81101859, National Natural Science Foundation da China Grant 81270379, National Natural Science Foundation da China Grant 81070231 e Pequim Natural Science Foundation 5102039. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os microRNAs (miRNAs) são curtos não- codificação RNAs de 24 a 25 nucleótidos que medeiam silenciamento de genes através de hibridação imperfeita para 3 ‘não traduzida (3’-UTR) em mRNAs alvo [1]. MiRNAs desempenham papéis importantes nas actividades biológicas virtualmente todos os mamíferos e em outros organismos multicelulares [2]. Além disso, tem sido relatado que miARNs influenciar vários processos do cancro relevantes, tais como migração, proliferação. Mais importante ainda, as moléculas de microRNA já estão entrando na clínica como biomarcadores de diagnóstico e prognóstico para a estratificação dos pacientes e também como alvos e agentes terapêuticos [3]. Recentemente, miR-130b é revelado como um dos novos miRNAs relacionados ao tumor e tem significativamente desregulada em tumores por uma meta-análise abrangente do miRNA conjuntos de dados de expressão de microarranjo, que compreende 33 comparações e cerca de 4.000 amostras de tumores e correspondentes nontumors [4]. Assim, miR-130b foi encontrado regulada em vários tipos de câncer: câncer gástrico [5], [6], melanoma maligno cutâneo [7], cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas [8] e cancro da bexiga [9]. Juntos, estima-se que o miR-130b desempenha um papel-chave durante oncogênese.

O câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais comumente diagnosticado em homens ea segunda em mulheres em todo o mundo. Aproximadamente 608.000 mortes por cancro colorectal são estimados em todo o mundo, tornando-se a quarta principal causa de morte por câncer [10]. Atualmente, um dos obstáculos no tratamento do câncer é a alta taxa de metástase do tumor. O processo metastático se segue de uma série de passos: primeiro, as células cancerosas no interior do tumor primário romper com as células vizinhas e invadem a membrana basal. Esta invasão local pode, freqüentemente, ser desencadeada por sinais contextuais que causam as células cancerígenas a passar por uma transição epitelial-mesenquimal (EMT) [11]. Após intravasamento, as células podem extravasar desde a circulação para o tecido circundante, onde eles podem permanecer dormentes ou iniciar e manter o crescimento de formar metástases angiogénicas [12], [13]. A metástase é a principal causa de morte em muitos cancros, incluindo CRC [14] – [16]. Portanto, é necessária uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares metástase subjacente para facilitar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas eficazes para pacientes com CCR.

Em nosso estudo, comparamos a expressão miRNA em amostras de pacientes com CCR utilizando um microarray microRNA e observou-se a regulação positiva significativa de miR-130b expressa nas amostras de CRC. Para obter insights sobre os papéis de miR-130b no CRC, nós investigamos os efeitos de miR-130b em células CRC e amostras de CRC. Nossos dados sugerem que a integrina β1 é um gene alvo de miR-130b ea regulação negativa da integrina β1 por miR-130b leva à migração prejudicada e invasão das células CRC.

Procedimentos Experimentais

Clinical espécimes

O câncer colorretal e de amostras de tecido de controlo adjacentes foram obtidos de 33 pacientes do hospital de Beijing, Ministério da Saúde (Pequim, China) após a ressecção cirúrgica. Os tecidos de tumor e tecidos normais adjacentes foram congelados em azoto líquido após ressecção. Nenhum paciente no presente estudo recebeu quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia. Todos os pacientes fornecidos consentimento informado por escrito para o uso de seus tecidos, de acordo com a Declaração de Helsinki. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Pequim Instituto de Geriatria, Ministério da Saúde de Ética.

análise MicroRNA microarray

RNAs Pequenos foram isoladas a partir de tecidos tumorais e tecidos normais adjacentes. Os procedimentos de controle de qualidade, de rotulagem, de hibridação e digitalização foram realizadas por CapitalBio (Pequim, China), utilizando GeneChip miRNA chip de matriz V1.0 da Affymetrix. genes diferencialmente expressos entre os tecidos de tumor e tecidos normais adjacentes foram analisados ​​utilizando o software SAM 3,02. MiRNAs que preencheram os critérios de valor de q (%) ≤5 e dobre mudança ≥2 ou dobram mudança ≤0.05 entre os grupos foram consideradas significativamente diferentes. mapa de calor foi realizada utilizando Cluster 3.0 software pacote. Os dados apresentados neste estudo foram depositados no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) e são acessíveis através do número de acesso GEO GSE53592.

cultura celular

A linhas celulares de cancro colorrectal humano SW-480 e SW-620 foram comprados a partir do Centro de Recursos celular, IBMS, cames /UPMS e passou, em menos de 6 meses. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco, Paisley, Reino Unido) com 10% de FBS (Gibco, Paisley, Reino Unido) e 2 mmol /l de L-glutamina (Gibco, Paisley, UK), 100 U /mL de penicilina (Gibco, Paisley, UK), e 100 ug /ml de sulfato de estreptomicina (Gibco, Paisley, UK).

clonagem Pri-miR-130b, a produção de lentivírus e transdução

O gene microRNA 130b primária humana (-miR-130b PRI) foi amplificado por PCR a partir de ADN genómico humano utilizando os seguintes iniciadores: 5′-Adiante ATATTCTCGAGGGGGATCTCCC-3 ‘e 5′-Reversa ATATCGGATCCTCTTACCCCAG-3’, e depois subclonado no vector pLVX-IRES-Hyg ( TaKaRa, Dalian, China) para gerar pLVX-miR-130b. As partículas virais foram colhidas 48 h após a transfecção de pLVX-miR-130b em células HEK-293T usando o mix de embalagens Lenti-HT (Takara, Dalian, China). As células SW480 foram infectados com o lentivírus recombinante colhidas na presença de 6 ug /ml de polibreno (Sigma, St. Louis, EUA). As células SW480 foram mantidas em meio de crescimento completo na presença de 1 mg /ml de higromicina (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha). O fragmento amplificado por PCR de pri-miR-130b também foi subclonado no vector lentiviral pWPI (Addgene, Cambridge, MA, EUA), para gerar pWPI-miR-130b. O vector pWPI vazio, que codifica para a proteína fluorescente verde (GFP), foi utilizado como controlo. As partículas de vírus foram colhidas tal como descrito anteriormente. As células SW620 que expressam estavelmente GFP foram seleccionados por fluorescentes activadas (SCAF), com a utilização de um separador de células Vantage SE diva (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA).

ARN de transcrição invertida, de separação de células e quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR)

O ARN total, incluindo pequenos RNAs, foi extraído das amostras clínicas ou de células de CRC com um kit de isolamento de miRvana MicroRNA (Invitrogen, Carlsbad, EUA) e submetido a transcrição reversa. qRT-PCR foi realizado usando-se com a mistura de SYBR Premix Ex Taq (Takara, Dalian, China) de acordo com as instruções do fabricante, e as amostras foram corridas num IQ5 multicolorido em tempo real do sistema de PCR de detecção (Bio-Rad, Hercules, EUA) . Foram utilizados os ciclos de reacção térmica de 95 ° C durante 30 s, e 45 repetições de 95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 20 s. Os iniciadores utilizados foram os seguintes: HSA-miR-130b directo 5′-GCCGCCAGTGCAATGATGAA-3 ‘de HSA-miR-130b reverso 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′; U6 directo 5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3 ‘; U6 reverso 5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3 ‘

repórter luciferase ensaio

A de comprimento completo não traduzida 3′-região (3′-UTR) fragmentos do gene de integrina β1 foram amplificados por PCR a partir de ADN utilizando iniciadores genómicos humanos directo 5′-GTACTGCCCGTGCAAATCCCACAAC-3 ‘e 5’-Reversa TGCTTTTCCTCAACTTCTTTAATC-3, e foram clonados em um vetor pMD18-T (Takara, Dalian, China). O

Sac

I-

Sal

produtos I-digeridos foram clonados em um pmirGlo Dual-luciferase expressão miRNA alvo vetorial (Promega, Madison, EUA) para formar 3′-UTR-luciferase vector repórter . As células SW480 foram co-transfectadas em placas de 24 poços utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, EUA) com o vector repórter 3′-UTR-luciferase e os miARNs indicados. Vinte e quatro horas após a transfecção, as actividades da luciferase Renilla pirilampo e foram medidos utilizando o ensaio consecutivamente luciferase dupla (Promega, Madison, EUA), de acordo com os protocolos do fabricante. Vector de controlo negativo foram gerados por clonagem do mesmo 3’UTR do gene da integrina β1 na orientação inversa. A actividade das amostras foi medida num Luminómetro GloMax 20/20 (Promega, Madison, EUA). A actividade da luciferase do pirilampo foi normalizada pela actividade da luciferase de Renilla para eficácia de transfecção.

transfecção celular

O plasmídeo usado para a expressão da integrina β1 a que falta a 3′-UTR (β1-ORF) foi descrito anteriormente [17]. Utilizou-se pWPI vector como um controlo. Os imita hsa-miR-130b, inibidor da HSA-miR-130b (anti-miR-130b), imita controlo e de siRNA contra β1 integrina [18] foram sintetizados por Ribobio (Guangzhou, China). As sequências usadas foram as seguintes: imita HSA-miR-130b, 5′-CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU-3 ‘; HSA-miR-130b inibidor, 5’-AUGCCCUUUCAUCAUUGCACUG-3 ‘; integrina siARN β1, (sentido) 5’-GGAACAGCAGAGAAGCUCA-3 ‘[18]; As células SW480 foram transfectadas utilizando RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, EUA) ou Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

ensaio de migração celular e invasão ensaio

migração celular ensaio foi avaliada usando câmaras transwell (8 mícrons, BD Bioscience, San Jose, EUA). 5 × 10

5 células foram colocadas dentro da câmara superior de cada pastilha, e 500 ul de meio completo foi adicionada ao fundo do poço. As células que não migraram foram removidos a partir das superfícies superiores dos filtros utilizando cotonetes de algodão, e as células que tinham migrado para a superfície inferior dos filtros foram fixadas com solução de paraformaldeído a 4% e coradas com violeta de cristal a 0,1%. Imagens de três campos aleatórios foram capturados de cada membrana, e o número de células migratórias foi contado. inserções semelhantes revestidos com Matrigel foram usadas para determinar o potencial invasivo.

proliferação celular ensaio

A proliferação celular foi determinada utilizando um composto tetrazólio [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio, sal interno (MTS) (CellTiter 96 Aqueous celular não radioactivo Ensaio de Proliferação) (Promega, Madison, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante . Resumidamente, nos tempos indicados, os ensaios são realizados por adição da CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent directamente aos poços de cultura, incubação durante 2 h e, em seguida, gravar a absorvância a 490 nm com um leitor de placas de 96 poços.

western blotting

As proteínas foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de PVDF (Millipore, Billerica, EUA). A membrana foi bloqueada com leite não gordo a 5% e incubadas com anti-ratinho β1 integrina (1/2500, BD Biosciences, San Jose, EUA), de ratinho anti-E-caderina (1/2000, BD Biosciences, San Jose, EUA), de coelho anti-caspase 3 (1/1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EUA), de coelho anti-caspase 8 (1/800, Millipore, Billerica, EUA) ou de murganho anti-GAPDH (1/10000, Sigma , St Louis, EUA) anticorpos.

a análise estatística

os dados são apresentados como a média ± sd A significância estatística entre os grupos foi avaliada por estudante do

t

-teste. Um valor de

P

. 0,05 foi considerado como significância estatística

Resultados

Detecção de aumento dos níveis de miRNA-130b no CRC espécimes

Usando um ensaio de microarray, caracterizamos expressão miRNA no cancro colorectal tecidos (CRC) e marchou tecidos normais adjacentes colhidas a partir de 3 pacientes (P1, P2 e P3). A caracterização dos pacientes de CRC é descrito na Tabela 1. Foram testados miARN expressam diferenciais usando o pacote de SAM. Os 31 miARNs significativamente regulados positivamente (fig. 1A) conjuntos de sondas (fold≥2) foram identificados nas amostras de CRC. E os 17 miARNs significativamente regulada negativamente foram apresentados na Tabela S1. Nas leituras de microarray, percebemos que miR-130b é um dos miRNAs significativamente upregulated. Um número cada vez maior de estudos relataram miR-130b como miARN relacionado com o tumor e miR-130b desempenha um papel importante durante a oncogénese [4]. Para entender melhor as suas funções possíveis no CRC, nós em primeiro lugar usado qRT-PCR para confirmar a expressão de miR-130b nos 3 pacientes com CCR (Fig. 1B). Consistente com as leituras de microarray na Fig. 1A, os resultados qRT-PCR revelou a expressão aumentada de miR-130b nos 3 CRC tecidos de tumor (Fig. 1B). Em seguida, gerado um vector lentiviral expressando 130b microARN primário (Lenti-pri-miR-130b) (fig. 1C painel superior), e construído SW-480 células com superexpressão estável do miR-130b (células Lenti-miR-130b) e o respectivo controlo (células Lenti por vetores). Verificou-se que os níveis do madura miR-130b estão significativamente aumentados em quatro colónias de células Lenti-miR-130b, em comparação com células Lenti do vector (Fig. 1C painel inferior).

A

, mapa de calor diagrama dos 31 miARNs significativamente elevados em tecidos de cancro colorectal em relação aos tecidos adjacentes correspondentes de controlo a partir de 3 pacientes (P1, P2 e P3). Os tecidos de controlo adjacentes são referidos N1, N2 e N3. Os tumores são referidos T1, T2 e T3. MiRNAs são mostrados em linhas. As amostras são exibidas em colunas. Vermelho na barra de cor indica maior expressão e azul indica menor expressão. MiR-130b (

Red Arrow

) é um dos miRNAs significativamente upregulated.

B

, expressões relativas de miR-130b (normalizados para U6) em tumores mais de tecidos de controle adjacentes (T /N) a partir de P1, P2 e P3, determinados por qRT-PCR (média ± sd; n = 3).

C

,

Painel superior

: Diagrama esquemático de um vector lentiviral pLVX-IRES-Hyg contendo o 130b microRNA primário (Lenti-miR-130b).

Baixa painel

: expressões relativas de miR-130b (normalizados para U6) em células SW480 que expressa de forma estável miR-130b (Lenti-miR-130b) ou controlo (Lenti-controle), examinado por qRT-PCR ( média DP ±; n = 3). Os quatro colônias de células Lenti-miR-130b são referidos 1,2,3,4.

miR-130b diminui a migração e invasão das células CRC

próxima analisou como miR-130b pode funcionar dentro de células de cancro colorrectal. As células Lenti por vectores e células Lenti-miR-130b foram utilizados para analisar os efeitos de miR-130b nas células CRC. As células foram primeiramente submetidas a ensaio de migração e invasão de ensaio, respectivamente. Observou-se que o miR-130b inibe significativamente a migração das células Lenti-miR-130b (Fig. 2a). Em seguida, examinaram o efeito de miR-130b na capacidade de invasão das células utilizando o sistema de ensaio de invasão de Matrigel. Consistente com o resultado do ensaio de migração, a invasividade é significativamente reduzida nas células Lenti-miR-130b (Fig. 2B). Interessante, não há diferença significativa na proliferação de células entre Lenti por vectores e células Lenti-miR-130b (Fig. 2C). Além disso, não observamos os óbvios diferentes níveis de apoptose caspase caspases- 3 e caspase 8 entre as células Lenti por vectores e células Lenti-miR-130b (Fig. 2D) de expressão. Todos estes resultados sugerem que a sobre-expressão de resultados miR-130b na motilidade celular diminuída de células de CRC, mas não tem nenhum efeito sobre a proliferação e a apoptose de células de CRC.

A, B

, Transwell migração (

A

) ea invasão (

B

) ensaios de células Lenti de controle e células Lenti-miR-130b (barra de escala = 100 mm; significa ± sd; n = 4; * ,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01). Imagens representativas de células migraram (

A

) e células invadidas (

B

) são mostrados.

C

, a proliferação de células-Lenti de controlo e células Lenti-miR-130b medidos por ensaio de MTS no decorrer do tempo de três dias (média ± D.P. .; n = 4).

D

, análises de Western blot de caspase-3 e caspase-8, em células de controlo e Lenti células Lenti-miR-130b a partir de três experiências independentes. GAPDH utilizado como controle de carga.

miR-130b suprime integrina β1 expressão através da sua 3′-UTR

Além disso, investigamos o mecanismo pelo qual miR-130b afeta a mobilidade das células CRC . Os nossos estudos anteriores mostraram que a modificação pós-translacional desempenha um papel importante na migração mediada por integrina [17], [19], [20]. As integrinas são uma família de moléculas de adesão celular que compreendem 18α e 8p subunidades que se combinam para, pelo menos, 24 heterodímeros. Mais importante ainda, o domínio citoplasmático de integrina β1 transduz sinais bidireccionais a partir de dentro da célula, regulando a conformação e de ligandos de afinidade de domínio extracelular (sinalização de dentro para fora), enquanto mediando a sinalização a jusante e interacções com o citoesqueleto (de fora para dentro de sinalização) [ ,,,0],21] – [23]. Então, integrina β1 é um regulador chave envolvidos na metástase

in vitro

e

in vivo

[24] – [27]. Neste estudo, verificou-se que a expressão ectópica de miR-130b nas células SW480 resulta em uma diminuição no integrina endógena β1 nível de proteína de quatro colónias Lenti-miR-130b por aproximadamente 50%, em comparação com a das células Lenti de vectores ( A Fig. 3A). O resultado consistente foi observada em células SW-620 com a sobre-expressão de miR-130b (Fig. 3B). No entanto, não existe qualquer alteração no nível de expressão de E-caderina (Fig. 3C), que é uma chave molecular envolvido na EMT. E, como mencionado antes, EMT é o passo inicial na metástase. Também examinámos a expressão de integrinas nas β1 3 pares de amostras submetidas a micro-arranjo mostrado na Fig. 1A. Consistente com os dados na Fig. 3A e a fig. 3C, a integrina β1 expressão da proteína é diminuída nos tecidos tumorais em comparação com os correspondentes tecidos normais adjacentes (Fig. 3D (a)), enquanto que não foi detectada nenhuma alteração evidente da expressão de E-caderina (Fig. 3D (b)) . É de notar que a diminuição do nível de proteína de integrina β1 foi detectado em células da sobre-expressão de miR-130b CRC (células Lenti-miR-130b) e espécimes de CRC assim. Por isso, procurou-se investigar se miR-130b pode regular integrina β1

A

,

Painel superior

:. Análise Western blot de integrina expressão da proteína β1 em Lenti-control e células Lenti-miR-130b (SW480 células) a partir de três experiências independentes.

Baixa painel

: análise de densitometria dos dados de Western blot normalizados com GAPDH (média ± D.P. .; n = 3; *,

P Art 0,05).

B

(

a

), expressões relativas de miR-130b (normalizados para U6) em células SW620 infectados com o vírus de controle de lenti ou LENTIVIRUS-miR-130b, examinado por qRT-PCR (média ± sd; n = 3). (

b

),

Painel superior

: análises de Western blot de integrina β1 expressão em Lenti-controle e células Lenti-miR-130b (SW620 células) de três experiências independentes.

Baixa painel

: análise de densitometria dos dados de Western blot normalizados com GAPDH (média ± D.P. .; n = 3; *,

P Art 0,05).

C

, expressão de proteína de E-caderina analisados ​​por immunoblot em células Lenti de controle e células Lenti-miR-130b de três experiências independentes. Os quatro colônias de células Lenti-miR-130b (SW480 células) são referidos 1,2,3,4. GAPDH utilizado como controlo de carga.

D

, os níveis de expressão de β1 integrina (

a

) e E-caderina (

b

) foram determinadas por análises de Western blot utilizando os combinados os tecidos adjacentes controle ( N) os tumores (T) dos pacientes com câncer colorretal 3 (paciente 1, paciente 2, e paciente 3). Cada ensaio foi repetido três vezes, independentemente. GAPDH utilizado como controlo de carga.

Em primeiro lugar, para examinar se o miR-130b foi capaz de interagir com o 3′-UTR de integrina β1, foi conduzida uma ensaios de repórter de luciferase nas células SW480. A completa 3’UTR do gene da integrina β1 foi clonado no Dual-luciferase repórter vector pmirGlo. As células SW-480 foram co-transfectadas com o vector contendo o pmirGlo 3′-UTR de integrina b1 e miR-130b imita (Fig. 4A), o resultado mostrou expressão significativamente mais baixa de luciferase em comparação com as células transfectadas com o mesmo repórter imita vector e controle de microRNA (NC) (Fig. 4a). O efeito de miR-130b sobre a expressão da luciferase foi eliminada quando a 3′-UTR de integrina β1 foi clonado em orientação inversa (3′-ITGB1-Rev) (Fig. 4A). Em seguida, para confirmar a regulação de miR-130b a integrina β1 em células BF, testou-se o nível de proteína de integrina β1 nas células transfectadas com imita o miR-130b e inibidor de miR-130b (Anti-miR-130b), respectivamente (Figura 4B. ). Os resultados mostraram que a expressão da integrina β1 é reprimida após a transfecção imita com miR-130b (Fig. 4B (a)). Knockdown endógena miR-130b com inibidor de miR-130b aumenta a integrina β1 expressão (Fig. 4B (b)). Tomados em conjunto, nossos dados sugerem que a integrina β1 é um gene alvo de miR-130b.

A

, The complete 3′-UTR do gene integrina β1 (3′-ITGB1) foram clonado no vector repórter pmirGlo luciferase dupla e co-transfectadas com imita o miR-130b (miR-130b) e controlar imita miR (NC) para as células SW480, respectivamente. Um vector de controlo foi gerado por clonagem do mesmo 3’UTR do gene da integrina β1 em orientação inversa (3′-ITGB1-rev). A actividade da luciferase do pirilampo foi medida e normalizada para a actividade da luciferase de Renilla (média ± D.P. .; n = 3; *, P 0,05).

B

, análises de Western blot de integrina β1 expressão nas células SW480 transfectadas com NC, imita miR-130b (

Painel de um

) e controle inibidor de miR (Anti-NC) ou miR-130b inibidor (-miR-130b Anti) (

painel b

) a partir de três experimentos independentes. análise de densitometria dos dados de Western blot normalizados com GAPDH (média ± sd; n = 3; *,

P Art 0,05)

miR-130b inibe a migração e invasão celular. através da regulação negativa da expressão de integrina β1

Para investigar mais profundamente que a supressão da integrina β1 por resultados de miR-130b na motilidade deficiente de células Lenti-miR-130b, foi realizada uma experiência de recuperação de integrina β1 usando o Lenti- células de miR-130b. Utilizou-se uma construção de expressão que codifica o quadro de leitura aberta de integrina β1 (β1-ORF) a que falta o 3′-UTR [17], o que produz um ARNm que é resistente a supressão mediada por miARN. Observou-se um claro aumento em expressão da integrina nas células β1 Lenti-miR-130b transfectadas com β1-ORF, em comparação com as células com vector de controlo (Fig. 5A). Além disso, os ensaios de migração de células mostraram que a expressão ectópica de integrina β1-ORF foi capaz de recuperar parcialmente a motilidade das células Lenti-miR-130b em 76% (Fig. 5B e 5C).

a

,

painel esquerdo

: análises de Western blot de integrina β1 expressão em células Lenti de controle, as células Lenti-miR-130b, as células Lenti-miR-130b transfectadas com vector de controlo ou β1-ORF vector de três experiências independentes.

Painel direito

: análise de densitometria dos dados de Western blot normalizados com GAPDH (média ± D.P. .; n = 3; *,

P Art 0,05).

B, C

, ensaios de migração Transwell das células (barra de escala = 100 mm; significa ± D.P. .; n = 3; *,

P Art 0,05). Imagens representativas de células migradas são mostradas. Lenti-miR-130b + controle de vetores: as células Lenti-miR-130b transfectadas com vector de controlo. Lenti-miR-130b + β1-ORF: as células Lenti-miR-130b transfectadas com β1-ORF vetor. ORF:. Grelha de leitura aberta

Nós integrina posteriormente inibido β1 expressão usando uma siRNA específico [18] nas células SW-480 (Fig. 6A). Descobrimos que a migração de células (Fig. 6B) e invasão (Fig. 6C) são notavelmente diminuída através da inibição da integrina β1 expressão com um siRNA específico. Por conseguinte, a diminuição da motilidade das células é alcançada através da supressão da expressão de integrina β1. Tomados em conjunto, estes resultados demonstraram que o miR-130b suprime a migração celular e invasão, pelo menos em parte, através de regulação negativa da integrina β1 em células CRC.

A

, análises de Western blot avaliou a proteína nível de integrina β1 em células SW480 transfectadas com um siRNA contra β1 integrina (b1 siRNA) ou controle negativo siRNA (Scramble) a 20 nM e 50 nM, respectivamente. Cada ensaio foi repetido três vezes, independentemente.

B, C

, migração Transwell (

B

) ea invasão (

C

) ensaios de células SW480 transfectadas com β1 siRNA ou Scramble a 50 nM (barra de escala = 100 m; significa ± sd; n = 3; **,

P Art 0,01). Imagens representativas de células migraram (

B

) e células invadidas (

C

) são mostrados.

correlação inversa entre miR-130b e integrina expressão β1 no CRC espécimes

Para testar ainda mais a correlação entre β1 integrina e miR-130b, estendemos nossa análise em uma coorte de 33 de correspondência pares de tecidos tumorais normal (N) e colorretal adjacentes clínicos (T). Analisou-se a expressão de miR-130b por qRT-PCR e o nível de integrina β1 por Western blot expressão. Como mostrado na Fig. 7, por meio da comparação de tumores em tecidos normais, uma correlação inversa entre o miR-130b e expressão de integrina β1 foi encontrado em 23 dos 33 (69,7%) pares de amostras clínicas. Dos 23 pares, 12 pares mostrou o aumento do miR-130b e a diminuição β1 integrina; 11 pares demonstraram a diminuição da miR-130b e a integrina β1 elevada.

A expressão de miR-130b foi medida por qRT-PCR, a expressão da integrina β1 foi medida por análise de Western blot em uma coorte de 33 combinado -pairs de adjacente normal (N) e tumor (T) tecidos. O rácio de expressão relativa de miR-130b (normalizados para U6) em T sobre N (T /N) foi representada como uma diferença vezes (colunas em cinza escuro). A proporção relativa de expressão de integrina β1 (normalizado para GAPDH) em T mais de N (N /T) foi representada como uma diferença de dobragem (colunas a cinzento claro). significa ± D.P.. Cada ensaio foi repetido independentemente três vezes.

Discussão

MicroRNA 130b (miR-130b) é significativamente desregulada em muitos tipos de tumores humanos. No entanto, o papel de miR-130b em CRC não é bem compreendido. Neste estudo, foi investigada a expressão microARN no cancro colo-rectal (CRC), utilizando microarrays microARN perfis de tumores e amostras de tecidos normais adjacentes. Foram identificados 48 miARNs significativamente expressos diferencialmente associados com o CRC. MiR-130b é um dos miARNs regulada positivamente. Estes dados foi ainda confirmada por qRT-PCR. Para testar os potenciais papéis do aumento da expressão de miR-130b no CRC, realizamos ensaios funcionais após a construção de linha de células de CRC com superexpressão estável do miR-130b. Os nossos dados mostraram que o miR-130b exerce um efeito inibitório significativo sobre a motilidade das células de CRC (Fig. 2), mas não tem nenhum efeito sobre a proliferação celular e a apoptose. Tem sido relatado que, no

TAp63

modelo de rato de abate, a regulação negativa de miR-130b pela perda de resultados TAp63 em um aumento na metástase tumoral [28]. A repressão do miR-130b por um mutante p53 resulta na melhoria de EMT-dependente ZEB1 e invasão de células em células de cancro do endométrio [29]. Todos estes dados sugerem o papel anti-metastática de miR-130b. Além disso, a regulação negativa de miR-130b confere um fenótipo multirresistente em células de cancro do ovário [30]. No entanto, um outro relatório sugeriu que a sobre-expressão de miR-130b em CD133 (+) células iniciadoras de tumor no fígado aumenta a sua capacidade de auto-renovação e quimiorresistência [31]. Estes resultados sugerem que o miR-130b pode ter uma função dupla como um supressor de tumor ou um oncogene, que depende do tipo de cancro e do contexto celular.

Neste estudo, identificou-se que a integrina β1 é um novo alvo de miR-130b. Uma diminuição do nível de proteína de integrina β1 foi observada devido à sobre-expressão de miR-130b em espécimes de CRC (Fig. 3D) e em células de CRC (Fig. 3A e 3B), bem. O ensaio de repórter de luciferase mostrou que o miR-130b liga-se à 3′-UTR de β1 integrina e suprime a sua expressão (Fig. 4). Um aumento na miR-130b por imita o miR-130b transfecção leva à redução da expressão de integrina β1, enquanto knockdown miR-130b com resultados de inibidor de miR-130b em aumento integrina β1 expressão. Por outro lado, a motilidade de células deficientes superexpressão de miR-130b é resgatado, em parte, pela expressão de integrina β1 a que falta a 3′-UTR (Fig. 5). Além disso, o knockdown da integrina β1 também dá origem a uma redução na migração celular e invasão (Fig. 6). Estes dados indicaram que o miR-130b suprime a migração celular e invasão de células de CRC, pelo menos em parte, através da regulação negativa da integrina β1. Além disso, a correlação inversa entre a expressão de miR-130b e integrina expressão β1 foi encontrada em 23 de 33 pares (69,7%) de amostras clínicas CRC. A inibição da migração e invasão de células de CRC directo através da segmentação de β1 integrina é consistente com o papel de anti-metastático proposto para miR-130b [28], [29].