Abstract

A quimioterapia citotóxica de câncer é limitado por algumas vezes, efeitos secundários graves, com risco de vida que surgem de toxicidade para sensíveis células normais, porque as terapias não são selectivos para as células malignas. Então, como eles podem ser seletivamente melhorado? As formulações farmacêuticas alternativas de agentes anti-cancro têm sido investigados a fim de melhorar o tratamento de quimioterapia convencional. Estas formulações estão associados a problemas como efeitos colaterais tóxicos graves em órgãos saudáveis, a resistência aos medicamentos e acesso limitado da droga para os locais do tumor sugeriu a necessidade de se concentrar em sistemas de libertação controlada de fármacos específicos do site. Em resposta a estas preocupações, desenvolvemos um novo sistema de entrega de droga baseada em eritrócitos magnéticos manipuladas com uma proteína de fusão de pico viral. Este novo sistema de administração de fármaco à base de eritrócitos tem o potencial para a localização específica do local magnética controlada e capacidade altamente eficiente de fusão com as células-alvo. Aqui, mostramos que o HA-eritro-magneto virossomas sistema de administração de fármaco é capaz de prender e fundir-se com as células-alvo e de libertar eficientemente compostos terapêuticos no interior das células. A eficácia do fármaco anti-cancro empregue é aumentada e a dose pretendida é de 10 a menos tempo do que o necessário com a terapia convencional

citação:. Cinti C, Taranta H, Naldi I, Grimaldi S (2011) Recentemente Engineered Os eritrócitos magnéticos para entrega sustentada e metas desejadas de anti-câncer compostos terapêuticos. PLoS ONE 6 (2): e17132. doi: 10.1371 /journal.pone.0017132

editor: Steven Ellis, da Universidade de Louisville, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de outubro de 2010; Aceito: 21 de janeiro de 2011; Publicado: February 23, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Cinti et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O sucesso de qualquer tratamento médico não depende apenas o farmacocinético /farmacodinâmico actividade do agente terapêutico, mas, em grande parte, sobre a sua biodisponibilidade no local de acção no sistema humano [1] – [4]. No passado, formulações farmacêuticas alternativas de agentes anti-cancro têm sido investigados a fim de melhorar o tratamento de quimioterapia convencional. Em terapia oral de comprimidos /corrente convencional, cápsula e as formulações injectáveis ​​são utilizados para entrega de drogas anti-cancro. Estas formulações estão associados a problemas como efeitos colaterais tóxicos graves em órgãos saudáveis, as dificuldades na administração clínica, resistência aos medicamentos e acesso limitado da droga para os locais do tumor sugeriu a necessidade de se concentrar em sistemas de entrega controlada de fármacos específicos do local.

Drug Delivery Systems (DDSs), tais como as nanopartículas lipídeos ou à base de polímero foram concebidos para melhorar as propriedades farmacológicas e terapêuticas de drogas administradas por via parentérica. A maior parte do DDS actualmente aprovados para administração parentérica se enquadra na categoria de lipossomal ou formulações à base de lípidos ou moléculas terapêuticas ligados a polietilenoglicol (PEG) [5] – [7]. Embora a solubilidade do fármaco pode não ser um factor limitante para a sistemas, tais como conjugados de polímero-droga, em que o fármaco está ligado quimicamente ao suporte, pode ser uma consideração importante na lipossomal DDS. A capacidade de suporte de lipossomas não é eficiente para grandes moléculas terapêuticas, tais como proteínas, particularmente quando pequenos diâmetros de lipossomas são desejáveis ​​por razões de biodistribuição. nano biodegradável /micropartículas de poli (D, L-lactido-co-glicolido) (PLGA) e polímeros à base de PLGA são amplamente explorados como transportadores para entrega controlada de agentes terapêuticos macromoleculares, tais como proteínas, péptidos, vacinas, genes, antigénios e factores de crescimento . Literatura cita muitas vantagens e desvantagens dos sistemas de entrega à base de PLGA e PLGA para a entrega de drogas macromoleculares [8], [9]. encapsulação de drogas, o tamanho de partícula, aditivos adicionados durante a formulação, o peso molecular, a proporo de ltido para glicolido porções em PLGA e a morfologia da superfície pode influenciar as características de libertação de [10]. PLGA tem um efeito negativo sobre a estabilidade da proteína durante a preparação e armazenamento, devido principalmente à natureza catalisada por ácido da sua degradação [11]. Além disso, as condições de processamento utilizadas na fabricação de PLGA veículos de distribuição de drogas têm efeitos prejudiciais sobre certas estruturas secundárias de proteínas [12].

Nos últimos anos, os sistemas de entrega baseados em células também têm sido desenvolvidos. A utilização das células como veículos terapêuticos desenvolveu-se como um conceito diferente e método de entrega [13] – [17]. veículos baseados em células são particularmente atraentes para a entrega de agentes bio-terapêutica que são difíceis de sintetizar, reduziram meias-vidas, penetração nos tecidos limitada ou são rapidamente inactivado mediante

in vivo

introdução directa. Por uma questão de factos, o sistema de libertação à base de células possui um número de vantagens, incluindo tempos de administração prolongada, a segmentação de drogas para compartimentos de células especializadas e biocompatibilidade. O uso de um transportador fisiológico para entregar agentes terapêuticos ao longo do corpo para melhorar a sua eficácia, tanto ao mesmo tempo minimizando os efeitos secundários adversos inevitáveis, é uma perspectiva atraente que pode ser aplicado em muitas situações clínicas. O comportamento das células do sangue, como um sistema de entrega para várias classes de moléculas (isto é, proteínas, incluindo enzimas e péptidos, agentes terapêuticos sob a forma de análogos de nucleótidos, análogos de glucocorticóides), tem sido estudada extensivamente como eles possuem várias propriedades, que fazem eles transportadoras únicas e úteis [18] – [20]. No âmbito da farmacoterapia extracorporal, a abordagem mais promissora é a utilização de autoerythrocytes que possuem características morfológicas e fisiológicas intrínsecas. Aplicação de eritrócitos como recipientes para vários fármacos diminui o risco de efeitos colaterais e reacções imunitárias patológicas contra agentes encapsulados e, além disso, permite a modificação do seu propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas para reduzir as doses e os intervalos entre eles. A eficácia e segurança de agentes farmacêuticos introduzidos eritrócitos foram confirmados em numerosos

In vivo

estudos [20]. Os eritrócitos magnéticos, resultantes da co-encapsulação dos fármacos com algumas ferrofluidos tais como cobalto-ferrite e magnetite, têm sido relatados para dirigir o medicamento encapsulado predominantemente para os locais desejados do corpo por meio de um campo magnético externo [21] – [23]. Aplicando as ondas de ultra-som na região onde eritrócitos magnéticos acumular pode induzir a destruição do veículo e o lançamento de uma droga no órgão ou tecido nível [24], [25]. Além de direccionamento de drogas, este método tem sido avaliadas para a indução de isquemia local, em tumores, que podem, consequentemente, ajudar a promover a remissão do tumor por causa do fluxo de sangue local reduzida [22]. No entanto, a capacidade potencial das operadoras de telefonia móvel para possibilitar a entrega específica do local ou alvo de terapêuticas ainda não foi totalmente explorado. Desenvolvimento de células alvo estratégias aplicações em veículos de célula avanço, ampliar a aplicabilidade desta abordagem de entrega e potenciar os resultados terapêuticos.

Em uma tentativa de melhorar o direcionamento ea liberação eficiente de compostos terapêuticos no nível intra-celular de células alvo, desenvolvemos um novo sistema de libertação de drogas à base de eritrócitos controlada pelo campo magnético. Anexando uma fusão pico viral glicoproteína na membrana dos eritrócitos e encapsular nanopartículas superparamagnéticas e drogas em eritrócitos, temos produzido novo sistema de entrega de drogas eritrócitos baseada, os virossomas-HA eritro-magneto, que têm o potencial para magnética controlado site específico do localização e capacidade de fusão altamente eficiente com as células-alvo. A presença de glicoproteína de fusão viral faz com que a aplicação de ultra-sons de onda necessário para induzir destruição “veículo” para a libertação de compostos terapêuticos no local alvo. Aqui nós mostramos como os virossomas-HA eritro-magneto se comportar um pouco parecido com um vírus envelopado na sua capacidade de invadir células hospedeiras. Estes eritrócitos modificados são capazes de se fundirem com a membrana citoplasmática das células-alvo num curto espaço de tempo e libertar as nanopartículas magnéticas e composto terapêutico dentro destas células. A quantidade total da droga anti-cancro 5-Aza 2-desoxicitidina tem um efeito terapêutico de 10 vezes menor do que a terapia padrão, que sugere que este novo sistema de entrega de droga pode ser capaz de reduzir os efeitos citotóxicos de fármacos através do aumento da biodisponibilidade de compostos terapêuticos no local de acção e melhoria farmacocinética. Este novo sistema de entrega de drogas à base de eritrócitos pode, potencialmente, ser aplicada em muitas situações clínicas, incluindo patologias neoplásicas, patologias causadas pela infecção de um vírus humanos ou animais e doenças cardiovasculares.

Materiais e Métodos

vírus da Influenza crescimento e isolamento de hemaglutinina (HA) da glicoproteína

vírus influenza obtido a partir do líquido alantóico de ovos embrionados com 10 dias de idade (ovos foram obtidos a partir da fábrica de frango em Roma, Itália) foi sedimentado por ultracentrifugação e o sedimento foi ressuspenso em octa (etilenoglicol) –

N-dodecil

monoéter (C

12E

8) e deixado durante a noite para permitir a solubilização completa da membrana viral. A suspensão foi cuidadosamente homogeneizado e ultracentrifugated para sedimentar para baixo as nucleocapsids virais. Em seguida, a suspensão de virossoma (sobrenadante contendo a proteína HA) foi purificado por ultracentrifugação num gradiente de sacarose descontínuo-(50% e 10% de sacarose). Na interface das camadas de sacarose, a glicoproteína HA concentrados. Após a remoção desta camada, o HA foi dialisado contra tampão e esterilizado por filtração.

eritrócitos lise e incorporação da glicoproteína HA, nanopartículas super-paramagnéticas e drogas 5-Aza-2-dC

Glóbulos vermelhos humanos (RBC) foram obtidas a partir de sangue de dadores saudáveis, por centrifugação a 1700 rpm durante 10 min a 4 ° C. Recentemente RBC recolhidas foram lavadas duas vezes em solução salina fisiológica de fosfato tampão (PBS 1X) (NaCl 1,37, KCl 57 mM, Na 54 mM

2HPO

4, KH 45 mM

2 PO?

4 pH 7,4 ).

2 × 10

9 GVs foram lisadas em 300 ul de tampão de lise (Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, MgCl 1 mM de

2 a pH 7,2) durante 60 minutos a 0 ° C . A isotonicidade foi então restaurado pela adição de 65 ul de tampão de resselagem 1 X (1,37 M de NaCl, KCl 57 mM, Na 54 mM

2HPO

4, KH 45 mM

2 PO?

4, MgCl 15 mM

2 pH 7,4), suplementado com 0,1 mg de 100 nanopartículas nm vermelho-rotulados superparamagnéticas (nano-screenMAG, Chemicell Company), 1 ug de influenza HA virai glicoproteína pico, e 0,38 ou 30,5 mg de 5-Aza-2-dC ( Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA).

A suspensão foi incubada durante 45 minutos a 37 ° C sob agitação suave. GVs fechados (ghosts), contendo a proteína HA de fusão na membrana lipídica e ambos 5-Aza-2-DC e nanopartículas superparamagnéticas interior (eritro-magneto-HA virossoma), foram recolhidos por centrifugação a 10.000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C. Os virossomas HA-eritro-magneto foram lavadas duas vezes com 1X PBS por centrifugação a 9000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C e ressuspensas em 1X PBS contendo 1% de FCS.

Cinética de Eritro-magneto HA-virossomas fusão com células HeLa: análise Espectrofluorímetro

virossomas Eritro-magneto-HA foram preparados como descrito acima e foram marcadas por adição de octadecil rodamina (R18). Os virossomas Eritro-magneto-HA /R18 carregadas foram adicionadas a células HeLa. o total de lípido virossomas HA-eritro-magneto /R18 foi quantificado pela quantidade de octadecil rodamina (R18) na sua membrana, com base no facto de que R18 representa 15% do peso total de lípidos sobre ele. Os eritro-magneto-HA-virossomas /R18 foram solubilizadas pela adição de 0,1% (concentração final) de Triton X-100 em PBS, e a fluorescência das R18 (excitação a 560 nm e emissão a 590 nm) foi medido usando-se uma alíquota do solução com um espectrofluorímetro Perkin Elmer 650-40), calibrado com soluções padrão contendo R18 0,1% de Triton X-100. O grau de auto-extinção R18 em cada magneto-eritro-HA virossomas foi examinada por comparação das R18 fluorescência antes e após solubilização dos eritro-magneto-HA virossomas com 0,1% de Triton X-100 em PBS. virossomas Eritro-magneto-HA foram adicionadas a células HeLa. A cinética de eritro-magneto HA-virossomas fusão com células HeLa foi calculado como% de R18 dequenching fluorescência (SRGH) usando 560 e 590 nm como comprimento de onda de excitação e emissão, respectivamente. Como controle preparamos eritrócitos magnéticos R18-rotulados sem proteína de fusão HA reconstituído. A cinética de fusão destes eritrócitos magnéticas com células HeLa também foi analisada.

A análise por HPLC da 5-Aza-2-dC incorporação em Eritro-magneto-HA virossomas

Compostos e soluções.

5-aza-2-desoxicitidina (5-Aza-2-dC, decitabina) foi adquirido a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). O acetato de amónio era de Cario Erba (Milão, Itália). grau HPLC acetonitrilo (MeCN) era de Rathburn (Walkerburn, UK).

análise

HPLC de virossomas Eritro-magneto-HA contendo a decitabina.

2 × 10

9 eritro-magneto virossomas HA foram incubados com 200 ul de tampão de lise para libertar a droga incorporada 5-Aza-2-dC e centrifugado a 10000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C. O sobrenadante foi recuperado e utilizado para análise por HPLC ou armazenada num congelador a -80 ° C até à análise.

Soluções Stock padrão de decitabina na concentração de 114, 228, 456 e 1140 ng /mL, foram preparadas individualmente em água ou solução de tampão de lise e armazenado a -80 ° C até à análise.

A relação de amostra /5-Aza-2-dC (decitabina, padrão) de área de pico foi utilizada para a quantificação. O limite de detecção (LOD) foi definida como três vezes a razão sinal-ruído. O menor limite de quantificação (LIQ) foi definido como o nível mais baixo de substância que poderia ser detectado de forma confiável e reprodutível com uma precisão de ≤20% e precisão de 80-120%.

Instrumentação.

O sistema de HPLC constituída por um Dionex (Sunnyvale, CA, EUA) 3000 final LC série ligado a uma armadilha de iões LTQ-Orbitrap linear (Thermo Fisher Scientific, EUA) espectrómetro de massa, equipado com uma fonte iónica de electrospray. Os dados foram adquiridos e processados ​​com Excalibur 2,1 software. Os compostos foram separados numa Gêmeos C18 (ID 150 milímetros-2.0 mm) e 3 um de tamanho de partícula (Phenomenex, Torrance, CA, EUA) protegida por uma coluna Phenomenex Gêmeos C18 (ID 4,0 milímetros-2.0 mm) e 3 uM de partícula cartucho de tamanho de guarda . O método de HPLC utilizado um gradiente de eluição; fase móvel solvente A era água com ácido fórmico 0,1% e fase móvel B foi acetonitrilo com ácido fórmico 0,1%. A composição da fase móvel inicial de 92% de solvente A e 8% de solvente B foi mantido durante 2 min. Entre 2 e 9 min, a percentagem de fase móvel B foi aumentada para 35% e depois de volta para inicial a composição da fase móvel dentro de 0,1 minutos, com um tempo total de 14 min. A coluna foi ajustada a um caudal de 0,2 mL min-1 e a uma temperatura de 36 ° C. volume de amostra de 10 uL foi utilizada para todas as experiências de LC-MS. O espectrómetro de massa foi operado em modo de electrospray positivo. A temperatura capilar era de 275 ° C e utilizou-se a tensão de kV 4,5 pulverização.

tumorais HeLa tratamentos

células HeLa humanas foram compradas na American Type Culture Collection (Rockville, MD).

As células foram mantidas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 2 mM de L-glutamina, a razão de divisão de 1:04 duas vezes por semana.

Para tratamentos, 3 ml de células a uma densidade de 5 x 10

5 foram semeadas em placas de microtitulação de 6 cavidades. Dois conjuntos de experimentos foram executados em paralelo, tanto para Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) e análise de FACS. Para a análise CLSM, na parte inferior das placas de cultura foram lá colocadas lamelas de vidro em que as células foram deixados crescer.

Após 24 horas, o meio de cultura foi mudado com meio contendo 2,5? M de 5-aza 2-dC sozinho ou 1 × 10

9 virossomas 5-Aza-DC-carregados eritro-magneto-HA ou tampão em que os eritro-magneto-ha-virossomas foram novamente suspensas (sobrenadante, controle-2). Após 30 min, 1, 6, 24, 48 e 96 horas de incubação, tratados e não tratados (controlo-1), as células foram analisadas por MCVL e análise de FACS.

Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) análise de fusão eventos de virossomas eritro-magneto-HA com células tumorais

As células de tumor cultivadas em lâminas na presença de 5-aza-2-DC-carregados virossomas eritro-magneto-HA foram lavadas em 1X tampão PBS e fixadas com 4 % paraformaldeído. os núcleos das células foram contrastadas com DAPI e montadas em meio de antifade. Fluorescência e de campo brilhante imagens foram obtidas por um sistema de microscópio invertido Leica TCS SP5, equipado com cinco lasers que emitem luz do UV ao visível (405 Diode, Argon, HeNe 543, HeNe 594 e HeNe 633). A fluorescência DAPI foi detectada na excitação de 405 nm e emissão de 454 nm, enquanto a fluorescência vermelha de nanopartículas superparamagnéticas na excitação de 543 nm e emissão de 613 nm.

análise de citometria de fluxo (análise FACS)

a análise FACS foi realizada em células HeLa tratadas com 2,5 uM 5-aza-dC ou 1X 10

9 5-Aza-2-DC-carregado eritro-magneto-HA-virossomas e comparadas com as não tratadas (controlo -1) após 24, 48 e 96 horas de cultura. A análise FACS foi também realizada em células HeLa tratadas com tampão na qual os eritro-HA-virossomas foram ressuspensas para verificar a ausência de não incorporada 5-Aza-2-dC droga (controlo-2). Tratadas e células não tratadas foram fixados em álcool etílico e os núcleos foram coradas com 10 ug /ml de iodeto de propídio e incubadas com 100 ug /ml de RNase durante 1 hora a 37 ° C. O conteúdo de DNA nuclear, que discrimina as fases do ciclo celular, foi determinada por citometria de fluxo utilizando o Becton-Dickinson FACScan CentroII.

declarações de Ética

Para o presente estudo, não precisam de aprovação ética de uma vez o trabalho não foi envolvendo estudos em humanos, nem animais.

o presente estudo foi realizado sem a utilização de doadores a partir de material voluntário humano, o sangue humano foi obtido de saco transfusional do banco de sangue, por essas razões que não precisamos de consentimento informado .

resultados

Comportamento de eritro-magneto-HA virossomas

Um novo sistema de administração de fármacos à base de eritrócitos aqui descrito é potencialmente capaz de fornecer drogas para alvejar tecidos aumentando a biodisponibilidade de compostos terapêuticos no local de acção que conduz a um melhor efeito terapêutico com efeitos secundários mínimos. eritrócitos humanos foram isolados a partir do sangue de um dador saudável e tratou-se com uma solução hipotónica para induzir a abertura de poros da membrana e a libertação de hemoglobina. Uma mistura contendo hemaglutinina (HA), proteínas de fusão de pico viral, nanopartículas superparamagnéticas fluorescentes e o composto terapêutico foi adicionado durante o novo fecho dos eritrócitos “fantasmas”. Devido à elevada afinidade para membranas, hemaglutinina se liga à membrana citoplasmática de eritrócitos, enquanto nanopartículas magnéticas (fluorescência verde) e fármaco penetrar através dos poros em eritrócitos “fantasmas” (Fig. 1).

Confocal Laser Scanning Microscopy ( CLSM) imagens de virossomas erytro-magneto-HA encapsulando 100 nm nanopartículas marcados com fluorescência superparamagnéticas (verde) e 5-Aza-2-dC.

Para verificar a captura eficaz de 5-Aza-2 -DC (decitabina) no nosso sistema de administração de fármaco à base de eritrócitos e para quantificar o rendimento do composto terapêutico encapsulado, foi realizada a análise por HPLC (Fig. 2). Líquido cromatografia /espectrometria de massa método de quantificação (QTOF /MS) tem sido utilizado a fim de quantificar e identificar as isoformas 5-Aza-2-DC e seus produtos de decomposição sob condições fisiológicas de pH e temperatura, como descrito anteriormente [26], [ ,,,0],27].

(A) Picos de 1,14 ng de 5-aza-dC (padrão). (B) picos de 5-aza-dC encapsulado em virossomas 2 × 10

9 eritro-magneto-HA. RT: tempo de retenção; AA: contagens de pico da área. (C) Curva de Calibração de 5-aza-dC. Os valores de padrões de área de pico foram postos em relação com a ng /10 uL de amostra de 5-Aza-2-dC ran. soluções padrão utilizadas foram 1,14, 2,28, 4,56 e 11,40 ng 5-Aza-CC (losangos pretos). triângulos cinzentas mostram as concentrações de 5-Aza-DC encontrados dentro dos virossomas amostras dois eritro-magneto-HA utilizados em

in vitro

experimentos.

Na Figura 2 A e B, o picos de ambas 5-Aza-2-dC (padrão) e 5-aza-2-dC carregado em virossomas 2 × 10

9 eritro-magneto-HA são mostrados. As amostras foram monitorizadas em modo positivo, o que resulta em espécies de uma unidade de massa maior do que as moléculas neutras. Os dados foram visualizados por extracção dos cromatogramas iónicos a m /z = 229. Na solução padrão (Fig. 2 A), dois picos correspondentes a ambos os único carregada β- (I) e a-formas (II) de 5-aza-2 -DC (m /z = 229) estão presentes. No exemplo, um outro pico é evidente, além de 5-aza-2-dC β- e a-formas (I e II). Este pico corresponde a um derivado guanylurea (III) (m /z = 219). Como mostrado anteriormente, cromatogramas iónicos extraídos a m /z = 219 (derivados guanylurea, espécies monoméricas carregadas individuais) não são únicos como um identificador de derivados guanylurea como compostos com m /z = 229 também produzir fragmentos com m /z = 219, quando visualizado por espectrômetro de massa [28]. p-formas (I), de 5-aza-2-dC tornar-se hidratado na posição C-6 e o ​​anel-se abre para produzir um derivado de anel aberto-formilado, seguido por perda de ácido fórmico, que, em seguida, produz um derivado guanylurea (III). Desformilação de qualquer dos derivados formilados de anel aberto nos derivados guanylurea (III) resulta em perda do protão H-6 como o ácido fórmico. Os tempos de retenção (RT), bem como os valores da área (AA) para cada pico são mostradas na Figura 2 A e B.

Para quantificar a quantidade de 5-aza-2-dC contido no erythrocyte- sistema de entrega de base, 10 ul de cada padrão e amostra foram injectados no HPLC. Diferentes concentrações de padrão, que vão desde a 0114 ng /mL (0,5 uM) para 1,14 ngμl (5 uM) de 5-aza-2-DC, foram preparadas e a área do pico de cada amostra de 10 ul foi calculado por HPLC . Os valores de padrões de área de pico foram colocados em relação ao ng de 5-aza-2-DC e uma curva de calibração foi desenhada (Fig. 2 C). A Figura 2 A mostra o valor da área (AA: 660,834) detectado por HPLC que corresponde a 1,14 ng (0,5 mM) de solução padrão de 5-aza-2-DC. Diferentes amostras de virossomas eritro-magneto-HA foram preparados e diferentes quantidades de 5-aza-2-DC, que vão desde 0,5 ng /mL (2,5 uM) a 42 ng /ul (200 ^ M), foram adicionados durante a resselagem. Para avaliar a quantidade eficaz de 5-aza-2-dC aprisionado nos eritrócitos para cada preparação, virossomas 2 × 10

9 eritro-magneto-HA foram lisadas em 200 ul de tampão de lise. A quantidade total de fármaco incorporado no virossomas 2 × 10

9 eritro-magneto-HA era de 3,6 ng ou 360 ng quando 2,5? M ou 200? M de 5-aza-2-dC foram adicionados eritrócitos durante resselagem , respectivamente (Fig. 2 C). Portanto, a eficiência da incorporação para cada amostra foi de cerca de 1%.

Para testar a incorporação eficaz de hemaglutinina (HA) em membranas de eritrócitos e a sua actividade de fusão, foi avaliada a cinética de fusão do nosso eritro-magneto engenharia virossomas -Ha com células-alvo. Octadecil rodamina (R18) de marcação foi utilizada para determinar a fusão de eritro-magneto-HA com células HeLa virossomas. A fusão tem sido relatada como% de R18 dequenching fluorescência (SRGH) usando 560 e 590 nm como comprimento de onda de excitação e emissão, respectivamente. A fusão de eritro-magneto-HA com células HeLa virossomas começa depois de um período muito curto (poucos minutos) e a percentagem de fusão aumenta exponencialmente com o tempo (Fig. 3). Em contraste, os eritrócitos magnéticos sem hemaglutinina (HA) não mostram atividade fusão com células HeLa. Estes dados indicam que a glicoproteína de pico viral (HA) purificada a partir de vírus da gripe e reconstituída em veículos eritrócitos magnéticos mantém as suas propriedades fusogénicas com a membrana citoplasmática das células alvo e confere a eritrócitos magnéticos a capacidade de se fundir com as células-alvo.

Os virossomas HA-eritro-magneto 5-Aza-2-DC-carregadas foram marcadas com octadecilo de rodamina (R18) e incubadas com células HeLa. A fusão tem sido relatada como% de R18 dequenching fluorescência (SRGH) usando 560 e 590 nm como comprimento de onda de excitação e emissão, respectivamente. RBC: 5-Aza-2-DC-carregado eritrócitos magnéticos sem proteína de fusão HA reconstituído (Controlo); RBC-HA: 5-Aza-2-DC-carregado virossomas-HA eritro-magneto

Efeito da decitabina-carregados virossomas-HA eritro-magneto sobre as células tumorais

Para. verificar a eficiência e eficácia do nosso sistema de administração de fármaco à base de eritrócitos, que trataram células tumorais HeLa, quer com 5-Aza-2-dC sozinho ou encapsulado em virossomas HA-eritro-magneto. 5 × 10

5 células de tumor foram tratados com 1,800 ng de 5-aza-2-dC (2,5 uM), uma concentração mostrado para ter efeito terapêutico

In vitro

, ou com 1 × 10

9 virossomas HA-eritro-magneto contendo 10 vezes menos 5-Aza-2DC (180 ng).

a absorção para a célula alvo e libertação do composto terapêutico para o citoplasma das células tumorais está mostrado na Fig. 4. vezes a muito curto (de 30 min a 1 hora) que ainda é possível distinguir eritrócitos modificados que começam a misturar-se com as células alvo (Fig. 4 A e B). Após 6 horas, a maior parte das células alvo, mostram os virossomas HA-eritro-magneto dentro do citoplasma (Fig. 4 C). O eritro-magneto-HA virossoma, internalizado dentro da célula “host”, parece um endosome viral. A membrana de eritro-magneto-HA virossomas começa a fundir com a membrana da célula alvo entre 12 e 24 horas, após o que as nanopartículas fluorescentes e o fármaco começará a difundir no interior das células tumorais. Após 24 horas, todas as células de tumor mostrou uma forte fluorescência no citoplasma e alguns têm a morfologia típica de apoptose precoce. Após 96 horas a maior parte das células tumorais mostram a morfologia característica de micronúcleos tarde apoptose (Fig. 4 D).

Na esquerda está esquematizado a temporização e o mecanismo de acção dos eritro-magneto-HA virossomas, encapsulando 100 nm nanopartículas magnéticas marcadas por fluorescência (verde) e 5-aza-2-dC. Na direita são mostradas as imagens CLSM de virossomas eritro-magneto-HA (verde) depois de 30 minutos (A), 1 hora (B), 6 horas (C), 24 e 96 horas (D) de incubação com células HeLa em destaque por coloração DAPI (azul). células (CTRL) não tratada HeLa (controlo).

A eficácia de 5-aza-2-dC reconstituído em eritro-magneto-HA virossomas em promover a apoptose em relação ao fármaco livre é mostrada na Figura 5. As células HeLa não tratadas (controlo) e tratou-se com 1,800 ng 5-Aza-2-dC ou virossomas com 1 × 10

9 eritro-magneto-HA, contendo 180 ng de decitabina foram analisadas por FACS. Como controlos para avaliar possíveis efeitos tóxicos do veículo por si só em células, as células HeLa foram cultivadas também na presença da solução tampão na qual 5-Aza-2-DC-carregado virossomas eritro-magneto-HA foram suspensas (sobrenadante) e com eritro virossomas -magneto-HA encapsulando apenas os magneto-nanopartículas fluorescentes

Ctrl (controle) células não tratadas.; Aza: células tratadas com 1800 ng (2,5 mM) de 5-aza-2-DC; Eritro Aza: células tratadas com virossomas eritro-magneto-HA, contendo 180 ng de 5-aza-2-dC; Eritro: descarregado virossomas HA-eritro-magneto 5-Aza-2-dC; Sobrenadante: células tratadas com tampão onde os virossomas eritro-magneto-HA foram novamente suspensas (controle 2)

Depois de 96 horas, apenas 12,6% das células tratadas com 1800 ng do livre-5-aza. 2-dC aparecem apoptótica em comparação com 96% de células quando as células são tratadas com 180 ng em virossomas HA-eritro-magneto. Além disso, em 24 horas apoptose significativa é visto com o sistema de entrega da droga ao passo que praticamente nenhum efeito é observado para o fármaco sozinho. Estas observações sugerem que o sistema de magneto eritro-HA-virossomas entrega aumenta o efeito antineoplásico de 5-aza-2-dC através do aumento da biodisponibilidade da droga. Nem o sobrenadante, em que a 5-Aza-2-DC-carregado virossomas eritro-magneto-HA estão suspensos, nem virossomas eritro-magneto-HA contendo apenas nanopartículas fluorescentes têm um efeito sobre a proliferação celular, demonstrando que a administração de fármaco à base de eritrócitos sistema em si tem efeito não tóxico sobre as células. Em conjunto, estes resultados sugerem que este novo sistema de administração de fármaco à base de eritrócitos tem o potencial para aumentar a eficiência e a eficácia de compostos terapêuticos.

Discussão

A quimioterapia citotóxica ou radioterapia do cancro é limitada pela grave, por vezes, efeitos secundários com risco de vida, devido à falta de especificidade para células alvo sozinha. Uma estratégia para melhorar a especificidade é para encapsular os agentes terapêuticos para um sistema de entrega de droga capaz de dirigir compostos terapêuticos para um sítio alvo.

eritrócitos portador foram avaliados quanto à sua utilização na administração de medicamentos em seres humanos provando sua segurança e eficácia [ ,,,0],29]. fornecimento baseado em eritrócitos de drogas novas e convencionais está experimentando, assim, interesses crescentes na entrega de drogas e na gestão de patologias complexas, especialmente quando os efeitos secundários podem tornar-se problemas graves [13], [19], [30]. Recentemente, os eritrócitos têm sido utilizados para encapsular o antibiótico amicacina, e uma libertação controlada de eritrócitos carregados ao longo de um período de 48 horas foi demonstrado, sugerindo uma potencial utilização dos eritrócitos como um sistema de libertação lenta sistémica de antibióticos. A administração de amicacina por eritrócitos carregados em ratos leva a mudanças significativas no comportamento farmacocinético do antibiótico [31], [32]. O sistema de entrega de drogas à base de eritrócitos apresenta várias vantagens: é especialmente eficiente na liberação de drogas na circulação por longo período de tempo (semanas), os eritrócitos têm uma grande capacidade de aprisionamento, são facilmente processadas e tem capacidade para acomodar drogas tradicionais e biológicas [ ,,,0],18], [30]. Os eritrócitos carregados com o composto colóide ferromagnético pode ser accionado magneticamente no órgão alvo /tecido por meio de um campo magnético externo [21] – [23], [33] Por fim, a disponibilidade de um aparelho que permite a encapsulação de fármacos em eritrócitos autólogos torna esta tecnologia disponível em muitas situações clínicas e competitivo em relação a outros sistemas de distribuição de drogas [34].

no presente trabalho destaca-se um novo sistema de entrega de drogas à base de eritrócitos, o eritro-magneto-HA virossoma