Abstract
Fundo
Ativação mutações somáticas no
de crescimento epidérmico do receptor do factor
(
células (NSCLC), mas os mediadores de transcrição de EGFR neste subgrupo de NSCLC EGFR
) conferem características únicas biológicos para o cancro do pulmão de não pequenas células não foram completamente elucidados.
Metodologia /Principais achados
Aqui usamos abordagens genéticas e farmacológicas para elucidar os transcriptomes de linhas celulares de NSCLC. Nós transcricionalmente perfilado um painel de
EGFR
linhas de células NSCLC e -mutant-tipo -wild cultivadas na presença ou ausência de um inibidor da tirosina-cinase EGFR. análise hierárquica revelaram que as linhas celulares segregados com base
status de EGFR
mutacional (mutante versus tipo selvagem), e as assinaturas de expressão foram identificados por análise supervisionado que distingue as linhas celulares com base no estado mutacional (de tipo selvagem contra o mutante) e tipo de mutação (L858R contra Δ746-750). Usando um
EGFR
assinatura expressão específica de mutação como uma sonda, que minou os perfis dos dois grupos independentes de pacientes com NSCLC de expressão gênica e encontrou a assinatura em um subconjunto. EGFR tirosina tratamento com inibidor da quinase regulada a expressão de vários genes, e inibição farmacológica dos produtos de proteína de dois deles (
PTGS2
e
EphA2
) inibiu o crescimento independente de ancoragem no
EGFR
células NSCLC -mutant.
Conclusões /Significado
Temos elucidado genes não previamente associados com
EGFR
-mutant NSCLC, dois dos quais aumentou a clonogenicidade destes células, distinguindo esses mediadores de outros previamente mostrado para manter a sobrevivência da célula. Essas descobertas têm potencial relevância clínica dada a disponibilidade de ferramentas farmacológicas para inibir os produtos de proteínas destes genes
Citation:. Choi K, Creighton CJ, Stivers D, Fujimoto N, Kurie JM (2007) transcricional Profiling de Non Celulares cancro do pulmão células -Pequenos com a ativação
EGFR
somáticas Mutações. PLoS ONE 2 (11): e1226. doi: 10.1371 /journal.pone.0001226
Editor do Academic: Janet Kelso, do Instituto Max Planck de Antropologia Evolutiva, Alemanha |
Recebido: 06 de setembro de 2007; Aceito: 01 de novembro de 2007; Publicação: 21 de novembro de 2007
Direitos de autor: © 2007 Choi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional do Câncer concede CA70907 P50, P30 CA125123, e R01 CA117965
Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Tratamento Introdução
com o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) inibidores da tirosina cinase (TKI) leva a uma rápida e sustentada encolhimento do tumor em um subconjunto de pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) [1] – [3]. As células tumorais em que estes doentes têm mutações somáticas no
EGFR quinase
domínio que activam a EGFR constitutivamente [1] – [3]. As mutações activadoras identificadas aglomerado até agora na região que codifica o domínio de cinase (exões 18-21) e são mais frequentemente quer Δ746-750 mutações por deleção ou L858R ponto de [1] – [3]. mouse modelos construídos para investigar o oncogenicity de mutante
EGFR
desenvolver adenocarcinomas pulmonares invasivas que regridem após o tratamento com EGFR TKI [4; 5]. células epiteliais brônquicas humanas imortalizadas adquirir propriedades malignas após a transfecção com o mutante
EGFR
[6]. O tratamento com EGFR TKI induz a apoptose destes
EGFR
células -transfected e células NSCLC com mutações somáticas no
EGFR
[7, 8]. Assim, as evidências de modelos celulares humano, murino, e indica que mutante
EGFR
é oncogênico e confere dependência do EGFR para a sobrevivência de células NSCLC.
A potência do mutante
EGFR
como um oncogene é apoiada pela evidência de que as suas propriedades bioquímicas diferem drasticamente daquelas de EGFR de tipo selvagem. O domínio de cinase de EGFR é constitutivamente activada pelas mutações somáticas, e exibe ligação melhorada e sensibilidade ao EGFR TKI [9] – [11].
EGFR
-mutant células NSCLC normalmente expressam níveis elevados de EGFR e os seus parceiros dimérica ErbB2 e ErbB3 e vários ligandos ErbB, os quais potenciam a sinalização dependente de EGFR [8]. Múltiplas vias de sinalização são constitutivamente activada nestas células, algumas das quais têm sido mostrados para promover a sobrevivência da célula. Por exemplo, o EGFR forma um complexo heterodimérico com ErbB3, que se liga a e activa directamente fosfatidilinositol 3-quinase e mantém a sobrevivência de células por meio de mecanismos dependentes de AKT [12]. Outros sinais pró-sobrevivência são mediadas através de cinases da família Src, que são constitutivamente ativados em
EGFR células
-mutant NSCLC [13; 14].
Em contraste com os avanços feitos na elucidação de mediadores a sobrevivência da célula, menos progresso tem sido feito na compreensão dos mecanismos pelos quais mutante
EGFR
confere outras propriedades neoplásicas, tais como a capacidade de migrar, invadir, proliferam de forma independente de ancoragem, e promover a angiogênese. Aqui temos procurado identificar os mediadores por interrogar os transcriptomes de um painel de linhas celulares de NSCLC, que foram caracterizadas quanto à presença de
EGFR
mutações. Encontramos um perfil transcricional de células
EGFR
-mutant NSCLC que incluíram genes não previamente conhecidos por serem dependentes de EGFR. Embora a gama de funções celulares atribuídas a esses genes é ampla, muitos deles estão ligados através de redes conhecidas ou previstas de interacção de proteínas. Em conclusão, o perfil transcricional identificado em
células EGFR
-mutant NSCLC nos informou sobre os processos biológicos e potenciais alvos terapêuticos que podem ser eficaz em pacientes com esta doença.
Resultados
Análise transcricional de linhas de células NSCLC
foi utilizado um painel de oito linhas celulares de NSCLC (Tabela 1) que tinham sido caracterizados para a presença ou ausência de somática
EGFR
mutações (cinco linhas celulares com tais mutações e três sem) e
Ras
mutações (duas linhas de células com tais mutações e seis sem). Dos cinco
EGFR
linhas celulares -mutant, três tiveram exon 19 mutações de deleção (Δ746-750) (HCC827, HCC2279, H4006), um tinha uma mutação pontual exão 21 (L858R) (H3255), e um tinha L858R em combinação com a mutação gatekeeper T790M que confere resistência a TKI EGFR (H1975). Dos três
EGFR
linhas celulares -wild do tipo, um tinha uma mutação somática em
N-ras
(H1299), e um tinha um
K-ras
mutação (H460). O ARN foi extraído e preparado a partir de células depois de terem sido cultivadas durante 2 h a 70% de confluência, na presença ou ausência do gefitinib TKI de EGFR (1,0 uM). Esta duração do tratamento TKI foi escolhida para identificar os primeiros eventos de transcrição induzida pela inibição de EGFR e para minimizar a detecção de alterações de expressão de genes devido a apoptose. O ARN foi submetido a Affymetrix perfil de expressão de genes, e os perfis foram examinados pelas diferenças na expressão de genes no início do estudo e após o tratamento de TKI.
O primeiro examinado
EGFR
estado mutacional como um classificador dos perfis de transcrição. análise hierárquica de agrupamento revelado uma das linhas celulares com base no estado mutacional;
EGFR
-mutant linhas celulares claramente segregadas das linhas de células do tipo -wild (Fig. 1). No entanto, não houve uma separação clara entre os dois tipos de mutações (L858R contra Δ746-750) (Fig. 1). Por análise supervisionado de acordo com critérios específicos (pelo menos um aumento de 2,0-vezes ou uma diminuição de 50% no
EGFR
linhas celulares -mutant em relação à do tipo selvagem,
P
0,05) , 194 foram identificados genes únicos que distingue o
EGFR
linhas de células mutantes a partir das linhas de células do tipo -wild. Estes genes são listados na S1 Arquivo e ilustrado em um mapa de calor agrupado na Fig. 2
A
. Foram examinados 29 dos 194 genes por PCR quantitativa e validados que 19 (68%) deles foram diferencialmente expressos entre
EGFR
linhas celulares do tipo -wild -mutant e (S2 Arquivo).
dendrograma que ilustra o parentesco entre os perfis de expressão a partir de linhas de células tratadas com (+) ou sem (-) gefitinib. A presença ou ausência de
EGFR
mutações somáticas e do tipo de mutações, incluindo a mutação pontual L858R (P) ou Δ746-750 supressão mutação (D), são indicadas. WT, de tipo selvagem.
(A)
A assinatura 194-gene que distingue
EGFR
-wild-type (WT) a partir de células NSCLC -mutant linhas (tratado com [+] ou sem [-] gefitinib) está alinhada com os perfis de expressão de
(B) of the coorte Michigan (86 pacientes) ea coorte Harvard (84 pacientes) e
( D)
células MCF-7 transfectadas com os genes indicados. Uma lista dos genes que se sobrepunham em todos os três conjuntos de dados está indicado no lado direito. (
C
) O número de pacientes nos grupos de Michigan e Harvard manifestando o mutante
EGFR
padrões de expressão (
P Art 0,05, correlação de Pearson), juntamente com o número manifestando um padrão gerado aleatoriamente (SD com base em 100 simulações). (
E
) Venn diagrama que ilustra a sobreposição entre as assinaturas dos
EGFR
-mutant células NSCLC e
EGFR
-transfected células MCF-7.
Identificação da Mutant
EGFR
Assinatura em coortes de pacientes com NSCLC
a seguir consultados bancos de dados de expressão de genes publicamente disponíveis de amostras de biópsia de tumor derivadas de duas coortes independentes de pacientes com NSCLC do Estados Unidos (15, 16) para determinar se um subconjunto de tumores expressa esta assinatura genética. Dos 194 genes, 102 (53%) foram representados na plataforma de perfil utilizado na coorte de Harvard, e 65 (34%) foram representados na coorte de Michigan. Com base em uma representação mapa de calor dos seus padrões de expressão gênica, os tumores de pulmão humano foram heterogêneos em seus padrões de expressão; no entanto, um subconjunto de tumores (9 de 84 [11%] na coorte de Harvard e 10 de 86 [12%] na coorte Michigan) exibiram um padrão de expressão semelhante ao da
EGFR
-mutant NSCLC gene assinatura (Fig. 2
B
).
Para determinar se as semelhanças observadas pela análise do mapa de calor atingiu significância estatística, os parâmetros foram criados que a similaridade definido como correlação de uma de Pearson positivo
P Art 0,05 (dois lados) entre o mutante
EGFR
padrão de assinatura e os valores de expressão de genes do tumor, tendo em conta tanto os genes sobre e sub-expressos na assinatura. Por esta definição, os tumores que se manifestam essa assinatura seria recapitular os padrões de sobre-e sub-expressão observada nos
EGFR
linhas celulares -mutant. A incidência de tumores que se manifestam a assinatura foi estatisticamente significativa (
P Art 0,01 para cada coorte). Baseado em simulações utilizando 100 assinaturas de genes selecionados aleatoriamente gerados a partir de cada uma das coortes (Fig. 2C)
Embora o
EGFR
estado mutacional de tumores a partir desses grupos de pacientes tem, a nosso conhecimento, não foram relatados,
K-ras
(códons 12, 13, ou 61) é conhecido por ser mutado em 29% e 45% dos tumores a partir de coortes de Harvard e Michigan, respectivamente [15; 16]. mutações somáticas no
EGFR
e
K-ras Quais são mutuamente exclusivos em NSCLC [17], o que levou os investigadores a hipótese de que esses eventos são geneticamente redundante e que uma mudança em ambos os genes não faz uma outra vantagem, quando estes acontecimentos ocorrem em conjunto na mesma célula [17]. Nós postulamos que, se esses eventos somáticos são geneticamente redundante, em seguida, ter os
K-ras
mutação confere o mutante
EGFR Perfil de transcrição. Consistente com esta ideia, observamos que
K-ras
estado mutacional correlacionados, porém de maneira fraca, com o mutante
EGFR
gene assinatura (Fig. 2
B, P =
0,07 e
P
= 0,04 nas coortes de Harvard e Michigan, respectivamente, pelo teste de testes de soma classificação dos perfis de coorte ordenadas pela expressão média de genes que foram aumentadas em
EGFR
celular -mutant linhas).
Mutant
EGFR
assinatura Enriquecido com genes EGFR-Dependent
Para investigar se algum dos genes na assinatura 194-gene foram regulamentados de EGFR-dependentes maneira, nós questionaram um banco de dados acessível ao público de células MCF-7 de cancro da mama que tinham sido transfectadas de forma estável com cinases constitutivamente ativos (
RAF1
,
MEK1
,
ErbB2
) ou com o tipo selvagem
EGFR
, o qual foi activado por tratamento com o EGF de curto prazo [18]. Nós investigamos a sobreposição entre as assinaturas de gene de
EGFR
-transfected células MCF-7 e
EGFR
-mutant células NSCLC. Dos 194 genes do mutante
EGFR
assinatura, 139 (72%) foram representados na plataforma de perfis para os transfectantes de células MCF-7 (11079 genes em todos foram representados em ambos os conjuntos de dados MCF-7 e NSCLC ). A análise destes 139 genes revelaram que os subconjuntos de genes que foram aumentados em células MCF-7 por causa da MEK, RAF1, ou transfecção com o EGFR sobrepostas aqueles em o mutante
EGFR
assinatura de expressão em células NSCLC (Fig. 2
D
).
dos 119 genes que foram ambos representados no conjunto de dados MCF-7 e aumento no
EGFR células
-mutant NSCLC, 44 (31%) foram aumentou com a
P Art 0,05 em
EGFR
-transfected células MCF-7, o que representou uma sobreposição muito significativa (
P Art 1E-12, one-sided o teste exato de Fisher, Fig. 2
E
). Por acaso, 14 dos 119 genes seria de esperar que se sobrepõem, indicando que a quantidade de sobreposição observamos excedeu o que seria esperado se o
EGFR
-transfected células MCF-7 e
EGFR
-mutant NSCLC células nada biologicamente em comum uns com os outros. Quando foi utilizado um ponto de corte mais rigoroso de
P Art 0,01 em vez de
P Art 0,05 para definir genes que foram aumentados em
EGFR
-transfected MCF-7 as células (576 genes no total), 28 coincidiu com a assinatura mutante EGFR NSCLC (possibilidade prevista de sete genes,
P
1E-10, one-sided teste exato de Fisher). Concluiu-se que, com base nas suas semelhanças com a assinatura de
EGFR
-transfected células MCF-7, a assinatura de
EGFR
-mutant células NSCLC foi enriquecido para genes transcricionalmente-se regulamentados pelo EGFR .
Identificação
PTGS2
como um gene necessário para o crescimento independente de ancoragem
Os genes que foram diferencialmente expressos em
EGFR
-mutant linhas de células NSCLC caiu em uma ampla gama de classes funcionais (categorizados nas funções dos genes Ontologia Molecular, www.geneontology.org) (Arquivos S3 e S4). As categorias com maior representação foram transdução de sinal, metabolismo, resposta imune, o transporte de iões, e do ciclo celular e proliferação. Genes nestas categorias que foram altamente expressos incluídos aqueles que codificam ligandos ErbB (
TGFA, AREG
, e
EREG
), ciclo-oxigenase-2 (
PTGS2
), um ligando para o receptor CX3CR1 quimiocinas (
CX3CL1)
, intracelulares e transmembranares cinases (
TRIB2, MET, mylk, STK39, ACVR1, TAOK3 e IFIH1
), fosfatases de proteína (
PTPN22, DUSP10 , PPAP2B, PTPRR,
e
PTPRE
), uma fosfatase lipídica (
SGPP2
), moléculas de adesão (
CEACAM6, ITGAV, PCDH7,
e
THBS1
) e proteínas de ligação de íons de cálcio (
S100A14
e
S100A16
).
Para examinar se esses genes diferencialmente expressos, que têm funções biológicas diferentes, faziam parte de uma ou mais redes de transdução de sinal, analisamos suas posições dentro globais redes de interação de proteínas conhecidas ou previstas (interactoma) usando o programa de software HiMAP (https://www.himap.org/index.jsp). Interactoma identificados por esta abordagem são organizados em uma série de estruturas modulares caracterizadas por nós localizado centralmente (chamados hubs) que possuem várias conexões com outras proteínas [19]. Embora esta abordagem é puramente exploratória e não carrega nenhum peso estatístico, os resultados no show levedura que centralidade em uma interactome proteína prevê importância biológica de uma proteína [20].
Dos 194 genes diferencialmente expressos, 118 tinham sido anotado em Gene ontologia, dos quais 102 foram incluídos no programa de software HiMAP (19). Desses 102 genes, 52 mapeados dentro de uma rede única (Fig. 3). Os centros de conexões em rede com o maior número de ligações (≥ 10) incluídos
CD44, MET, IRS1, GRB10, ITGA2, PTGS2 e THBS1,
todos os quais foram altamente expressa em
EGFR
células -mutant NSCLC, indicando que alguns dos genes diferencialmente expressos estavam em posições centrais desta rede de sinalização.
teórica proteína-proteína física e funcional mapa interação (interactome) foi tirado usando software HiMAP. Genes da assinatura são indicados em vermelho.
À luz da centralidade da
gene PTGS2
na rede interactome e da conhecida importância do seu produto gene ciclo-oxigenase-2 (COX -2) na sobrevivência e metástase das células cancerosas e seu potencial impacto clínico, dada a disponibilidade de ferramentas farmacológicas para inibir sua função enzimática [21], procurou-se investigar o seu papel em
EGFR
-mutant células NSCLC. Examinámos se o celecoxib inibidor da ciclooxigenase-2 anulou a capacidade destas células para proliferar em culturas de monocamada e de modo a formar colónias em ágar mole. Usando o celecoxib em doses baixas (0,5 uM e 1,0 uM) para minimizar os efeitos não específicos, a formação de colónias em agar mole diminuiu de um modo dependente da dose (Fig. 4), enquanto que a proliferação de monocamadas não se alterou (dados não apresentados).
imagens representativas de colónias de linhas celulares de NSCLC (painéis superiores) foram quantificados (painéis inferiores) depois fazê-los crescer em agar mole na presença ou na ausência de celecoxib. Os resultados são os meios de pelo menos três experiências independentes.
linhas celulares com
EGFR
deleções e mutações pontuais têm uma expressão distinta Profiles
Entre os pacientes com
EGFR
-mutant NSCLC, as diferenças na duração de sobrevivência e de resposta ao EGFR TKI tratamento foram observados, dependendo do tipo de
EGFR
mutação somática (exão 21 mutações pontuais contra exão 19 deleções) [22; 23] , sugerindo que estes dois tipos de mutações somáticas conferem propriedades biológicas distintas de células NSCLC. Apoiando esta possibilidade é evidência de que estes dois tipos de mutações somáticas conferir propriedades bioquímicas distintas de EGFR [9] – [11]. Embora agrupamento hierárquico não segregar os dois tipos de mutações em dois subgrupos distintos (Fig. 1), a hipótese de que a análise supervisionado revelaria diferenças transcricionais entre os dois tipos de mutações. Na verdade, foram observadas diferenças de transcrição claras. Usando critérios específicos (
P Art 0,01, mudança, pelo menos, duas vezes), identificamos uma assinatura de 270 genes em
EGFR
linhas celulares -mutant (que não estava presente no
EGFR
linhas celulares do tipo -wild) que distingue os dois tipos de mutações. Estes genes são listados na S5 Arquivo e ilustrado em um mapa de calor agrupado na Fig. 5. Foram examinados 7 dos 270 genes por PCR quantitativa e validado que 4 (57%) foram diferencialmente expressos entre linhas de células com mutações L858R contra aqueles com Δ746-750 mutações (S6 arquivo). A assinatura 270 para o gene foi analisada para o enriquecimento em funções de genes específicos, tal como definido pela assinatura base de dados Gene ontologia. células L858R-mutante foram enriquecidas para genes no cíclica kinase- proteína dependente de AMP, a proteína fosfatase-2ε- RAB3D- membro, Ras-família, e fosfolipase-Cβ1 dependente vias, enquanto os Δ746-750 mutantes foram enriquecidas para genes em os ligantes de quimiocinas CXC (2 e 3) -, integrina α6-, proteínas de ligação guanilato (1, 2, e 3) -, e os caminhos 10-dependentes (S7 Arquivo), demonstrando que os conjuntos de genes ativada pela interleucina-7 e dois tipos de mutação são funcionalmente distintos.
a assinatura 194-gene presente em
EGFR
linhas celulares -mutant mas-wild-type EGFR não distingue L858R (PM [ponto de mutação]) a partir Δ746- 750 (supressão). As células foram tratadas com (+) ou sem (-) gefitinib. Uma lista parcial dos genes que são diferencialmente expressos nos dois grupos é indicada à direita.
genes regulados pelo EGFR TKI Tratamento
Para identificar as alterações de expressão de genes que precederam, e possivelmente contribuiu para os efeitos biológicos do tratamento de TKI de EGFR em
EGFR
-mutant células NSCLC, as células foram sujeitas a um tratamento de curta duração com gefitinib. Como um controlo negativo nesta experiência, foram utilizadas as células H1975 TKI-resistentes, que têm uma mutação T790M que bloqueia a ligação ao TKI de EGFR [17]. Usando critérios específicos (
P Art 0,05), descobrimos que 54 genes foram regulados pelo TKI exclusivamente nas linhas de células TKI-sensíveis (HCC827, H3255, H4006 e) (S8 Arquivo), nenhum dos quais têm , a nosso conhecimento, foi relatado para ser genes dependente de EGFR. Entre estes genes, foi examinada 14 por PCR quantitativa e validado que 10 (71%) foram regulados diferencialmente em células TKI-sensíveis e resistentes (S9 do ficheiro). Genes que aumentaram em resposta ao TKI incluídos, entre outros, reguladores do ciclo celular (
CCNG2, CDKN1B, ID2, e KNTC2
) e um ligante para EphA2 (EFNA1). Genes que diminuíram incluir o
EphA2
receptor tirosina quinase, citocinas (
LIF, CCL20,
e
IL17B), fatores de transcrição (
FOXD1
e
POU1F1
), e proteína fosfatase (
DUSP4
e
DUSP6
).
regulação recíproca de EphA2 e EFNA1 é EGFR-Dependent
à luz da importância do eixo EphA na tumorigénese [24; 25], temos investigado o efeito do tratamento sobre o TKI de expressão do EphA2, outros membros da família Efa, e o seu ligando EFNA1. PCR quantitativa e análise de Western confirmou que o gefitinib mutuamente regulada a expressão do EphA2 e o seu ligando EFNA1 em linhas celulares de TKI-sensíveis (HCC827, H4006, H3255 e), mas não nas células H1975-TKI resistentes (Fig. 6
A- C
). EphA1, EphA5 e EphA6 não se alterou com o tratamento com gefitinib (Fig 7
A, E, e F
.); EphA4 diminuiu em apenas um subconjunto de células sensíveis TKI-H4006 (mas não HCC827) (Figura 7
C
.); e EphA3 foi inibida de um modo independente de EGFR (indicado pela supressão induzida pelo inibidor da tirosina quinase em células H1975) (Fig. 7
B
). Para avaliar mais completamente se a supressão da expressão do EphA2 se EGFR-mediada, examinámos o efeito de outro TKI de EGFR, erlotinib, e verificou que a expressão do EphA2 também inibida em células sensíveis a TKI, de uma forma semelhante à de gefitinib (Fig . 7
F
).
A análise quantitativa PCR
(A, B) Comprar e western blot
(C)
de EphA2
(A , C) Comprar e EFNA1
(B, C)
em linhas de células tratadas durante 6 h com (+) ou sem (-) gefitinib. Os resultados da PCR quantitativas representam as médias de pelo menos três experiências independentes e foram normalizadas com base na expressão do gene L32 arrumação. Os números sob as bandas são os resultados da análise densitométrica após a normalização para diferenças de carga baseado em actina.
As células foram tratadas durante 6 h com veículo, de 1 uM a gefitinib (A-E), ou 1 uM erlotinib (F). O ARN foi extraído e submetido a PCR quantitativa. Os resultados representam as médias de pelo menos três experiências independentes e foram normalizadas com base na expressão L32.
EphA2 activação é necessária para Anchorage-Independent
Crescimento
Nós postulamos que a sinalização EphA2 mantém características neoplásicas de células NSCLC e testado esta hipótese através do tratamento HCC827 células com o EphA2-Fc, um péptido recombinante contendo o domínio extracelular do EphA2 fundido com o F
fragmento C de IgG, o que impede a interacção de efrina a ligandos com Epha endógena, bloqueando activação Epha [26]. Em relação à de controlos, as células tratadas com o EphA2-Fc apresentaram uma diminuição na formação de colónias em agar mole (Fig. 8), enquanto que a sua proliferação em culturas em monocamada não se alterou (dados não apresentados), indicando que Epha foi necessário para a proliferação independente de ancoragem destas células.
imagens representativas de colónias de linhas celulares de NSCLC (parte superior) com quantificação de colónias (inferior), após o crescimento em agar mole na presença ou na ausência do EphA2-Fc. Os resultados são os meios de pelo menos três experiências independentes.
Discussão
Aqui nós relatamos que as células NSCLC com somática
EGFR
mutações têm um perfil transcricional único e que linhagens celulares com os dois tipos mais comuns de
EGFR
mutações têm diferenças claras de transcrição. Minando as bases de dados de expressão de genes utilizando um mutante
EGFR
assinatura espec�ico como uma sonda, descobrimos que muitos dos genes neste assinatura de expressão eram dependentes de EGFR, convergiram em redes comuns com base em proteína conhecida ou prevista interactoma, e foram expressos em tumores a partir de um subconjunto de doentes com NSCLC. Dois genes foram elucidadas,
EphA2
e
PTGS2
, que promoveu a clonogenicidade de
EGFR
-mutant células NSCLC, que são de particular interesse do ponto de vista clínico, porque eles podem ser inibida farmacologicamente.
genes dentro do mutante
EGFR
proteínas assinatura expressão do gene codificam com um conjunto diversificado de funções celulares. A influência do EGFR nesta assinatura foi demonstrado pela sua sobreposição com a de células MCF-7 transfectadas com EGFR e a presença de alvos transcricionais conhecidos de EGFR, incluindo
PTGS2,
os ligandos ErbB
EREG
e
AREG,
e
Met
, um receptor tirosina quinase que foi relatado recentemente para ser ativado em
EGFR células
-mutant NSCLC e para promover a resistência TKI nestas células [ ,,,0],8; 27-29]. Aqui demonstramos que o produto do gene de
PTGS2
, ciclo-oxigenase-2, tem um papel importante, promover o crescimento independente de ancoragem. Esta assinatura continha muitos genes não conhecidos previamente para ser altamente expressa em
EGFR
-mutant NSCLC, incluindo
LY96
e
CX3CL1
, que têm conhecido funções imunomoduladoras.
LY96
codifica MD2, uma molécula acessória requerida para a activação do receptor de tipo Toll-4, que promove a sobrevivência de células e induz a secreção de moléculas imunossupressoras que promovem a evasão do tumor a partir de vigilância imune [30].
CX3CL1
codifica uma proteína secretada chamado fractalcina que recruta CX3CR1 expressando natural killer e linfócitos T para o microambiente do tumor, promovendo assim as respostas anti-tumorais dependentes de natural killer
in vivo
[31]. Por outro lado, também demonstrou fractalcina propriedades pró-metastáticos com base na evidência de que promove a migração de células do tumor e aumenta a adesão de células tumorais para células endoteliais [32; 33].
Para identificar genes regulados num EGFR forma dependente, nós tratamos
EGFR
-mutant células NSCLC com gefitinib. Dois dos genes identificados por esta abordagem,
EphA2
e seu ligante
EFNA1
, foram regulamentados de forma recíproca. Potencialmente mediar este efeito de gefitinib, MAP quinase, um efector a jusante do EGFR, inibe a
EFNA1
expressão, aliviando assim a supressão induzida por EFNA1 de
EphA2
expressão [25]. Além disso, verificou-se que as interações EphA2 /EFNA1 foram necessários para o crescimento independente de ancoragem de HCC827 células, o que corrobora os resultados de um estudo anterior que demonstram que a transformação celular v-erbB-dependente é atenuado pelo EphA2 ligando de ligação [25]. Outros genes que encontramos para ser regulada por gefitinib em células sensíveis ao TKI incluem
CCNG2, CDKN1B, ID2, e KNTC2
, que são componentes de vias de regulação do ciclo celular. Tendo em conta que a sua expressão mudou antes de qualquer evidência bioquímica de prisão ou apoptose proliferativa, estes genes podem ser parte de um programa de sinalização anti-proliferativa ativado por gefitinib. Finalmente, dois dos genes que diminuiu em abundância com o tratamento com gefitinib (
CEACAM-6
e
DUSP6
) foram também altamente expressos em
EGFR
-mutant células, sugerindo que estes genes são potencialmente importantes EGFR alvos de transcrição nestas células.
em resumo, nós identificamos um transcriptoma em células NSCLC que elucida
EGFR
induzidas por alterações de expressão de genes mutantes e fornece uma base para transcricional as diferenças biológicas observadas em NSCLC com os dois tipos mais comuns de
EGFR
mutações. Uma análise mais aprofundada destes genes podem nos informar sobre processos biológicos que podem ser usados para identificar alvos intracelulares de potencial benefício terapêutico para os pacientes com esta doença.
Materiais e Métodos
Reagentes
Gefitinib (Astra Zeneca Pharmaceuticals, Wilmington, DE) e erlotinib (OSI Pharmaceuticals, Melville, NY) foram presentes. Nós comprado recombinante murino EphA2-Fc quimera (R D Systems, Minneapolis, MN), anticorpos policlonais derivados em coelhos contra o EphA2 e EFNA1 (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA), uma peroxidase de rábano ligada ao anti-ratinho e formiga -rabbit anticorpos secundários (Cell Signaling Biotecnologia, Beverly, MA), e um anticorpo contra β-actina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Linhas Celulares
A célula NSCLC linhas utilizadas neste estudo foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e foram cultivados em 5% de CO
2 a 37 ° C em meio RPMI 1640 com alto teor de glucose (4,5 g /L; GIBCO-BRL, MD), suplementado com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Logan, Utah).
Gene Expression Profiling
RNAs foram isolados utilizando o Kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA) e hibridizado com Affimetrix U133 + 2,0 chips de expressão gênica no Facility MD Anderson Cancer Center Microarray Núcleo (apoiado em parte pela concessão CA # 16672). dChip (https://www.dchip.org) (versão de 2005) foi usado para extrair valores de expressão para cada conjunto de sonda. Controle de conjuntos de sondas e conjuntos de sondas com sufixos “_s_at” e “_x_at” em seu ID foram excluídos (porque esses conjuntos de sondas pode ter como alvo mais de uma sequência única), deixando 39.114 de 54.675 conjuntos de sondas originais para análise posterior.
Determinação de genes diferencialmente expressos
duas amostras
t
testes (usando log-transformados de dados) foram utilizados para determinar diferenças significativas na expressão gênica entre
EGFR
-mutant e do tipo -wild linhas de células NSCLC e entre transfectadas-EGFR e as células MCF-7 parentais (
P valores
eram dois lados). Para a análise dos efeitos do tratamento com gefitinib, uma diferença emparelhado foi calculado como o log
2 (tratados com gefitinib /tratados com veículo).
GO análise enriquecimento
grupos de genes funcionais definidos