Abstract

Fundo

andrógeno terapia de privação (ADT) é o tratamento de primeira linha para metastático cancro da próstata (PCA). No entanto, sustentada expressão e função do gene receptor de (AR) androgénio contribuir para a progressão de cancros da próstata resistentes à castração (CRPC). Além disso, os tumores podem se adaptar a via de sobrevivência PI3K /AKT para escapar ADT. AR-direccionamento Co e de sinalização /AKT PI3K tem sido proposto para ser um meio terapêuticos mais eficazes para doentes CRPC. Muitos ensaios clínicos estão em andamento para testar se os inibidores da PI3K /AKT são benéficos para pacientes APC. No entanto se esses inibidores tem nenhum impacto sobre as expressões de AR comprimento total (AR-FL) e sua variante de processamento (AR-V7) permanece obscuro.

Métodos

Quatro linhas de células cancerosas humanas da próstata (LNCaP, LNCaP95, VCaP e 22Rv1) com diferentes origens genéticas foram tratados com inibidores de cinco PI3K /AKT (LY294002, vortmanina, BKM120, Akti e AZD5363) e ou AKT siRNA. Os níveis de proteína e ARNm de Ar e Ar-V7 foram medidos por ensaios de PCR e immunoblotting em tempo real. Também foram determinadas AR iniciação de transcrição do gene, splicing de RNA alternativo e taxas de degradação de mRNA AR.

Resultados

PI3K /AKT inibidores teve vários impactos sobre a expressão de proteínas AR principalmente através de alterações de iniciação de transcrição do gene AR e splicing de ARN. No entanto, estes efeitos permaneceram inalterados no silenciamento RNA presença dos genes AKT.

Conclusão

PI3K /AKT inibidores ter efeitos fora do alvo na expressão do gene AR em células de câncer de próstata, que deve ser ponderar na aplicação destes inibidores para os pacientes APC, nomeadamente pacientes em tratamento ADT

Citation:. Liu L, Dong X (2014) Impactos complexos de PI3K inibidores /AKT ao receptor de andrógeno Gene expressão em células do cancro da próstata. PLoS ONE 9 (10): e108780. doi: 10.1371 /journal.pone.0108780

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de julho de 2014; Aceito: 03 de setembro de 2014; Publicação: 31 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Liu, Dong. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho recebeu uma subvenção de funcionamento da Canadian Institutes of Health Research (MOP-137007) e um Rising Star Award de Prostate Cancer Canada (RS2013- 58) para Xuesen Dong. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

terapia de privação de andrógeno (ADT) é o tratamento padrão para o câncer de próstata metastático (PCA). No entanto, a progressão para o câncer de próstata resistente à castração (CRPC) ocorre a maioria dos pacientes [1]. tumores CRPC sustentar a expressão de AR e seus genes regulados, indicando que a sinalização AR continua a funcionar [2] – [5]. Vários mecanismos têm sido propostos para a AR re-activação aberrante pós ADT incluindo: i) amplificação do gene de AR e mutações de ganho de função [4], [6] – [9]; ii) alterações na expressão e função dos principais AR co-reguladores [10] – [12]; e iii) Ar variantes de processamento importante, geração de ligação do ligando de domínio truncado (AR-Vs) [13] – [16] que constitutivamente activar a sinalização de AR. Entre estas variantes, AR-V7 (também chamado AR3) é o mais abundantemente expresso AR-V em CaP [13], [14], [17]. Os níveis de proteína AR-V7 estão significativamente elevados em tumores CRPC e intimamente associado com menor sobrevida do paciente [13], [14], [18]. Estes achados enfatizam que o bloqueio de expressão e função do gene AR continua a ser uma importante terapia.

Além disso, o fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /AKT /target da rapamicina em mamíferos sinalização (mTOR) é frequentemente ativada em APC e tem sido demonstrou desempenhar um papel importante para a progressão CRPC e resistência à morte induzida por terapia celular [19], [20]. As alterações genéticas de componentes da via PI3K /Akt /mTOR ocorreu em 42% dos tumores da próstata primários e 100% de tumores metastáticos [19]. Mais importante ainda, a activação de feedback recíproco de vias /AKT AR e PI3K tinha sido demonstrado, que permite que as células cancerosas se adaptar quer via para a sobrevivência quando o outro é inibida farmacologicamente [21], [22]. Estes resultados fornecem uma base racional de que a co-targeting ambas as vias podem alcançar melhores resultados para os pacientes CRPC.

Há vários inibidores dirigidos a diferentes componentes chave da via PI3K /AKT incluindo PI3K, AKT e mTOR. No entanto, os inibidores de PI3K, tais como LY294002, também tem sido demonstrada para ligar e inibir outras quinases que não pertencem a via PI3K /AKT de sinalização [23], [24]. Além disso, os estudos mostraram que quando a actividade da mTOR é inibida por alguns inibidores de AKT, que podem desencadear um mecanismo de feedback, resultando em re-activação de AKT ou proteínas activadas por mitogénios [25], [26]. Juntos, estes resultados indicaram que, além de suprimir AKT efectores a jusante, os efeitos fora do alvo de inibidores de AKT poderia produzir impactos profundos para células cancerosas. A questão continua a ser respondida é se inibidores de PI3K /AKT pode alterar as expressões de AR comprimento total (AR-FL) e AR-V7 em células APC, que poderia neutralizar a eficácia da ADT.

Neste estudo, quatro linhas celulares PC foram tratados com inibidores /AKT cinco PI3K. Nós medimos tanto mRNA AR e os níveis de proteína e de iniciação de transcrição do gene AR determinada, splicing de RNA e taxas de degradação de mRNA AR. Nós relatamos existia impactos complexos de inibidores de PI3K /AKT para AR expressão de genes que são independentes para knockdown AKT. Estes efeitos fora do alvo na expressão do gene AR precisam ser considerados quando se aplica inibidores /AKT PI3K aos pacientes APC.

Materiais e Métodos

linhas celulares de cancro da próstata, inibidores de PI3K /AKT e siRNA transfecção

LNCaP, VCaP e 22Rv1 linhas celulares de cancro da próstata humano foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). As células LNCaP foram entre 42-50 passagens. A linha celular LNCaP95 foi fornecida pelo Dr. Plymate (Universidade de Washington) e foi relatada em estudos anteriores [14], [27], [28]. É derivado de células LNCaP e obteve a resistência a condições de depleção androgénica. Ambos LNCaP e LNCaP95 expressar AR mutante (T877A) que pode ativar AR por uma ampla gama de esteróides ou análogos de esteróides. Eles também expressam gene mutante da fosfatase e tensina homólogo (PTEN) que constitutivamente activa de AKT. células VCaP expressar tipo AR selvagem e PTEN. Mas eles possuem a amplificação do gene de AR, resultando em níveis mais elevados de AR-FL e expressões AR-V7. 22Rv1 células expressam tipo selvagem PTEN, mas tem o rearranjo de genes do gene AR resultando níveis elevados de expressão do AR-V7. Juntas, estas quatro linhas celulares de CaP representam uma ampla gama de alterações genéticas das células APC. LY294002 e Wortmannin foram adquiridos de Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). NVP-BKM120 e AZD5363 eram de Selleck Chemicals (Houston, TX). Akti (CAT # 124005) foi da EMD Millipore (Billerica, MA). Controle e AKT siRNAs (CAT #: J-003000, J-003001 e J-003002 para AKT 1-3 isoformas respectivamente) eram de Dharmacon (Ottawa, Ontario). SiRNAs foram transfectados em células CaP usando Lípido siLentFect Reagente de Bio-Rad (Mississauga, ON), de acordo com o protocolo do fabricante.

immunobloting

lisados ​​de proteína foram recolhidas com tamp de lise (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM de NaCl, 1% de NP40, 0,5% de desoxicolato de sódio e 0,1% de SDS) suplementado com inibidores de protease e fosfatase a partir de Roche (Laval, QC) como descrito [29]. A concentração de proteína de cada amostra foi determinada usando o kit BCA de Pierce (Rockford, IL) segundo as instruções do fabricante. As amostras de proteína foram separadas por géis de SDS-PAGE, transferidos para difluoreto de polivinilo (PVDF) membranas e colocados a hibridar com anticorpos indicados. As experiências foram repetidas pelo menos três vezes e um conjunto de blots representativos foi mostrado. Anticorpos informação está listado na Tabela S1.

Foram realizadas PCR em tempo real

Os ensaios de PCR em tempo real como descrito [30], [31]. O ARN total foi extraído utilizando ARN PureLink Mini Kit da Invitrogen (Burlington, ON) de acordo com as instruções do fabricante. PCR em tempo real foi realizado em triplicado utilizando Biosystems7900HT aplicada com 5 ng de ADNc, 1 uM de cada par de iniciadores e SYBR Green PCR Master Mix da Roche (Laval, QC). Todos os ensaios de PCR em tempo real foram realizados usando técnicas três repetições e três sínteses de ADNc independentes. informações Primer está listado na Tabela S1.

Nuclear run-on ensaio

Nuclear run-on ensaios foram realizados como descrito [32] com pequenas modificações. células LNCaP e LNCaP95 foram tratadas durante 18 horas com veículo, LY294002, AZD5363 ou ARNsi contra isoformas AKT1-3. Totalmente 6 × 10

6 as células foram lavadas com PBS frio, colhidas e lisadas em gelo em 0,5% de Nonidet P-40 tampão de lise [Tris 10 mM-HCl (pH 7,4), 10 mM de NaCl, 3 mM de MgCl2] e centrifugadas a 500 x g durante 10 min. Os sobrenadantes foram removidos e os núcleos foram incubadas em tampão de reacção [tampão Tris 10 mM-HCl (pH 8,0), MgCl2 5 mM, KCl 0,3 mM] contendo NTP 2,5 mM mais mistura de biotina-16-UTP a partir de Roche (Laval, QC) durante 45 min a 30 ° C. Biotinilados transcritos de ARN nascentes foram precipitadas por estreptavidina grânulos de Gold Biotechnology (St. Louis, MO) e lavadas com tampão de solução salina de citrato de sódio acrescido de 15% de formaldeído. Precipitado de ARN foi eluído a partir de contas de estreptavidina e utilizados como moldes para análises em tempo real com iniciadores de PCR amplificar ARNm de AR ou totais rRNA 18S (18rS) como descrito na Tabela S1. Os resultados foram representados como a média ± SEM de três repetições independentes de cada condição experimental.

ensaio de splicing de ARN do gene de AR

O ARN total foi extraído utilizando ARN PureLink Mini Kit da Invitrogen (Burlington, ON ). PCR em tempo real foi realizado para medir o gene de AR RNA splicing. O AR-FL e AR-V7 eficiência splicing relativa foi determinada pela normalização com um produto de PCR interno dentro de exons AR 2 e 3. informações Primer foi listado na Tabela S1. Todos os ensaios de PCR em tempo real foram realizados usando técnicas três repetições e três sínteses de ADNc independentes.

Estatísticas

Os resultados são expressos como a média ± SEM. Para determinar as diferenças entre os grupos experimentais, one-way ANOVA seguido pelo estudante

t

-test foi realizada utilizando GraphPad Prism (versão 4) com o nível de significância de P 0,05 como *, P 0,01 como ** e P . 0.001 como ***

Resultados

Impactos de inibidores /AKT PI3K a AR níveis de proteína em células CaP

LY294002 é um forte inibidor competitivo de PI3K e impede PI3K de fosforilar e activar efectores a jusante AKT de [33]. A wortmanina é um inibidor de PI3K que covalente irreversível suprime AKT fosforilação [34]. LY294002 reprimido níveis de proteína AR-FL em células LNCaP (Fig. 1A), inibiram ambos os níveis da proteína AR-AR V7-FL e em células LNCaP95 (Fig. 1B). Tanto as células LNCaP e LNCaP95 são células deficientes PTEN, em que a AKT é constitutivamente activo na sua forma de fosforilação (p-AKT). Ambos LY294002 e Wortmannin inibiu fortemente os níveis de p-AKT em ambas as linhas celulares. Densitometria análises sobre as expressões proteína de AR-FL, AR-V7 e p-AKT foram medidos (Fig. 1C). Curiosamente, ambos LY294002 e wortmanina suprimida AR-FL e expressões AR-V7 proteína em células capnografia, (Fig. 2a). No entanto, LY294002 aumento AR-FL, mas diminuiu os níveis de proteína AR-V7 em 22Rv1 células (Fig. 2B). Vortmanina inibida tanto AR-FL e expressões de proteínas AR-V7 em células VCaP e 22Rv1. Densitometria análises sobre expressões de proteína de AR-FL e AR-V7 foram analisados ​​(Fig. 2C). Uma vez que as células VCaP e 22Rv1 são células suficientes PTEN, onde p-AKT, em níveis muito baixos /indetectáveis ​​a menos que os seus receptores tirosina-quinase a montante são activados, os efeitos de LY294002 a AR expressão da proteína em células VCaP e 22Rv1 não foram provavelmente relacionados com a activação AKT . BKM120 é um inibidor da pan-PI3K, mas não a mTOR [35]. BKM120 suprimido eficazmente os níveis de p-AKT em ambas as células LNCaP e LNCaP95. No entanto, BKM120 não teve efeitos para AR-FL e os níveis de proteína AR-V7 em todas as quatro linhas celulares PCA (Fig. 1-2). Akti é um análogo de éter de fosfatidilinositol competitiva que se encaixa na homologia plecstrina (PH) de domínio de AKT, impede AKT translocação de PI3K na membrana plasmática, assim, inibe a fosforilação e activação AKT [36]. Akti não apresentaram quaisquer efeitos supressivos para AR-FL ou níveis de proteína AR-V7 (Fig. 1-2). AZD5363 é um inibidor ATP-competitivo da AKT [37], [38]. Aumentou tanto AR-FL e os níveis de proteína AR-V7 e níveis induzidos de p-AKT em células LNCaP e LNCaP95 (fig. 1). No entanto, diminuiu os níveis de proteína AR-AR-FL e V7 em PTEN suficiente VCaP e 22Rv1 células (Fig. 2).

células LNCaP e (B) LNCaP95 (A) foram tratados com doses crescentes de PI3K /inibidores de AKT LY294002 (0, 25, 50 uM), wortmanina (0, 0,5 e 1 uM), BKM120 (0, 0,5 e 1 uM), Akti (0, 5 e 10 uM) ou AZD5363 (0, 2,5 e 5 uM ) durante 18 horas. Os lisados ​​de proteína foram coradas imunologicamente com AR (N-20), AR-V7, Pan-AKT, fósforo-AKT (Ser473) e anticorpos de p-actina. (C) Os resultados foram repetidas pelo menos três experiências independentes. análise de densitometria das bandas de proteína foram medidas pelo software Image J. e representados como média + SEM. One-way ANOVA seguido pelo teste t de Student foi realizado com * como P 0,05, ** como P 0,01 e *** como P . 0.001

(A) VCaP e (B ) 22Rv1 células foram tratadas com doses crescentes de inibidores de PI3K /AKT LY294002 (0, 25, 50 uM), wortmanina (0, 0,5 e 1 uM), BKM120 (0, 0,5 e 1 uM), Akti (0, 5 e 10 uM) ou AZD5363 (0, 2,5 e 5 uM) durante 18 horas. Os lisados ​​de proteína foram coradas imunologicamente com AR (N-20), AR-V7, Pan-AKT, fósforo-AKT (Ser473) e anticorpos de p-actina. (C) Os resultados foram repetidas pelo menos três experiências independentes. análise de densitometria das bandas de proteína foram medidas pelo software Image J. e representados como média + SEM. One-way ANOVA seguido pelo teste t de Student foi realizado com * como P 0,05, ** como P 0,01 e *** como P . 0.001

Impactos de inibidores /AKT PI3K para níveis de mRNA AR em células CaP

níveis de mRNA AR também foram medidos em linhas celulares de CaP sob tratamentos de inibidores /AKT PI3K. As alterações de AR-FL e os níveis de ARNm de AR-V7 (Fig. 3) foram consistentes com o que foi observado nos níveis de proteína de AR, como mostrado na Figura 1 e 2. LY294002 e wortmanina diminuíram ambos os níveis de AR-FL e AV-7 mRNA em todas as linhas celulares, excepto que CaP LY294002 aumento dos níveis de ARNm de AR-FL na 22Rv1 células. BKM120 e Akti não teve impactos significativos nos níveis de mRNA AR. AZD5363 aumentou os níveis de AR-FL e AR-V7 mRNA em células LNCaP e LNCaP95, mas diminuiu os níveis de mRNA em células VCaP e 22Rv1 com significância estatística. Estes resultados sugerem que os inibidores de PI3K /AKT afetados expressão do gene AR principalmente a nível mRNA.

células LNCaP, LNCaP95, VCaP e 22Rv1 foram tratadas com doses crescentes de inibidores /AKT PI3K LY294002 (0, 25, 50 uM) , Wortmanin (0, 0,5 e 1 uM), BKM120 (0, 0,5 e 1 uM), Akti (0, 5 e 10 uM) ou AZD5363 (0, 2,5 e 5 uM) durante 18 horas. AR-FL (A) e AR-V7 (B) os níveis de expressão de ARNm em relação à 18rS foram determinadas por PCR em tempo real. Os resultados foram de três extracções de ARN independentes com os ensaios de PCR em tempo real em triplicado de cada amostra de ARN. Os dados foram representados graficamente como a média + SEM. One-way ANOVA seguido pelo teste t de Student foi realizado com * como P 0,05, ** como P 0,01 e *** como P . 0.001

Impactos do knockdown AKT para AR gene expressão

Para investigar se os impactos do LY294002 e AZD5363 em proteína AR e níveis de mRNA foram mediadas através de AKT, realizamos AKT knockdown ensaios utilizando reunidas siRNA contra todas as três isoformas AKT1-3. Eficiência de AKT siARN foi mostrado por Western blot (Fig. 4A-B). Observou-se que, independentemente da presença de knockdown AKT, LY294002 ainda pode diminuir drasticamente os níveis de AR-FL e proteína AR-V7 (Fig. 4A) e mRNA (Fig. 4C) em células LNCaP, LNCaP95 e VCaP. LY294002 upregulated expressão AR-FL, mas diminuiu a expressão AR-V7 em 22Rv1 células. Além disso, observou-se que AZD5363 aumentou significativamente expressões AR-FL em células LNCaP e LNCaP95 e diminuiu AR-FL e AR-V7 em células VCaP e 22Rv1, que efeitos permaneceram inalterados, mesmo na presença de eficiente knockdown AKT (Fig 4B. E 4D). Juntos, estes resultados indicaram que os impactos de LY294002 e AZD5363 para AR expressões eram independentes a AKT e seus efetores a jusante.

células LNCaP, LNCaP95, VCaP e 22Rv1 foram transfectadas com o controle ou agrupados siRNA para AKT 1-3 isoformas durante 36 horas. As células foram, em seguida, tratado adicionalmente com 50 uM de LY294002 (A) ou 5 uM de AZD5363 (B) durante mais 18 horas. Os lisados ​​de proteína foram coradas imunologicamente com AR (N-20), AR-V7, Pan-AKT, p-AKT (Ser473) e anticorpos de p-actina. Os resultados foram repetidos em mais de três experiências independentes. análise de densitometria das bandas de proteína foram medidas pelo software Image J. e representados como média + SEM. níveis (C) AR-FL e (D) AR-V7 expressão de ARNm em relação à 18rS foram determinadas por PCR em tempo real. Os resultados foram de três extracções de ARN independentes com os ensaios de PCR em tempo real em triplicado de cada amostra de RNA e representados como média + SEM. testes t de Student foram realizados comparando entre o veículo e tratamentos LY294002 /AZD5363 com * como P 0,05; ** Como P 0,01 e *** como P . 0.001

LY294002 e AZD5363 afetar AR iniciação de transcrição do gene, splicing de RNA e AR mRNA estabilidade

Os impactos da LY294002 e AZD5363 sobre os níveis de mRNA de AR pode ser em múltiplos níveis possíveis, incluindo iniciação de transcrição do gene AR, pre-mRNA splicing e degradação mRNA AR. Usando nuclear run-on ensaio, medimos as taxas de iniciação da transcrição AR e genes 18rS na presença de veículo ou inibidores da PI3K /AKT (Fig. 5a). O gene 18rS foi usado como um controle interno como os seus níveis de mRNA não foram afetados por inibidores /AKT PI3K. Mostrámos que LY294002 inibido, enquanto que AZD5363 reforçada AR as taxas de iniciação de transcrição do gene em relação ao 18rS em ambas as células LNCaP e LNCaP95. Além disso, derrubando AKT não alterou as taxas de transcrição do gene AR.

células LNCaP e LNCaP95 (A) foram tratados com veículo, 50 uM LY294002 ou 5 uM AZD5363 por 18 horas (à esquerda). células LNCaP e LNCaP95 também foram transfectadas com ARNsi de controlo ou AKT1-3 durante 48 horas (direita). Os ensaios de run-on nuclear foram realizadas como descrito na secção Materiais e Métodos. células LNCaP e LNCaP95 (B) foram transfectadas com ARNsi de controlo ou reunidas por AKT isoformas 1-3 durante 36 horas. As células foram, em seguida, tratado adicionalmente com 50 uM de LY294002 ou 5 uM de AZD5363 por mais 18 horas. ensaios de splicing de RNA para AR-FL e AR-V7 foram medidos como descrito na secção Materiais e Métodos. células LNCaP e LNCaP95 (C) foram pré-tratados com 2 uM de actinomicina D durante 2 horas. As células foram então tratadas com veículo, 50 uM de LY294002 ou 5 uM de AZD5363 para 0, 2, 4, 6, 8, e 16 horas. Os níveis de AR-FL e expressão de ARNm de AR-V7 relativos a 18rS foram determinadas por PCR em tempo real. (D) As células LNCaP e LNCaP95 foram transfectadas com ARNsi de controlo ou reunidas por AKT isoformas 1-3 durante 36 horas. As células foram pré-tratadas com 2 uM de Actinomicina D durante 2 horas e, em seguida, tratado com veículo, 50 uM de LY294002 ou 5 uM de AZD5363 durante 6 horas. Os níveis de AR-FL e expressão de ARNm de AR-V7 relativos a 18rS foram determinadas por PCR em tempo real. Os resultados foram de três extracções de ARN independentes com os ensaios de PCR em tempo real em triplicado de cada amostra de ARN. One-way ANOVA seguido pelo teste t de Student foi realizado com * como P 0,05, ** como P 0,01 e *** como P . 0.001

Para medir o

bona fide

efeitos de LY294002 e AZD5363 sobre AR-FL e AR-V7 RNA splicing, mas excluir os seus impactos sobre a iniciação de transcrição do gene AR, nós projetamos três conjuntos de primers para medir as taxas de emenda relativos para AR-FL e AR-V7 . Desde AR-V7 RNA splicing é um processo RNA splicing mutuamente exclusivo de 3b exão e exão 4 do AR pré-mRNA, um conjunto de primers cobrir o exão 3 e 4 de junção do gene AR para medir os níveis de AR FL-mRNA, um conjunto de primers cobrir exão 3 e 3b para os níveis de AR-V7 mRNA e o outro conjunto de primers estão dentro de exons 2 e 3 para o total de níveis de mRNA AR. Nós mostramos que AR-FL splicing de RNA não foi afetada pelo LY294002, AZD5363 ou knockdown AKT. No entanto, LY294002 drasticamente inibido, enquanto que AZD5363 aumento AR-V7 splicing em células LNCaP95 (Fig. 5B). As alterações de AR-V7 splicing induzidas por LY294002 ou AZD5363 não foram alterados na presença de knockdown AKT.

AR-FL e estabilidades de ARNm de AR-V7 também foram estudados em células LNCaP e LNCaP95 pré-tratadas com actinomicina D (Fig. 5C). LY294002 reforçada AR-FL e degradação AR-V7 ARNm em células LNCaP95 dentro de 16 horas. AZD5363 reforçada AR-FL e ou a degradação de ARNm de AR-V7 em ambas as células LNCaP e LNCaP95. No entanto, os impactos de LY294002 e AZD5363 sobre estabilidades mRNA AR não foram afetados pela AKT knockdown (Fig. 5D). Uma vez que os níveis totais de ARNm de AR-FL e AR-V7 em células LNCaP e LNCaP95 foram aumentadas por AZD5363 (Fig. 3), estes resultados indicaram que os impactos de AZD5363 na iniciação da transcrição do gene de AR e de splicing de ARN overweighed seus efeitos ao ARNm de AR degradação.

LY294002 e AZD5363 afetar AR-FL e atividade transcricional AR-V7

Para investigar se alterações da AR-FL e os níveis de proteína AR-v7 por LY294002 e AZD5363 teria impacto AR transcricional atividades, medimos as expressões de dois genes AR-FL regulamentados (PSA e OPRK1) e um gene regulado AR-V7 (UGT2b17). Em ambas as células LNCaP e VCaP, agonista do AR-FL R1881 estimulada a expressão do PSA, que foram suprimidos por acções LY294002 (Fig. 6A-B). Por outro lado, AZD5363 reforçou o efeito R1881 em upregulating expressão PSA em células LNCaP, mas reduziu a ação R1881 em células VCaP. Estas alterações foram consistentes com os impactos de LY294002 e AZD5363 sobre os níveis de proteína AR-FL nessas células. A expressão do gene OPRK1 foi suprimida pelo ligando activado AR-FL [39]. O tratamento de diminuição da LY294002 AR-FL inibição mediada OPRK1 a expressão tanto em células LNCaP (69% de supressão reduzida para 35%) e células de capnografia, (94% de supressão reduzida para 42%). AZD5363 reforçada AR-FL na supressão da expressão OPRK1 em células LNCaP (69% de supressão aumentou para 79%), mas reduziu AR-FL inibição mediada OPRK1 de expressão em células de capnografia, (supressão de 94% reduzido a 86%). No entanto, ambos os impactos de LY294002 e AZD5363 sobre PSA e OPRK1 expressões não foi significativamente alterada pela knockdown AKT. Para estudar a actividade de transcrição AR-V7, medimos a expressão de UGT2b17 em células VCaP LNCaP95 e que foram tratados com MDV3100 para bloquear a actividade de AR-FL. Ambas as células VCaP e LNCaP95 expressam tanto AR-FL e AR-V7. Foi anteriormente demonstrado que na presença de bloqueio funcional AR-FL, a supra-regulação da expressão de UGT2b17 foi determinada por AR-V7 [27]. LY294002 inibida expressão UGT2b17 em ambos LNCaP95 e células capnografia, (Fig. 6C-D). AZD5363 estimulado expressão UGT2b17 em células LNCaP, mas reduziu a sua expressão em células VCaP. Estas mudanças na expressão gênica UGT2b17 foram consistentes com os níveis de proteína AR-V7 sob tratamentos LY294002 e AZD5363. Contudo, estes efeitos não foram alteradas pelo knockdown AKT.

Células VCaP

(A) LNCaP e (B) foram transfectadas com ARNsi de controlo ou AKT1-3 durante 48 horas e tratou-se com um veículo ou nM R1881. As células foram também co-tratados com veículo, 50 uM de LY294002 ou 5 uM de AZD5363 durante 18 horas. Os ensaios de PCR em tempo real de PSA medidos e os níveis de mRNA OPRK1. células de capnografia, (C) LNCaP95 e (D) foram transfectadas com ARNsi de controlo ou AKT1-3 durante 48 horas e tratada com veículo, 50 uM de LY294002 ou 5 uM de AZD5363, na presença de 5 uM de MDV3100 durante 18 horas. Os ensaios de PCR em tempo real medidos os níveis de mRNA UGT2b17. Os resultados foram de três extracções de ARN independentes com os ensaios de PCR em tempo real em triplicado de cada amostra de ARN. testes t de Student foram realizados comparando entre o veículo e tratamentos LY294002 /AZD5363 com * como P 0,05; ** Como P 0,01 e *** como P . 0.001

Discussão

activação aberrante da via PI3K /AKT, quer através de mecanismos genéticos ou epigenéticas ocorre frequentemente em tumores, tornando esta via um alvo terapêutico atractivo para um amplo espectro de cancros. Muitos inibidores estão disponíveis para bloquear a sinalização PI3K /AKT e alguns estão sob primeiros ensaios clínicos. No entanto, a heterogeneidade dos cânceres de próstata é uma característica especial, o que torna difícil prever se a inibição da sinalização PI3K /AKT beneficiaria pacientes APC. Além disso, muitos possíveis sequelas biológica de inibição /AKT PI3K pode prejudicar ainda mais o potencial de ganho terapêutico. Este estudo tem como objetivo investigar se os inibidores de PI3K /AKT têm quaisquer efeitos fora do alvo para a expressão do gene AR em um painel de linhas celulares de CaP que representam células tumorais da próstata com uma ampla gama de variações genéticas. É importante documentar o perfil de expressão de variantes de AR-FL e splice AR sob tratamentos de inibidores de PI3K /AKT, uma vez que a expressão e função AR sustentada são um dos mecanismos moleculares pelos quais críticos tumores da próstata progridem para CRPC. Nós relataram que inibidores da PI3K /AKT teve impactos complexos sobre a expressão do gene AR que eram independentes de AKT, sugerindo que esses inibidores da PI3K /AKT poderia afetar sinalização além da via PI3K /AKT em células CaP pendente sobre as suas origens genéticas. Estes efeitos fora do alvo advertiu potencial de aplicação de inibidores de PI3K /AKT a certos, se não todos, o PCA populações de doentes.

Off-alvo efeitos de inibidores /AKT PI3K tinha sido bem documentado e repetidamente observada neste estudo. LY294002 e wortmanina foram demonstrados para ligar muitas outras quinases que não foram relacionadas com PI3K /AKT de sinalização [23], [24]. Portanto, não é surpreendente que LY294002 e Wortmannin tinha mostrado efeitos negativos dominantes para a expressão do gene AR mesmo sob condição de AKT knockdown. Embora ambos BKM120 e Akti suprimida drasticamente fosforilação AKT e ativação, eles não mostraram qualquer impacto a expressão dos genes AR em todas as quatro linhas celulares APC. Estes resultados excluída a possibilidade de ativação de AKT foi diretamente responsável por mudanças de expressão dos genes AR. Eles serviram como controlos negativos para apoiar ainda mais os efeitos off-alvo de LY294002, Wortmannin e AZD5363 sobre a expressão do gene AR. Curiosamente, AZD5363 pode alterar AR-FL e expressões AR-V7 pendentes sobre a base genética de linhagens de células APC. No entanto, várias evidências indicam ubiquitously os efeitos off-alvo de AZD5363 a expressão do gene AR. Primeiro, embora LNCaP e LNCaP95 células expressam mutante PTEN e constitutivamente AKT ativa, AZD5363 aumentou tanto AR-FL e expressões AR-V7 mesmo quando AKT endógena foram significativamente empobrecido pela RNA silenciamento (Fig. 4). Estes resultados indicaram que a ativação de feedback de AKT por AZD5363 não contribuíram para as mudanças de expressões AR. Em segundo lugar, as células VCaP e 22Rv1 expressar PTEN tipo selvagem com baixos níveis indetectáveis ​​de /p-AKT, na ausência de activação de receptores de tirosina-quinase a montante (Fig. 1-2). Os impactos da AZD5363 na redução AR-FL e AR-V7 em linhas VCaP e 22Rv1, portanto, não estavam relacionadas com a activação AKT. Por último, AZD5363 pode melhorar AR de iniciação da transcrição do gene (Fig. 5A), o splicing de ARN de AR-V7 (Fig. 5B), AR-FL e degradação AR-V7 ARNm independente para AKT knockdown (Fig. 5C-D).

Ambos RA e sinalização /AKT PI3K tinha sido demonstrado ser importante para as células APC, para desenvolver resistência à terapia. Desenvolvimento de inibidores para estes sinalização oferece novas oportunidades para os pacientes APC. O contrapeso dessas oportunidades é o desafio de heterogeneidade intrapacientes células CaP [40]. Vários clones de células cancerosas com diferentes antecedentes genéticos poderiam coexistir no mesmo paciente [41]. Portanto, um inibidor de PI3K /Akt poderia ser eficaz para uma população de células cancerosas, mas possivelmente fornecer privilégio de crescimento para os outros através de processo de selecção clonal. -Alvo Co AR e PI3K /AKT percursos podem ser ainda mais desafiador. activação recíproca de sinalização /AKT AR e PI3K em cancros da próstata pode complicar a evolução dos pacientes CaP que recebem tratamentos de combinações de inibição /AKT AR e PI3K. Anti-andrógenos pode eventualmente prejudicar a eficácia dos inibidores /AKT PI3K. Vice-versa, inibidores /AKT PI3K pode neutralizar a eficácia dos anti-androgénios. Estudos recentes utilizando mais modelos de ratos knockout PTEN mostrou que, embora os tumores sensíveis castração respondeu em sinalização AR e PI3K /AKT, os tumores resistentes a castração derivados submetidos a plasticidade fenotípica levando ao aumento da heterogeneidade intratumoral e perda de independência tumor para PI3K sinalização [42]. Nossos estudos anteriores tinham mostrado que as condições de castração induzir a transcrição do gene AR e splicing de RNA de AR-V7 [27]. Nós ainda mostrou aqui que inibidores tais como AZD5363 pode aumentar de iniciação de transcrição do gene AR e AR-V7 RNA splicing. Co-tratamento de anti-andrógeno e AZD5363 poderia resultar na expressão AR-V7 reforçada e promover AR-V7 tumores conduzido em um subgrupo de pacientes APC.

Em resumo, os nossos estudos demonstraram inibidores de PI3K /AKT têm vários efeitos fora do alvo na expressão dos genes AR em células APC com diferentes origens genéticas. Esta informação deve ser considerada no tratamento de doentes APC com esses inibidores.

Informações de Apoio

Tabela S1.

Informação de anticorpos e iniciadores utilizados neste estudo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0108780.s001

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