Abstract

Pobre controle local e de escape do tumor são uma grande preocupação na cabeça e pescoço cancros tratados por radioterapia convencional ou hadrontherapy. A glutationa reduzida (GSH) é suspeito de desempenhar um papel importante em mecanismos que conduzem à radiorresistência, e a sua exaustão deve permitir que o stress oxidativo insulto, modificando assim a natureza das lesões do ADN e as subsequentes alterações cromossómicas que potencialmente levar a fuga do tumor.

Este estudo teve como objetivo destacar o impacto de uma estratégia de GSH-exaustão (dimetilo, e de associação sulfoximina l-butionina) combinado com íons de carbono ou irradiação de raios X sobre os tipos de lesões do ADN (escassa ou cluster) eo subsequente envio de cromossômica alterações para a descendência, em uma linha de células radiorresistente (SQ20B) que expressam um alto teor de GSH endógena. Os resultados são comparados com os de uma linha de células radiossensíveis (SCC61), exibindo um baixo nível de GSH endógena.

medições de danos no DNA (γH2AX /ensaio cometa) demonstraram que uma depleção de GSH transiente em células SQ20B resistentes potenciados os efeitos da irradiação aumentando inicialmente escasso quebras de ADN e lesões oxidativas após a irradiação de raios-X, enquanto que a irradiação de iões de carbono aumentada a complexidade do dano oxidativo agrupado. Além disso, DNA residual quebras de cadeia dupla foram medidos sejam quais forem as qualidades de radiação. A natureza das lesões de ADN iniciais e quantidade de danos no ADN residual foram semelhantes aos observados em células sensíveis SCC61 depois de ambos os tipos de irradiação. Misrepaired ou lesões não reparados podem levar a alterações cromossômicas, estimadas em progênie de células pelo ensaio cytome. Ambos os tipos de irradiação induziu aberrações em SQ20B nondepleted resistentes e células sensíveis. SCC61 A estratégia de GSH-esgotamento impediu a transmissão de aberrações (rearranjos complexos e quebra de cromossomas ou perda) em SQ20B radioresistente apenas quando associada à irradiação de íons de carbono. A estratégia de GSH-empobrecimento combinado com hadrontherapy pode, assim, ter vantagem considerável no cuidado de pacientes, minimizando instabilidade genômica e melhorar o controle local

Citation:. Hanot M, Boivin A, Malésys C, Beuve M, Colliaux Uma, a incursão N, et al. (2012) glutationa Exaustão e carbono Ion radiação potenciar cluster de DNA lesões, morte celular e Prevent cromossômica Alterações nas células cancerosas progênie. PLoS One 7 (11): e44367. doi: 10.1371 /journal.pone.0044367

editor: Janine Santos, da Universidade de Medicina e Odontologia de New Jersey, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de setembro de 2011; Aceito: 06 de agosto de 2012; Publicação: 20 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Hanot et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo Programa de Pesquisa de ETOILE através do Programa Regional de Pesquisa em hadrontherapy /Universidade Lyon, sob CPER de financiamento 2007-13 e Fondation Synergie cancer Lyon e contre le cancer Ligue (Ain). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de partilha

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

ião de carbono é altamente eficaz para tratar o cancro localizado próximo órgãos críticos em risco que é resistente à radioterapia convencional, tal como o carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (carcinoma epidermóide), porque uma dose mais preciso e poderoso pode ser aplicada, levando para uma elevada eficiência biológica relativa [1]. íons de carbono induzir danos agrupado prejudicial compreendendo uma combinação de duplo DNA e quebras de cadeia simples (ORL e SSB), e os locais não básicos nas imediações de bases oxidadas. Em contraste com estas lesões induzidas cluster carbono-ion, raios-X induzir danos bastante escassa [2]. Em ambos os casos, as lesões misrepaired ou não reparados podem levar a aberrações cromossómicas [3] – [5]. Algumas alterações cromossômicas transmitidas à descendência da célula pode provocar assim a adaptação de células de câncer [6] e de escape do tumor, a principal causa de falha de radioterapia. O crescente interesse em hadrontherapy para o tratamento de cancros altamente resistentes exige clarificação do impacto das lesões de DNA complexas sobre a maior incidência de alterações cromossômicas (CCs). A identificação desses processos, portanto, seria um grande avanço na compreensão da recorrência do câncer, uma característica bem conhecida de HNSCC radioresistente [7] – [10]

lesões de DNA e CCs são influenciados por fatores endógenos, como reativa. espécies de oxigênio sistemas de limpeza. Um elevado nível de glutationa reduzida endógena (GSH), muitas vezes promove a sobrevivência de células de cancro e de resistência [11], e a sua exaustão, investigado há décadas, juntamente com a radioterapia, é citado hoje para novas considerações terapêuticas particularmente para o tratamento de cancros resistentes a convencional ou de carbono ião radioterapia [12] – [15]. Entre outras estratégias, uma estratégia de GSH-depleção pode ser usado como uma ferramenta para modular a natureza, o número ou a reparação de lesões do ADN através de dano de ADN complexa gerada oxidativamente [16]. No entanto, apenas limitada e estão disponíveis dados conflitantes sobre a relação entre o nível de GSH e transferência de energia linear alta (LET) e baixa-LET dano ao DNA induzido por radiação. Por exemplo, Mansour et al. [17] relataram que

N

-acetylcysteine, um precursor de GSH, protege os tecidos hepáticos a partir de lesões do ADN induzidos por radiação, ao passo que outros estudos sugerem um papel protector fraco da GSH exógena em lesões do ADN em linfócitos ou células CHO [18 ], [19].

Estudos dos efeitos citogenéticos de alta-LET radiação são úteis para analisar os mecanismos subjacentes radiorresistência células tumorais porque refletem a especificidade, capacidade e fidelidade dos processos de reparação ou misrepair ocorrendo em células irradiadas . As lesões de DNA cluster induzidas por irradiação de iões de carbono são conhecidos por levar a aberrações cromossómicas alta complexidade na metáfase [3], [5], mas pouco se sabe sobre o risco da sua transmissão aos descendentes de células de câncer, que é uma causa potencial de tumor escapar. Embora uma relação que liga o stress oxidativo e a instabilidade genómica foi relatada [20], [21], os dados relacionados com a modulação das defesas antioxidantes (tais como GSH) ainda são contraditórios. Por exemplo, qualquer que seja a qualidade de radiação, um aumento na piscina de GSH endógena pode inibir a permuta de cromatídeos irmã [22], aumentar aberrações câmbio [19], ou reduzir a frequência de células em metafase aberrantes [18]. A exclusão é o único tipo comum de CC relatado em estudos anteriores que demonstram que o número de exclusões se correlaciona inversamente com o nível de GSH [18], [19], [23], [24]. Embora um número crescente de dados estão disponíveis, com explicações ou hipóteses que ligam essas observações para as lesões iniciais de DNA radioinduced, dados sobre a capacidade de reparação ou o risco de transmissão CC à descendência celular ainda estão faltando. Apenas Pujari et ai. [19] sugeriram que a radiação de alta-LET combinada com uma suplementação GSH marginalmente influenciado a frequência de troca cromossómica em comparação com raios-X, o que indica que a GSH não protegeu as células contra danos de ADN sob estas condições experimentais.

Os estudos citogenéticos conduziram frequentemente a dados conflitantes, provavelmente por causa da diversidade de métodos utilizados, que estimou tanto primeiros efeitos (durante metaphase ou com técnicas prematuros cromossomo condensação) [4], [18], [25] ou efeitos tardios (na descendência) [26], [27]. Medição dos efeitos iniciais levanta o problema da mudança do ciclo celular causado por irradiação, o que leva a uma subestimação de CCs quando os dados são recolhidos em apenas um ponto de tempo e a uma falta de indicação acerca dos efeitos na eventos transmissíveis [3], [4 ]. Além disso, as células cancerosas exibir um genoma altamente modificado que limita observações e medições de aberrações cromossómicas usando técnicas de FISH-pintura [4]. Medição dos efeitos tardios fornece informações sobre a transformação ou diferenciação na progênie, mas exclui eventos decorrentes no momento da primeira mitose [26], [27]. Assim, não houve, até agora, não há consenso claro sobre o que é o método mais relevante para o estudo do risco de transmissão de aberrações cromossómicas em células sobreviventes.

Um método alternativo pode fornecer um link sobre instabilidade cromossômica entre estes diferentes dados e refere-se ao ensaio de micronúcleos cytokinesis-bloco que evolui para um “ensaio cytome” [28] – [31]. Este ensaio baseia-se nas observações morfológicas dos núcleos após bloqueio citocinese, isto é, células que tenham completado uma divisão nuclear são identificados pela sua aparência binucleadas. Ele fornece informações sobre alguns CCs transmitidas para as células filhas, [33] [32] através de micronúcleos e formação de ponte nucleoplasmic. Este ensaio bem descrito é agora considerada como um teste de referência para monitorização CCs humanos e permite a identificação de células que passam através da primeira mitose retardada. Tais aberrações transmissíveis podem induzir instabilidade genômica em células sobreviventes, levando à fuga tumor

.

O objetivo do presente estudo foi o primeiro a determinar a qualidade ea quantidade de lesões de DNA em relação ao nível GSH endógena e qualidade da radiação, e a segunda para determinar os CCs consecutivos em sobreviver as células cancerígenas após a irradiação de iões de raios-X e de carbono, a fim de avaliar o risco de instabilidade radioinduced e, em seguida, a fuga do tumor. Uma linha de células de carcinoma epidermóide resistente (SQ20B) que indica um elevado nível de GSH endógena (~ 70 nmoles /mg de proteína) foi escolhido como um modelo de estudo. Uma estratégia de GSH-esgotamento transitório foi aplicada antes da irradiação, com base na utilização de fumarato de dimetilo (DMF), um agente de empobrecimento glutationa, e butionina sulfoximina (BSO), um inibidor da biossíntese da glutationa. Esta estratégia tem sido previamente testado [14], em termos de toxicidade in vitro e as vias activadas principais células SQ20B à morte após irradiação foram claramente demonstrado. Permitiu células SQ20B para exibir a mesma sensibilidade que células SCC61, uma linha celular HNSCC radiossensível que exibe um conteúdo de GSH endógena baixo [14], [34]. Neste trabalho, os dados obtidos a partir de células SQ20B radioresistentes e células SQ20B GSH-empobrecido foram, portanto, em comparação com células SCC61 sensíveis. Para comparar os eventos que conduzem a um nível equivalente de morte celular, raios-X e 75 MeV /N irradiação de iões de carbono foram utilizados em doses biologicamente equivalentes, assumindo uma eficiência biológica relativa de sobrevivência de cerca de 2 a 10% para ambas as linhas de células [34].

em conjunto, nossos resultados levam a uma nova compreensão da qualidade e do número de lesões de DNA em relação ao nível de GSH e qualidade de radiação e, portanto, esclarecer alguns resultados divergentes relatados na literatura. A este respeito, o ensaio cytome deu uma visão clara de aberrações cromossómicas transmissíveis nas células cancerosas sobreviventes. Permitiu que a afirmação de que um aumento da complexidade da lesão DNA obtido por terapia adjuvante GSH-esgotamento combinado com hadrontherapy pode minimizar a instabilidade genômica em células cancerosas resistentes e, portanto, reduzir o fenómeno de fuga tumor após a radioterapia.

Materiais e Métodos linhas celulares

Cultura de células e tratamentos

SCC61 (SF2 = 0,36) e SQ20B (SF = 0,72) foram cultivadas como descrito anteriormente [34]. As células foram cultivadas por mais de 12 passagens. O fumarato de dimetilo (DMF, 100 | iM), um agente de GSH de empobrecimento, e sulfoximina de L-butionina (BSO, 100 uM), um inibidor da GSH biossíntese, foram adicionados à cultura SQ20B meio 4 h antes de irradiação para esgotar de GSH, tal como descrito anteriormente [14]. Em algumas experiências,

N-acetil cisteína

(NAC, 5 uM) também foi adicionada ao meio de cultura quatro horas antes da irradiação e em combinação com o tratamento de DMF /BSO.

γH2AX primário e anticorpos de ratinho de proteínas centromérica a (CENPA) foram obtidos a partir de Upstate e Abcam, respectivamente, e o anticorpo secundário AlexaFluor 488 IgG de cabra anti-ratinho foi obtido a partir de Invitrogen. Antifade meio de montagem foi adquirido a partir de Dako. Ponto de fusão baixo ponto de agarose e solução SYBR Green eram da Sigma, e o glicosilase formamidopirimidina (FPG) foi obtido a partir de Trevigen.

Procedimentos de irradiação

As monocamadas de células de cultura foram irradiadas como [35 descrito anteriormente ]: irradiação de raios-X com 6 MV foi realizada em Lyon-Sud Hospital (Departamento de radioterapia), France, em um irradiador Clinac CD a uma taxa de dose de 2 Gy /min. Irradiação com 72 íons MeV /u carbono (LET 33,6 keV /μ) foi realizada a GANIL, Caen, França.

Análise de células clonogénicas Survival

sobrevivência de células clonogénicas foi monitorada depois de raios-X e exposição de iões de carbono em doses que variam de 1 a 5 Gy. As células foram semeadas antes da irradiação e re-semeadas imediatamente após a exposição em frascos de 25 cm

2 em diferentes concentrações. A sobrevivência celular foi avaliada pelo ensaio de formação de colónia padrão tal como descrito em [35].

Análise HPLC

glutationa total foi quantificada por análise por HPLC. Resumidamente, as proteínas foram precipitadas a partir do homogenato celular com ácido sulfossalicílico e centrifugou-se a 13.000 ×

g

. O sobrenadante foi então derivada com

o

-phthalaldehyde. A separação cromatográfica foi obtida numa coluna de Spherisorb-C18 de 5 um, com uma fase móvel composta por metanol-acetato 0,15 M de tampão de pH 7 (7.5:92.5). Fluorescência da glutationa

o

derivados -phthalaldehyde foi detectado em um comprimento de onda de emissão de 420 nm e uma excitação a 340 nm [36].

Imunofluorescência

A detecção de γH2AX focos ou CENPA foi analisada por imuno-histoquímica. Resumidamente, as células foram fixadas em paraformaldeído a 3% durante 20 min, e a imunodetecção foi realizada como descrito [37]. A detecção CENPA foi realizada com o ensaio descrito abaixo cytome. As imagens digitais foram obtidas utilizando um microscópio de fluorescência (microscópio axio Imager Z1 Zeiss, 400 × de ampliação). Um mínimo de 100 núcleos foram marcados em cada tempo para calcular o número médio de γH2AX focos usando software ImageJ.

DNA Único detecção de lesões usando alcalina de célula única Gel Eletroforese (SCGE)

As células foram tripsinizadas, centrifugadas a 1000 rpm a 4 ° C, e o sedimento foi suspenso em meio de congelação (10% de DMSO, 40% de DMEM, 50% de SVF) e armazenado a -80 ° C. Após descongelação, as amostras foram centrifugadas (1000 rpm, 4 ° C), e o sedimento foi suspenso em PBS frio e misturado com 0,6% de agarose de baixo ponto de fusão. Os géis foram espalhadas em lâminas de microscópio e a técnica SCGE foi usado como descrito de Tice et al. [38]. Apresentações destinados para medições de base de DNA oxidados foram lavadas com o tampão de enzima (0,1 M de KCl, 10 mM de EDTA, 10 mM de HEPES-KOH, 0,02 mg /ml de BSA, pH 7,4) e incubou-se durante 20 min (37 ° C) com Fpg em o tampão de enzima, ou apenas com tampão. Todas as lâminas foram depois incubadas durante 40 minutos num tampão de electroforese em alcalina (pH 13) para induzir o desenrolamento do ADN. A electroforese foi realizada no mesmo tampão durante 35 min a 25 V /300 mA a 4 ° C. As lâminas foram lavadas com 400 mM de Tris base (pH 7,5) para neutralizar o excesso alcalino. Após a coloração com a solução de SYBR Green, núcleos “cometas” eram vistos no microscópio Zeiss. Um total de 100 cometas foram observados visualmente e marcou em cada slide usando software livre CASP. A intensidade da cauda, ​​definida como a porcentagem de DNA a migração a partir da cabeça do cometa na cauda, ​​foi medido para cada núcleo marcou.

Cell Cycle Analysis

iodeto de propídio (PI) coloração foi utilizado para analisar a distribuição do ciclo celular, como descrito anteriormente [34]. Resumidamente, as células foram fixadas com etanol a 70%, incubadas com 5 ug /mL de PI (Sigma-Aldrich) e 0,5 mg /ml de RNase A (Sigma-Aldrich), e em seguida analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACScan.

Cytome ensaio: Os micronúcleos (MN) e cromossômica Rearranjos

O ensaio de micronúcleos bloqueada-cytokinesis multiendpoint foi usado para avaliar aberrações cromossómicas [32]. Citocalasina B (5 ug /ml) foi adicionada ao meio de cultura, a fim de bloquear a citocinese e recolher as células que tinham completado a primeira divisão nuclear. Não células binucleadas são numeradas na 5 h após a adição de citocalasina B. A concentração selecionada como indicado acima, apresentaram as maiores frequências de células binucleadas em controles (95%, 28 h após a adição de citocalasina B) e não tinha influência sobre o nível de ocorrem espontaneamente MN ou pontes nucleoplasmic. Citocalasina B foi adicionado 4 h antes da irradiação, a fim de acumular a população de células mais representativo numa fase binucleadas 24 h mais tarde. As células foram fixadas em paraformaldeído a 3% e coradas com DAPI (5 ug /ml). Nestas experiências, foram consideradas diferentes pontos finais: células binucleadas com MN, MN centrómero-positiva, pontes nucleoplasmic (NPB) e células com NPB simultânea e MN (MN + NPB) [28], [39], [30]. Estes marcadores são descritos aqui em ordem crescente de complexidade.

As células com MN. Estas células são caracterizados pela presença de tanto um núcleo principal e um ou mais núcleos menores chamadas MN. A frequência de MN na população de células é a produção de MN (YMN), que é calculado como: onde MN1 é o número de células com uma micronúcleos, MN2 o número de células com dois MN, MNN o número de células com n MN , e BN é o número total de células binucleadas. A presença de manganês é indicativo de perda de fragmentos de cromossomas que corresponde ao cromossoma acêntrico /cromatídeos resultante de eventos de ruptura de DNA não reparados. Em contraste, MN contendo um ou mais centrómeros (imunodetectada como CENPA) indica a perda de cromatídeos /cromossoma. A proporção de micronúcleos centrómero-positivo (C + Mn) foi estimada como a percentagem de células com binucleadas C + MN.

Células com NPB. NPB são estruturas contínuas contendo ADN que ligam os núcleos numa célula binucleadas. NPB originam de cromossomos dicêntricos em que os centrômeros são puxados para pólos opostos durante a anáfase e são, portanto, representativa de DNA misrepaired, rearranjo cromossómico ou fusão final dos telômeros.

As células com expressão simultânea de NPB e MN. A expressão de NPB + MN em células divididas surge de ciclos break-fusion-break e representa um rearranjo altamente complexa.

Todos os critérios de pontuação foram utilizados de acordo com os parâmetros morfológicos descritos por Fenech [33].

Análise

estatística

os dados de pelo menos três experiências independentes são apresentados como a média eo desvio padrão. Os dados foram analisados ​​usando

t

teste de Student.

P

. 0,05 comparado com a condição de controle foi considerado significativo

Resultados

Efeitos de DMF /BSO combinadas com irradiação sobre os níveis endógenos de GSH das células SQ20B

no primeiro conjunto de experiências (Tabela 1A), temos quantificado o teor total de GSH em células SQ20B tratadas sob diferentes condições. Quando usado em combinação, DMF e tratamento BSO resultou em depleção de GSH total após 4 h de incubação com uma recuperação lenta do nível de GSH em 24 h. A 4 h DMF /BSO pré-tratamento combinado com exposição aos raios X ou de iões de carbono activado a estabilização do esgotamento de GSH e a inibição de resíntese de glutationa induzida após a irradiação (Quadro 1B). Não há variações significativas de glutationa oxidada foram detectadas nas nossas condições experimentais (dados não apresentados). Este protocolo foi, portanto, considerada como ideal para esgotar de forma eficiente e transitoriamente lojas SQ20B GSH.

células clonogénicas Survival

Os resultados para a sobrevivência de células clonogénicas no SCC61 radiossensível e as linhas de células SQ20B radioresistente depois de raio-X ou de irradiação de iões de carbono são mostrados na Fig. 1. A exposição a iões de carbono resultou em uma fracção sobrevivente inferior em comparação com raios-X, em ambas as linhas celulares. A fração de sobrevivência em 2 Gy (SF2) foi (raios-X) 0,81 e 0,33 (iões de carbono) para as células SQ20B e (raios-X) 0,34 e 0,12 (iões de carbono) para SCC61 células. células SQ20B foram sistematicamente mais resistentes do que as células SCC61, mesmo em resposta aos iões de carbono. A eficácia biológica relativa no nível de sobrevivência de 10% foi de 2,1 para as células SQ20B e 1,9 para SCC61 células. Na presença de DMF /BSO, radiossensibilização de células SQ20B resistentes ocorreu e a resultante SF2 (0,28 por raios-X e 0,19 para os iões de carbono) verificou-se ser semelhante à medida na linha celular sensível SCC61 não tratada. Tal radiossensibilização foi invertida na presença de 5 uM a NAC, um agente altamente potente antioxidante, tal como evidenciado pelo valor SF2 (0,84) de células SQ20B tratados após irradiação com raios-X.

SQ20B, DMF /BSO ( TTT) tenha sido tratada com SQ20B, e células SCC61 foram expostas à radiação de raios-X (a) ou radiação de iões de carbono (B). O efeito inverso do NAC sobre o tratamento de depleção de glutationa foi avaliada por coincubating DMF /BSO (TTT) SQ20B tenha sido tratada com com 5 mM de

N

cisteína acetil (NAC) (SQ20B + TTT + NAC) antes de X- ray exposição à radiação.

DNA Análise DSB por γH2AX Ensaio

o primeiro avaliou a eficiência do reparo DSB de acordo com a cinética de γH2AX focos. Como mostrado na Fig. 2

A

, o pico inicial de γH2AX focos por célula após a irradiação de raios-X foi semelhante em ambos os SQ20B radioresistente (31,3 ± 1,0) linha de células que apresenta o mais alto nível de GSH endógena eo SCC61 radiossensível (30,8 ± 2,4) linha de células, sugerindo que o conteúdo GSH não impacto sobre o rendimento do ORL após a irradiação de raios-X. No entanto, a cinética de reparação diferiam: reparação foi mais lento em células sensíveis e SCC61 resultou numa acumulação de ORL residual (8 focos /núcleo) 24 h após a irradiação. Após a exposição de iões de carbono (Fig. 2

B

), o número máximo de γH2AX focos por célula foi menor do que após a irradiação com raios-X (19 ± 0,7 e 22,2 ± 0,3 para as linhas de células SQ20B e SCC61, respectivamente) . Em contraste com a resposta a irradiação de raios X, a cinética de reparação era similar entre as duas linhas de células. Finalmente, o número de focos γH2AX residual medida em células sensíveis de 24 h após a exposição de iões de carbono foi equivalente à observada após a isodoses biológica de raios-X (7,7 ± 0,6 focos /núcleo), ao passo que nenhum ORL residual foram medidos em células resistentes depois quer tipo de irradiação.

As células foram irradiadas com 2 Gy de raios-X (A, C) ou 1 Gy de iões de carbono (B, D). ▴ células SQ20B, ▵ SQ20B + irradiação, • esgotamento SQ20B + GSH, o esgotamento • SQ20B + GSH + irradiação, □ SCC61 + irradiação. Nos painéis C e D, o efeito inverso de

N-acetil cisteína

na presença de tratamento DMF /BSO foi ensaiada. Cem células foram pontuadas para cada tempo e as medições foram efectuadas em triplicado e repetidas três vezes. *

P

. 0,05

esgotar o nível de GSH intracelular em células SQ20B por tratamento DMF /BSO não causou qualquer variação significativa na quantidade DSB espontânea em comparação com células de controlo ( 0-5 focos) durante o curso de tempo estudados, ao passo que a combinação com raio-X ou de irradiação de iões de carbono afectou significativamente a resposta celular. O número de focos γH2AX aumentou significativamente (

P

0,05) 30 minutos depois da irradiação com raios-X (42,3 ± 2,3 versus 31,3 ± focos 1,0 em células SQ20B irradiados) e a cinética de reparação, em seguida, foram mais lentos do que os observados em células SQ20B irradiadas, mas não tratadas. O aumento do número de lesões de ADN iniciais conduziram a DSB residual (9,7 ± 1,5 focos) às 24 h, um nível semelhante ao que foi medido em células sensíveis SCC61. Curiosamente, após a exposição de iões de carbono, a resposta de células SQ20B GSH-empobrecido que combinam perfeitamente das células irradiadas SCC61 em termos de danos de ADN inicial, a cinética de reparação, e ORL residual. Estes resultados indicam que o esgotamento do pool de GSH endógena em células resistentes combinados com raio-X ou de iões de carbono exposição a uma dose biologicamente equivalente conduziu à persistência de lesões do ADN a um nível semelhante ao das células sensíveis SCC61.

Para confirmar o papel das mudanças redox em danos no DNA, nós incubadas células SQ20B NAC. Sob estas condições experimentais, a NAC não induziu γH2AX focos em experiências de controlo (Fig. 2 C e D). Na presença de tratamento DMF /NaC BSO e adicionou-se 4 h antes da irradiação, as medições γH2AX mostrou que o nível de DSB e cinética de jogo reparação com células SQ20B irradiadas, mas não tratadas,, para um ou outro tipo de irradiação. NaC pode, assim, reverter o efeito da depleção de GSH.

rupturas dos filamentos individuais e oxidativos DNA lesões medida pelo SCGE Ensaio

O nível de sítios álcali-lábeis e SSB em DNA foi investigado usando o SCGE ensaio. Como mostrado na Fig. 3

A

, SCC61 sensível e linhas de células resistentes SQ20B exibida claramente respostas distintas em termos de SSB radioinduced. Nenhum sinal foi obtido a partir de células SQ20B durante o tempo estudado com um ou outro tipo de irradiação. Em contraste, as células foram SCC61 altamente sensível e mostrou um nível elevado de quebras nos tempos mais curtos após a irradiação. reparação rápida ocorreu após a exposição a raios-X, tal como demonstrado pela diminuição do número de quebras com o tempo. Embora a irradiação de iões de carbono induziu uma percentagem inicial de ADN da cauda semelhante em comparação com a irradiação de raios X, a cinética de reparação em células SCC61 foi consideravelmente mais lenta e mostrou um aumento sustentado até 2 h seguida por um decréscimo para um tempo mais longo. Interessantemente, as células SQ20B GSH-empobrecido mostrou um padrão semelhante ao observado para SCC61 células e a taxa foi similar depois da exposição a um ou outro tipo de radiação. Isto sugere que altos níveis de GSH endógenos proteger o DNA contra a radiação em células SQ20B. Num segundo conjunto de experiências, a percentagem de ADN da cauda identificados utilizando SCGE sozinho foi subtraída da obtida após o tratamento com a enzima Fpg para estudar a distribuição espacial das bases oxidados. Os resultados mostrados na Fig. 3

B

indicam que em células SQ20B, raios-X ou radiação de íons de carbono não modificou a oxidação de bases de DNA em comparação com os controles. No entanto, as células SQ20B GSH-empobrecido exibida danos oxidativos mais dispersa no menor espaço de tempo após a irradiação de raios-X, enquanto que um padrão variável de menos de danos após a exposição aos iões de carbono sugerida a produção local de radicais livres.

percentual médio dos danos no DNA em SCC61, SQ20B, e DMF /BSO (TTT) tenha sido tratada com linhas de células SQ20B após 10 Gy de raios-X ou 5 Gy de exposição de iões de carbono. Os ensaios de cometa foram realizados em condições alcalinas, sem (A) ou na presença de enzima Fpg (B). ▵ células SQ20B, ▴SQ20B + irradiação, exaustão • SQ20B + GSH, exaustão ○ SQ20B + GSH + irradiação, ▪ SCC61, □ SCC61 + irradiação. *

P

. 0,05

Radioinduced G2 /M Fase Detenção e acúmulo de células na Sub G1-Phase após a análise do ciclo celular

Para determinar a que medida o esgotamento de GSH e o ORL residual poderia afectar a resposta celular a irradiação de iões de raios-X ou de carbono por meio da redistribuição do ciclo celular, o número relativo de SCC61, SQ20B, e células SQ20B GSH-empobrecido nos sub-G1 (Fig. 4

Um

) e G2 /M (Fig. 4

B in

fases) foi analisada por citometria de fluxo. As células sensíveis SCC61 foram submetidos a apoptose rapidamente (cerca de 32% de células sub-G1 às 48 h, aumentando para 68% a 120 h). Em contraste, nenhum nível significativo de apoptose foi medida em células SQ20B depois de qualquer um dos tipos de irradiação. Em vez disso, até 55% das células SQ20B foram presos na fase G2 /M do ponto de verificação após 24 h após a ambos os tipos de irradiação, e estas células reentrou no ciclo celular após 48 h. esgotamento de GSH das células SQ20B aumentou a paragem em G2 /M de fase, após o que as células foram libertadas e voltaram ao nível basal, apenas 72 horas após a irradiação. A recaída de G2M prisão /correlacionado com o aumento da percentagem de células apoptóticas após irradiação com raios-X (55% no máximo). Este aumento foi ligeiramente atrasada (96 h) após a exposição de carbono, mas atingiu o mesmo nível a 120 h. Estes dados indicam que o esgotamento do pool endógena de GSH influencia a proporção de células preso no G2 /M checkpoint em cultura e sua duração em relação à qualidade da radiação.

SCC61, SQ20B, e DMF /BSO ( TTT) células SQ20B tenha sido tratada com foram expostos aos raios-X ou radiação de iões de carbono. (A) A percentagem de células na fase sub-G1. (B) A percentagem de células na fase G2 /M. ▴ células SQ20B, 5 de radiação de íons de carbono, 10 raios-X ▵ SQ20B + Gy ▵ SQ20B + Gy, esgotamento • SQ20B + GSH, esgotamento 5 de radiação de íons de carbono ○ SQ20B + GSH + Gy, ○ SQ20B + GSH-exaustão + 10 Gy X raios K., ▪ SCC61, □ SCC61 + 5 Gy de radiação de íons de carbono, □ + 10 raios-X SCC61 Gy. *

P

. 0,05

Medidas micronúcleos detectados usando as Cytome Ensaio

danos ao DNA não reparados ou misrepaired pode levar a alterações cromossômicas em células sobreviventes de câncer. A formação de MN, que contêm um fragmento de um cromossoma /cromatídeos, pode ser ligada à DSB não reparados, reflectindo assim um defeito de reparação. O rendimento de manganês foi estimada pelo cálculo do valor YMN. Como mostrado na Fig. 5

Um

, os valores YMN após exposição a raios-X e a irradiação de iões de carbono estão correlacionados com a radiossensibilidade celular. Mais MN foram produzidos em SCC61 sensível em comparação com células SQ20B após ambos os tipos de irradiação. O rendimento máximo em células SCC61 não diferiram significativamente entre os dois tipos de irradiação (2,1 ± 0,3 após a irradiação com raios X e de 1,68 ± 0,3 após a irradiação de iões de carbono). O valor máximo foi ligeiramente atrasada após a irradiação de iões de carbono (96 h), um intervalo de tempo correspondente ao desencadeamento de apoptose, tal como descrito acima. Por outro lado, o rendimento de MN induzida em células SQ20B resistentes não excedeu 0,75 e foi semelhante para ambos os tipos de irradiação. Embora a radiossensibilização de células SQ20B através de esgotamento de GSH levou à DSB residual idênticos aos observados no SCC61 células após a irradiação, não induziu o mesmo padrão de MN. Os valores medidos no YMN SQ20B GSH-empobrecido foram iguais a aqueles em células SQ20B empobrecido após irradiação-X (exceto a 120 h após a irradiação), mas foram menores após exposição de iões de carbono para a maioria dos pontos de tempo cinéticos. Finalmente, apenas irradiação de íons de carbono induziu uma diminuição evidente no número de MN radioinduced em células SQ20B GSH-empobrecido.

Rendimento de micronúcleos (A) e micronúcleos centrômero-positivas (B) em SCC61, SQ20B, e DMF /BSO (TTT) tenha sido tratada com linhas celulares SQ20B após 10 Gy de raios-X ou 5 Gy de radiação de íons de carbono. *

P

. 0,05

Em um segundo conjunto de experiências, a perda cromossômica /chromatid (identificado como o centrômero positivo MN, c + MN) foi estimada (Fig. 5

B

). A percentagem de células com C + MN foi baixa depois de irradiação com raios X e não diferiram entre as células sensíveis e resistentes (máximo ~ 4% a 5%). Como mostrado na Fig.