Abstract

Fundo

do tipo A lamins são do tipo V proteínas dos filamentos intermediários codificados pelo gene

LMNA

. Mutações no

LMNA

dar origem a diversas doenças degenerativas relacionadas ao envelhecimento prematuro. Um tipo laminas também influenciam a actividade da proteína do retinoblastoma (pRb) e oncogenes tal β-catenina. Por conseguinte, tem-se especulado que a expressão de lamins A-tipo também podem influenciar a progressão do tumor.

Metodologia /Principais Achados

Um arquivo de cancro colorectal (CRC) e tecido do cólon normal foi examinado para Uma expressão de laminas de tipo. Utilizou-se o método de Cox proporcional taxa de risco (HR) para investigar a sobrevida do paciente. Utilizando linhas de células de CRC foram investigados os efeitos de lamina A expressão de outros genes por RT-PCR; sobre o crescimento de células por análise por FACS; e na invasividade por ensaios de migração celular e siRNA knockdown de genes alvo. Descobrimos que a lamina A é expresso em células-tronco do cólon e que os pacientes com um tipo de tumores que expressam de lamina têm significativamente pior prognóstico de pacientes com tumores negativos Um tipo de lamina (HR = 1,85,

P

= 0,005) . Para compreender esse achado, foi estabelecido um sistema modelo baseado na expressão de GFP-lamina A em células CRC. Descobrimos que a expressão de GFP-lamina A nestas células não afectou a proliferação das células mas não promoveu muito maior motilidade celular e capacidade invasiva. A razão para este aumento da capacidade de invasão foi de que a expressão de lamina A promoveu aumento da regulação da actina agregação proteína T-plastina, que conduz a regulação negativa da molécula de adesão celular E-caderina.

Conclusões

Expressão de laminas de tipo a aumenta o risco de morte por CRC, porque a sua presença dá origem a um aumento da capacidade de invasão e potencialmente uma haste mais fenótipo celular semelhante. Este relatório liga diretamente do tipo A expressão lamina à progressão do tumor e aumenta o perfil de

LMNA

de um implicado em vários, mas raras doenças genéticas para um gene envolvido em uma das doenças mais comuns no mundo ocidental.

Citation: Willis ND, Cox TR, Rahman-Casañs SF, Smits K, Przyborski SA, van den Brandt P, et al. (2008) Lamin A /C é um biomarcador de risco no cancro colorectal. PLoS ONE 3 (8): e2988. doi: 10.1371 /journal.pone.0002988

editor: Kevin G. Hardwick, University of Edinburgh, Reino Unido

Recebido: 06 de maio de 2008; Aceito: 17 de julho de 2008; Publicação: 20 de agosto de 2008

Direitos de autor: © 2008 Willis et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Nacional de Saúde serviço de Investigação e Fundos de Desenvolvimento, Associação para Pesquisa do Câncer International, European Framework União Programa 6

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

lamins a e C são do tipo V proteínas dos filamentos intermediários que fazem parte de uma rede filamentosa chamada de lâmina nuclear forro da membrana nuclear interna (INM) [1]. Um tipo laminas são produtos de splicing alternativo do

LMNA

gene, que foi mapeado no cromossoma 1q21.3 [2]. Mutações neste gene estão a causa subjacente de doze doenças genéticas diferentes que são designadas colectivamente por laminopatias [3]. Laminopatias são todas as doenças degenerativas que afectam principalmente os tecidos de origem mesenquimal [3]. Os possíveis mecanismos laminopatias subjacentes têm sido intensamente investigados ao longo dos últimos sete anos, o que levou à conclusão de que um tipo lamins contribuir para a sobrevivência celular de duas maneiras distintas. Em primeiro lugar, um tipo laminas interagir com proteínas do citoesqueleto importantes ligantes nesprins denominadas, por meio de proteínas de domínio sol, que liga o INM para a membrana nuclear externa (ONM) através do lúmen [4], [5]. Os nesprins em elementos vez de ancoragem do citoesqueleto para o ONM [6] – [9], hardwiring assim o citoesqueleto para a lâmina nuclear e proporcionando um dispositivo para a transdução de estresse mecânico detecção da membrana do plasma para o núcleo [10], [11 ]. Em segundo lugar, tipo-A laminas interagir com um número de parceiros de ligação no interior do núcleo, que por sua vez interagem com e influenciam a actividade de importantes reguladores do crescimento. Das proteínas que de tipo A laminas interagem com, o melhor caracterizados são os chamados proteínas LEM domínio [12], incluindo as proteínas de membrana integral emerin [13], [14] e MAN1 [15], bem como o nucleoskeleton LAP2α proteína [16]. Um complexo de laminas de tipo A e emerin foi recentemente relatado para regular a acumulação nuclear de β-catenina activo e perda de função emerin leva a sinalização desregulada β-catenina e crescimento de auto-estimulação em fibroblastos [17]. De modo semelhante, um complexo de MAN1 e tipo-A laminas foi mostrado para interagir com o receptor regulada SMAD (rSMAD) e para antagonizar a sinalização de TGF-β por inibição rSMAD no INM [18], [19]. Finalmente, um complexo de LAP2α e tipo-A laminas e liga-se a formas não fosforilados amarras do crescimento supressor pRb no núcleo [20]. LAP2α e A de tipo laminas ambos participam na repressão Rb dependente E2F [21] e a perda de LAP2α ou de um tipo laminas em fibroblastos resultados na entrada na fase S acelerada, devido à perda de actividade de pRb [21], [22].

Dada a importância das laminas de tipo a e os seus parceiros de ligação para a regulação das vias de crescimento, que tem sido especulado que estas laminas pode ser ligada a progressão tumoral [23]. Estudos anteriores relataram expressão diferencial de lamins A-tipo em tecidos tumorais e ligaram a ausência de laminas A-tipo para o aumento da proliferação do tumor. No entanto, eles não conseguiram ligar mudanças na expressão para o prognóstico do paciente ou diretamente para a progressão do tumor [24]. Decidimos, portanto, investigar como expressão de lamins Um tipo pode influenciar tanto a progressão e os resultados de um tumor comum. Para isso, selecionou um arquivo muito grande de tecido CRC ligado a uma extensa base de dados do paciente [25]. Inesperadamente, descobrimos que a expressão de laminas Um tipo dentro de um tumor era um indicador de risco altamente significativa da mortalidade relacionada com o tumor. Em investigações jusante, descobrimos que a expressão de lamina A em linhas celulares de CRC promovido invasividade através de expressão sobre-regulada do t-plastina proteína de agregação da actina, o que por sua vez dá origem à expressão para baixo regulada da molécula de adesão celular E-caderina . Conclui-se que a expressão de lamins A-tipo no CRC promove invasão do tumor através da reorganização do citoesqueleto de actina.

Resultados

Lamin A é um biomarcador de células estaminais adultas em criptas colônicas

Antes de se investigar a progressão do tumor um tipo de influência laminas, avaliou-se a distribuição de laminas de tipo a na mucosa do cólon normal, por coloração com secções de tecido de um anticorpo monoclonal específico para essas proteínas. Como esperado [26], do tipo A laminas foram altamente expresso nas camadas epiteliais diferenciadas funcionalmente e também foram fortemente expressos no tecido envolvente do estroma e do músculo subjacente. Por outro lado, do tipo A expressão lamina foi muito fraca ou ausente na maioria das células dentro das criptas do cólon. No entanto, do tipo A expressão lamina era alta em cerca de cinco a dez células na base das criptas (Figura 1A, setas). As células coradas positivamente nas criptas foram muito semelhantes em número e ocupava uma posição correspondente à que geralmente entendido como sendo o nicho de células estaminais epiteliais do cólon [27], [28]. Para investigar melhor a identidade destas células positivas do tipo A lamina, secções em série foram coradas com anticorpos contra laminas A C ou a proliferação PCNA biomarcador. As células nas criptas que coraram positivamente para PCNA eram negativos para laminas do tipo A, enquanto que as células que foram negativos para PCNA eram positivos para laminas do tipo A (Figura 1B) o que implica que o pequeno número de tipo A lamina cripta basal positiva células podia de facto ser postulada como sendo células estaminais. Também descobrimos que, embora os anticorpos que especificamente detectados lamina A coraram o nicho de células estaminais proposto (mas não as células na zona de amplificação de trânsito adjacente), lamina C não foi detectado nem no nicho de células estaminais ou do trânsito células amplificação, mas foi expresso em células epiteliais diferenciadas e muscular subjacente (Figura S1). Assim, a expressão de lamina A na ausência da lamina C aparece para definir um grupo de células na região basal da cripta do cólon, o que corresponde a uma zona postulada como sendo o nicho de células estaminais.

secções finas (A) amostras de formalina fixos, cera incorporado de cólon normal foram coradas seguinte recuperação antigênica calor mediada com um anticorpo monoclonal JoL2 anticorpos contra lamins A /C. As secções foram ligeiramente contrastadas com Mayer Haemalum. As setas indicam células epiteliais diferenciadas enquanto que as setas indicam a localização esperada do nicho de células estaminais na base da cripta. Barras de escala = 150 mm (painel da esquerda) 50 mm (painéis da direita). (B) As secções em série de cólon normal foram coradas com anticorpos para qualquer laminas A /C (JoL2) ou PCNA (PC10) e processados ​​como descrito acima. As setas indicam lentamente dividindo células na base das criptas, que coraram positivamente com JoL2 mas negativamente com PC10. Barras de escala = 150 mm.

A expressão de lamins A-tipo é um indicador de risco no CRC

O estudo de coorte Holanda sobre dieta e câncer [29] é um estudo prospectivo de coorte. Inicialmente, amostras de tecido de 819 pacientes foram solicitados a partir de 54 laboratórios de patologia toda a Holanda. casos incidentes incluiu os pacientes que desenvolvem câncer colorretal entre 1989 e 1993. Tumor material não estava disponível para 5% dos casos e das 775 amostras de tecido disponíveis remanescentes, 737 continham material tumor suficiente para a análise imuno-histoquímica. Utilizando parâmetros padrão para testar ao nível de significância de 5% e com um poder de 90%, a população mínima necessária para detectar com confiança taxas de risco pequenas seria 516, assim era seguro assumir que o tamanho da amostra foi grande o suficiente para produzir significância estatística .

coloração imuno-histoquímica para detectar a expressão de lamins a /C de recuperação na sequência de antigénio foi realizada em todas as amostras disponíveis. Em todas as secções do tecido do estroma em torno do cancro foi sempre fortemente positivo para laminas A /C proporcionando assim um controlo positivo interno. Utilizando coloração de tecido do estroma, como um critério para a recuperação de antigénio bem sucedida, 673 (91%) das amostras estavam disponíveis para classificação. Descobrimos que, embora houvesse alguma variação na intensidade de coloração total, lâmina nuclear expressão A /C no interior do tumor poderia ser facilmente classificado como presente (Figura 2E-H) ou ausente (Figura 2A-D) a partir do núcleo. Verificou-se também que em um pequeno número de casos, houve coloração citoplasmática esporádica e estas amostras foram marcados como negativos quando coloração nuclear estava ausente. Na sequência de pontuação cega de slides, recuperação de paciente e sobrevivência informações do banco de dados levou o número final de casos únicos de ser reduzida a 658 devido a duplicação de códigos de administração de pacientes e mais 2 casos foram excluídos após serem classificados como tumores do anel de sinete.

4 mm fixado em formol e secções embebidas em parafina de 656 adenocarcinomas colorretais humanos independentes foram retirados de pacientes que participaram do estudo de coorte Holanda sobre dieta e câncer. As secções de tecido foram submetidas a imuno-histoquímica utilizando o monoclonal de ratinho JoL2 anticorpo anti-humano de lamina A /C antes da visualização cromogénio e contracoloração luz com Mayers Haemalum para diferenciar núcleos. A-D mostram a coloração positiva do estroma (S) de tecido circundante negativamente coloração do tumor do tecido (T). (A) moderadamente bem diferenciado fase I adenocarcinoma; (B) moderadamente bem diferenciado estágio adenocarcinoma II; (C) moderadamente bem diferenciado fase III adenocarcinoma; (D) moderadamente bem diferenciado estágio IV adenocarcinoma. E-H mostram coloração positiva do estroma (S) de tecido circundante positivamente coloração do tumor do tecido (T). (E) moderadamente bem diferenciado fase I adenocarcinoma; (F) moderadamente bem diferenciado estágio adenocarcinoma II; (G) moderadamente bem diferenciado fase III adenocarcinoma; (H) moderadamente bem diferenciada adenocarcinoma estágio IV. Barras de escala = 30 mm.

Durante o período de acompanhamento, 246 pacientes morreram, sendo 163 destes pacientes morrem como resultado da CRC. Das 656 amostras disponíveis imuno-histoquimicamente avaliadas, lâmina nuclear expressão A /C verificou-se ser positivo em 463 (70%) pacientes e negativo em 193 (30%) pacientes. Dentro do grupo de amostra dos pacientes que morreram de causas relacionadas com CRC dentro do período de estudo (dez anos), 127 resultados positivos para lamins A /C, enquanto 36 resultados negativos. Usando cálculos Cox proporcional de risco [30], descobrimos que os pacientes que expressam laminas A /C dentro do tumor eram quase duas vezes mais probabilidade de morrer (hazard ratio [HR] 1,85; 95% intervalo de confiança [IC] 1,16-2,97) do CRC relacionada causas em comparação com pacientes clinicopathogically idênticos que foram negativos para laminas a /C (

P

= 0,005) (Figura 3). Assim expressão de lamin A /C em um tumor foi fortemente correlacionada com a morte relacionada CRC.

análise de risco cumulativo geral para a presença de expressão lamin A /C e câncer relacionado a mortalidade colorectal para a fase pacientes I-III na Holanda estudo de coorte sobre dieta e câncer. taxa de risco relativo (HR) = 1,85 (IC 95% = 1,16-2,97),

p = 0,005

(ajustada por sexo e idade no momento do diagnóstico).

A expressão de lamina A em linhas celulares de CRC promove o aumento da capacidade de invasão

a constatação de que a expressão de lamin a /C em tumores de pacientes está intimamente correlacionado com CRC mortalidade relacionada foi inesperado e até certo ponto contra-intuitivo. Portanto, para entender por que a expressão de lamins A /C aumenta o risco de morte em CRC, obtivemos um número de linhas celulares de CRC e avaliada inicialmente-los para o status lamin A /C por immunoblotting. Em uma linha de células pré-metastática, SW480, lamina A era quase indetectável (Figura S2A, B), enquanto que os níveis de expressão de laminas B

1, B

2 e C foram semelhantes para outras linhas celulares de CRC (por exemplo HT29 ). SW480 foi, então, escolhido para investigação. Para determinar a expressão de lamina A pode afectar SW480, as culturas foram estavelmente transfectadas com GFP ou um GFP-lamina Uma construção. A seguir à transfecção estável com lamin-GFP A quantidades moderadas de ambos lamina endógeno A, bem como a proteína de fusão foram detectados, enquanto que nas culturas transfectadas GFP, lamina A permaneceu ausente (Figura S2C, D). A morfologia das células na GFP e GFP-culturas transfectadas de lamina A foi também diferente. A morfologia das células em culturas transfectadas GFP (SW480 /CNTL) era indistinguível de culturas não transf ectadas (SW480), com muitas células que foram altamente achatadas ou que crescem em cima uns dos outros. Em contraste, em culturas transfectadas GFP-lamina A (SW480 /lama), as células tinham uma aparência mais semelhante fuso e cresceu como uma monocamada a baixa densidade celular (Figura 4A)

.

(A) A morfologia das não-transfectadas SW480, SW480 /cntl e SW480 /Lama foi comparado por microscopia de contraste de fase. SW480 /CNTL e células não transfectadas apresentaram uma morfologia achatada e de crescimento multi-camadas. Por contraste, a expressão ectópica de GFP-lamina A (SW480 /Lama) pareceu induzir alterações morfológicas, incluindo o aparecimento de uma forma fusiforme e crescimento como uma monocamada. Barra de escala = 10 mm. (B) feridas raspadinhas foram feitas em 100% as culturas confluentes de SW480 /cntl ou células /Lama SW480. imagens de contraste de fase foram realizadas a cada duas horas durante um período de 12 horas a partir de regiões idênticas. Barra de escala = 200 pm. (C) O tamanho da ferida relativamente ao tamanho da ferida de partida foi medida após 12 horas em três experiências independentes e expressos como uma redução percentual do tamanho da ferida +/- desvio padrão (D.P.). A migração celular foi ~seven vezes mais rápido em SW480 /lama em comparação com culturas SW480 /CNTL, p 0,005. (D) as características do ciclo celular foram investigados utilizando citometria de fluxo. A proporção de células em cada fase do ciclo celular é dada como média ± D.P.. de três réplicas. Não há diferenças consideráveis ​​das células dinâmica do ciclo entre as duas linhas de células foram detectados.

O comportamento migratório /metastático em células cancerosas é tipicamente associada com alterações fenotípicas [31]. Para investigar se a morfologia celular alterada correlacionada com o comportamento migratório alterada realizamos ensaios de motilidade celular nas culturas. Seguindo zero ferimento, o fechamento da ferida foi sete vezes mais rápido em culturas transfectadas com GFP-lamina A comparação com culturas transfectadas com GFP (Figura 4B C) ou células não transfectadas (não mostrados), mostrando que as células transfectadas com GFP-lamina A eram, de facto mais móveis do que a utilização de células transfectadas com GFP ou células não transfectadas. Investigamos outras características do seu comportamento celular que pode alterar, como resultado da expressão de lamina A, incluindo o crescimento e divisão celular. Usando citometria de fluxo não encontramos diferenças significativas na dinâmica do ciclo celular em GFP-lamina A contra células GFP transfectadas (Figura 4D). Assim, as características de nós investigamos única morfologia celular e a motilidade foram alterados nas células que expressam lamina A.

Num estudo recente [32], a expressão da proteína-agregação de actina, L-plastina em células SW480 levou a down-regulação da caderina-e e aumento da capacidade de invasão. Plastins são uma família de proteínas de agregação de actina que está envolvido na organização do citoesqueleto de actina e são expressos numa vasta gama de tecidos [33], [34]. A expressão intensificada de outro membro da família plastina, t-plastina tem sido associada com células resistentes a ambos drogas e radiação. Da nota particular é o aumento significativo da expressão de T-plastin relatado em cancros humanos resistentes à cisplatina [34]. Segue-se que os tumores resistentes aos medicamentos são susceptíveis de ser mais agressivos. Nossa descoberta de que a taxa de mortalidade em pacientes com tumores que expressam lamin A /C é o dobro de pacientes com /C negativos tumores lamina A sugere que lamina A expressão /C também está associada com o comportamento tumoral mais agressivo. Além disso, a lamina A /C está pensado para influenciar organização do citoesqueleto de actina através de interacções com proteínas ligantes tais como nesprins [4]. Além disso, a actividade de T-plastina foi avaliado em células de carcinoma do cólon HT29 [33], que se sabe estarem lamina A positivo (neste documento). Questionamos, portanto, se a expressão da GFP-lamina A em células SW480 causou mudanças jusante na expressão T-plastin e se T-plastin poderia estar implicado no aumento da capacidade de invasão observado aqui.

As mudanças na T-plastin e E- Os níveis de expressão de caderina foi investigada por RT-PCR. Verificou-se que o t-plastina não foi expressa em células transfectadas com GFP, mas estava presente em níveis elevados em células expressando GFP-lamina A. Em contraste, a E-caderina foi expressa a níveis elevados em células que expressam GFP sozinho, mas estava ausente de células que expressam GFP-lamina A (Figura 5A). Assim, o aumento da motilidade das células que expressam GFP-lamina A provável surge porque estas células são menos aderente, como resultado da perda de expressão de E-caderina e exibem actina dinâmica melhoradas. Para determinar se a lamina A expressão-regulada dependente de T-plastin observado, de fato, fazer com que a infra-regulação da caderina-E e aumento da motilidade celular, realizamos knockdown siRNA de T-plastin em Lamin-GFP A células SW480 que expressam. Em células tratadas com siRNA específico, t-plastina era indetectável e E-caderina foi regulado para cima (Figura 5B). Importante, a seguir zero ferimento, o fechamento da ferida também foi significativamente mais lento em culturas tratadas com siRNA-T específicas de plastina em comparação com culturas tratadas com siRNA mexidos (Figura 5C, D). Assim, a expressão de T-plastina-regulada, decorrente da expressão de lamina A afeta a expressão de E-caderina e directamente resulta em mais as propriedades invasoras da lamina A transfectadas linha de células de CRC

.

(A) A expressão de T-plastin e e-caderina transcrições em SW480 /cntl e células SW480 /Lama foi investigado usando semi-quantitativa RT-PCR. O carregamento igual de material de partida foi determinada por amplificação β-actina. células SW480 /lama foram encontradas para expressar níveis significativamente mais elevados de ARNm de T-plastina comparação com SW480 /CNTL, mas níveis significativamente mais baixos de ARNm de caderina-E, em comparação com células de controlo (

P

0,005). (B) As culturas SW480 /Lama foram tratados com mexidos siRNA ou siRNA específico para T-plastin. 108H ARN após tratamento foi extraído e amplificado por RT-PCR utilizando iniciadores específicos para t-plastina e E-caderina. Cem por cento de knockdown t-plastina estava acompanhada de re-expressão de transcritos de E-caderina. (C, D) Alternativamente, zero ferimento foi realizada em culturas confluentes 108h após o tratamento siRNA e fechamento da ferida foi medida tal como descrito na Figura 4B, C. A migração celular foi 2 vezes mais rápido em culturas tratadas com siRNA mexidos em comparação com culturas tratadas com SIT-plastin (

p Art 0,05). Barra de escala = 200 mm.

Discussão

Neste trabalho, relatamos duas descobertas novas e inesperadas. Em primeiro lugar, Lamin A, mas não lamin C é um biomarcador potencial do nicho de células-tronco na cripta do cólon e em segundo lugar, a expressão de lamin A /C em tecidos CRC está fortemente correlacionada com a mortalidade relacionada com CRC e, portanto, lamin A /C representa um novo e importante biomarcador prognóstico em CRC.

a localização do nicho de células-tronco no cólon foi extrapolada a partir de células cinética e estudos de radiomarcação. Por marcação radioactiva células da cripta em fase S com timidina tritiada, a velocidade média de migração de células em relação à sua posição de células foi medido. Usando esta abordagem, a origem de migração e, por extrapolação, o nicho de células estaminais tem sido previsto para residir na base da cripta [35]. O número de células estaminais que ocupam este nicho aproxima-se entre 5-10 células [36]. Mais recentemente, a expressão do elemento de resposta de Wnt Lgr5 foi mostrado para definir células estaminais do cólon e tem sido utilizado para confirmar que as células-tronco ocupar um nicho na base das criptas [27]. As células de um número equivalente e que ocupam precisamente nicho que são facilmente coradas com os anticorpos de detecção laminas A /C ou lamina A, mas não são coradas com anticorpos específicos de detecção de lamina C. Em contraste, em células que ocupam a zona de trânsito de amplificação, expressão de ambos lamina A e lamin C está ausente. Como esperado [26], [37], [38], ambas as laminas são prontamente detectado no epitélio funcional diferenciado na mucosa do cólon. Consistente com a ideia de que a lamina A é um biomarcador potencial de células-tronco do cólon, as células na base da cripta, que são positivas para a lamina A, são geralmente negativos para a PCNA proteína de replicação do ADN, como seria de esperar em células que são na sua maioria repouso [39]. Que lamin A é um biomarcador potencial das células-tronco adultas tem implicações gerais importantes para a doença. Lamins A /C está mutado em uma ampla gama de doenças degenerativas que estão ligadas ao envelhecimento prematuro [3], e tem sido sugerido que uma causa da degeneração nestas doenças é a perda da função de células estaminais adultas [40]. Essa expressão lamin A é conhecida no nicho de células-tronco adultas do cólon, presta apoio directo a esta hipótese. A constatação de que lamina A pode ser um biomarcador de células-tronco putativa tem outras implicações para a nossa descoberta de que a expressão de lamin A /C no CRC está estreitamente correlacionadas com um aumento do risco de mortalidade relacionada com o CRC, uma vez que poderia ser considerado viável que as células cancerosas que expressam lamina a pode ter uma mais-tronco fenótipo de células-like e, portanto, ser muito mais perigoso [41].

a nossa constatação de que a expressão de um tipo lamins no tecido CRC está correlacionada com um aumento de duas vezes na mortalidade relacionada CRC , em comparação com ausência de laminas de tipo a, para a primeira vez que estas proteínas liga directamente a progressão de uma doença comum. Estudos anteriores descreveram expressão alterada de lamins A-tipo em uma variedade de cancros, incluindo cancros da pele, pulmão, vasos linfáticos e dos tecidos moles [24], [37], [42] – [44]. No entanto, nenhum desses estudos era capaz de ligação quer a ausência ou presença de um tipo laminas à progressão do tumor, apesar de, pelo menos, um estudo [24] sugeriram que a perda de expressão de laminas de A /C, foi correlacionada com a taxa de proliferação melhorados em tumores. O outro problema com estes estudos anteriores que é um número limitado de amostras estavam disponíveis para análise e, consequentemente estudar tamanhos caiu abaixo do limiar para a análise estatística de confiança. Em contraste, a nossa descoberta de corrente baseia-se numa coorte suficientemente grande o suficiente para oferecer confiança completa nos níveis de significância relatados.

A nossa descoberta é, em certa medida contra-intuitivo, em que a expressão de laminas de tipo A em várias células geralmente diminui a proliferação de células [21], enquanto ausência de um tipo laminas pode ser correlacionada com uma falha de se submeter a paragem do crescimento na confluência [22]. Portanto, a hipótese nula utilizada no início do estudo foi que a ausência de laminas Um tipo iria ser correlacionado com o aumento do risco de morte relacionada com o cancro. Usando o modelo CRC linhas celulares não foi possível detectar alterações significativas na taxa de proliferação de células em células expressando lamina A comparação com as células de um fundo genético idêntico que não tinham expressão de lamina. No entanto, conseguimos detectar um aumento significativo de propriedades invasivas quando comparamos lamina A expressando células para células em que a expressão de lamina A está ausente. As propriedades invasivas destas células surge porque a presença de lamina A provoca uma sobre-regulação a jusante do t-plastina, que por sua vez conduz a regulação negativa da E-caderina. Plastins são uma família recentemente descrita de proteínas de agregação de actina que têm sido implicados na invasão /metástase [34]. Na mesma linha celular, como utilizado no presente estudo, a expressão de L-plastina foi relatado de conduzir a expressão regulada por baixo de E-caderina e aumento da capacidade de invasão e tem sido estreitamente correlacionada com a metástase [32]. Os nossos resultados actuais são inteiramente consistente com o estudo anterior, mas sugerem, em primeiro lugar, que controla lamina A esta via e, por outro, que a capacidade de invasão pode ser induzida por expressão de T-plastina através do mesmo mecanismo. Curiosamente, também observamos que a lamina endógeno A foi detectado em células SW480 após expressão estável de GFP-lamina A, ao passo que na presença de GFP sozinho lamina A permaneceu ausente. É bem conhecido que um tipo laminas são susceptíveis de clivagem na região de não-helicoidal ligante 2 [3]. Lamina A existe em células quer como dímeros ou tetrâmeros paralelas anti-paralelos em que o domínio N-terminal de cabeça se sobrepõe a região ligante 2 [45]. Uma vez que a porção da GFP está localizado na extremidade N-terminal, talvez esta grande proteína ligante protege 2 de degradação proteolítica e, portanto, tanto estabiliza-GFP lamina A e endógena lamina A. O corolário da presente hipótese é que a ausência de lamina A em linhas celulares SW480 é devido a modificação pós-tradução da proteína.

Como a presença de lamina a influencia a expressão de uma proteína de agregação da actina é o objecto de estudos a jusante. No entanto, podem prever-se dois mecanismos distintos. Foi recentemente demonstrado que um tipo laminas influenciar directamente a organização do citoesqueleto, a resistência à tracção das células [46] e a sua capacidade de responder ao estresse [10]. Isto é conseguido através do complexo de PT, que medeia as associações entre a lâmina nuclear e o citoesqueleto através dos nesprins [4]. Por conseguinte, uma possibilidade é de que a presença ou ausência de lamina A em uma célula cancerosa pode conduzir directamente a reorganização do citoesqueleto, através de um circuito fechado de realimentação, que detecta a força de tensão da célula. Alternativamente, lamina A tem sido demonstrado que interagem directamente com uma variedade de factores de transcrição [17] e a sua presença pode influenciar directamente a expressão do t-plastina. De qualquer maneira, o resultado fenotípica desta reorganização é aumentada capacidade de invasão e, presumivelmente, aumento do potencial metastático.

Em conclusão, propomos que o elevado risco de mortalidade por causas relacionadas CRC em pacientes que apresentam expressão lamin-tipo A no seu tumor surge porque lamina a é um regulador a montante de uma via de ligação dinâmica da actina à perda de adesão celular, conduzindo assim a um aumento da motilidade celular e, consequentemente, um aumento potencial invasivo do tumor. Este fenótipo por sua vez pode ser reflexo de uma propriedade de célula-like mais estaminais dos cancros. Embora as mutações em laminas A /C têm sido implicados numa grande variedade de doenças genéticas raras [3], os nossos resultados actuais para a primeira expressão do elo tempo destas proteínas com a progressão de uma das causas mais comuns de morte relacionada com o cancro no Ocidental mundo.

Materiais e Métodos

imunohistoquímica

As secções de parafina (4 mm) de mucosa do cólon normal e adenocarcinoma colorretal foram de-paraffinised e reidratadas em xilol e etanol. Para a recuperação de antigénio, as secções foram imersos em 3% H

2O

2 para extinguir a actividade da peroxidase endógena antes de serem incubados em tampão de citrato 0,01 M (pH 6,0) durante 20 min a 90 ° C. As secções foram então bloqueadas com soro de cabra normal a 5%, seguido por incubação com qualquer JoL2, anti-lamina A /C mAb de rato [47] [01:10], PC10, anti-PCNA mAb de murganho [1:100], RALC, anti -lamin C anticorpo policlonal de coelho [24] [1:100] ou 133A2, anti-lamina a mAb de rato [48] [1:100] durante a noite a 4 ° C. As secções foram então incubadas com IgG anti-ratinho de cabra biotinilado diluído a 1:400 durante 45 min à temperatura ambiente. O processo ABC padrão foi, então, realizada de acordo com as instruções da Dako (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca). Diaminobenzidina foi utilizada como um cromogénio seguida pela contra luz com Mayers Haemalum.

cultura celular

As linhas de células humanas pré-metastáticos de adenocarcinoma do cólon HT29 e SW480 foram obtidas a partir da Colecção Europeia de Culturas de Células, REINO UNIDO. HT29 foram cultivadas em meio de McCoy 5A (Sigma, UK) suplementado com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina, e mantidas num ambiente humidificado a 37 ° C com 5% de CO

2. SW480 células e derivados transfectadas foram cultivadas em meio Leibovitz-15 (G-15) (Invitrogen, UK) suplementado com 10% de FBS, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina, e mantidas num ambiente humidificado a 37 ° C, sem CO

2.

transfecção estável de GFP-repórteres em células de adenocarcinoma do cólon SW480

SW480 células foram transfectadas com construções de ADN que codificam uma proteína de fusão de EGFP-lamina a de comprimento completo (presente do Dr. M. Izumi, do Instituto de Física e química Research, Saitama, Japão) e EGFP.