Abstract

Usando DNA microarrays, geramos ambos os dados de expressão de mRNA e miRNA de 6 câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC ) tecidos e o seu comando normal correspondente a partir de tecidos adjacentes para identificar marcadores miRNA potenciais para diagnóstico. Nós demonstramos que o miR-HSA-96 é significativamente e consistentemente sobre-regulada em todos os 6 CPNPC. Nós validaram este resultado em um conjunto independente de 35 tumores emparelhados e seus tecidos normais adjacentes, bem como os seus soros que são recolhidos antes da ressecção cirúrgica ou quimioterapia, e os resultados sugeriram que a HSA-miR-96 pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento NSCLC e tem um grande potencial para ser utilizado como um marcador não invasivo para o diagnóstico de NSCLC. Nós previmos potenciais mRNAs alvo miRNA com base em diferentes métodos (TargetScan e Miranda). Além disso classificação dos genes de miARN reguladas com base no seu relacionamento com miARNs revelou que HSA-miR-96 e certos outros miARNs tendem a infra-regular os seus mRNAs alvo em desenvolvimento NSCLC, que têm níveis de expressão permissiva em relação a interacção entre miARNs e seus mRNAs alvo directo. Além disso, identificou-se uma correlação significativa de regulação miARN com genes coincidir com alta densidade de ilhas de CpG, o que sugere que miARN pode representar um mecanismo regulador principal que regula as funções celulares e diferenciações celulares de base, e tal mecanismo pode ser complementar a metilação do DNA na repressão ou ativar a expressão do gene

Citation:. Ma L, Huang Y, Zhu W, Zhou S, Zhou J, Zeng F, et al. (2011) uma análise integrada de miRNA e mRNA expressões em células não pequenas do pulmão. PLoS ONE 6 (10): e26502. doi: 10.1371 /journal.pone.0026502

editor: Boris Zhivotovsky, Karolinska Institutet, na Suécia

Recebido: 23 de maio de 2011; Aceito: 28 de setembro de 2011; Publicado: 27 Outubro 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Ma et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é suportado pelo Natural Science Foundation da província de Zhejiang (Y2110960) e Secretaria de Ciência e Tecnologia de Zhoushan concedido ao Professor Yongkui Zhang (20.081.059) e do Fundo de Investigação de Zhoushan Hospital atribuído ao Dr. Lina Ma, e do Programa Nacional de Pesquisa básica ( 973 Programa; 2011CB944100 e 2011CB944101) e National Natural Science Foundation da China (90.919.024) concedido ao Professor Yu junho. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Atualmente, o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é a principal causa de morte por câncer no mundo [1]. A ressecção cirúrgica é realizada principalmente nos casos em estágio inicial e também é eficaz, mas o seu efeito é limitado para pacientes com cancros avançados localmente por causa da alta taxa de metástases à distância e recorrência. Assim, quimioterapia e terapia de radiação, bem como uma combinação de ambos, são sempre executadas no tratamento de doentes com cancros avançados localmente. No entanto, a taxa de sobrevida em 5 anos dos pacientes com câncer de pulmão diminui drasticamente com os estágios clínicos da doença, por exemplo, de uma estimativa de 61% para os pacientes com a fase IA doença para 38% para os pacientes com a doença em estágio IB. Outro taxa de sobrevida em 5 anos relacionados com o estágio da doença são de 34% para pacientes com doença IIA, 13% para os pacientes com doença em estágio IIIA, de 5% para os pacientes com doença em estágio IIIB, e 1% para pacientes com estágio IV [2] , [3], [4], [5]. A maioria dos pacientes com câncer de pulmão são diagnosticados somente depois que os tumores se espalharam para além dos seus sítios primários, e esta é uma razão importante para o mau resultado de tratamentos de câncer de pulmão. Além disso, a análise de variação entre uma variedade de cancros sugeriu que o cancro do pulmão tem maior número de genes mutantes do que outros tipos de câncer [6]. Portanto, a descoberta de marcadores diagnósticos eficazes e mecanismos de interrogatório do desenvolvimento do cancro do pulmão, são ambos necessários para melhorar a taxa de sobrevivência de pacientes com câncer de pulmão.

miRNAs são RNAs não-codificantes curtas (± 22 nt de comprimento) que se ligam sequências complementares em mRNAs alvo, resultando na sua degradação selectiva ou inibição selectiva da tradução. Por conseguinte, através da regulação seus genes alvo, miARNs são conhecidas por estarem envolvidas numa vasta gama de funções biológicas, tais como a proliferação celular, a diferenciação e a apoptose [7], [8]. expressão miARNs aberrantes foi relatado para causar doenças, tais como cancros [9], doença de Alzheimer [10], doenças do coração [11], na coluna vertebral dos neurónios motores anomalias [12], e etc .. Em NSCLC, tem sido sugerido que o miR -31 pode actuar como um miARN oncogénicos reprimindo supressores de tumores: LATS2 e PPP2R2A [13], e a expressão de HSA-miR-205 tem sido sugerido para ser capaz de distinguir escamosas de carcinoma de pulmão de células não pequenas não-escamosas [14]. Além disso, evidências mostram que a alta HSA-mir-155 e de baixo HSA-deixou-7a-2 expressão correlacionados com pior sobrevida de pacientes com câncer de pulmão [15], e tem-miRNA-126 pode promover células NSCLC apoptose induzida por irradiação através do PI3K-Akt [16]. miARNs estão agora a emergir como biomarcadores altamente específicos de tecidos para discriminar cancros do tecido não canceroso, e diferentes tipos de cancro, bem como os diferentes resultados de prognóstico [15], [17].

ARNm perfis têm revelado que a anormalidade de transcrição muitos genes são responsáveis ​​pelo desenvolvimento do NSCLC [18], [19], e a expressão diferencial de miARNs foram também detectados entre tecidos de cancro do pulmão e os tecidos adjacentes normais [15], [20]. No presente estudo, foram utilizados microarrays para medir os níveis de expressão de miRNAs e mRNAs simultaneamente em emparelhado NSCLC e os seus tecidos normais adjacentes para investigar possíveis papéis dos miRNAs. Nossas análises são ambos integrados e bastante profunda, em busca de possíveis candidatos miRNAs e seus alvos de mRNA para novas investigações e aplicações clínicas.

Resultados

mRNAs expressos diferencialmente em tecidos NSCLC em comparação com os seus tecidos normais emparelhados

Realizamos perfil de expressão gênica de amostras de tecidos tumorais do normal emparelhados a partir de 6 pacientes com NSCLC e investigados 34,694 genes /transcrições. Definimos 581 genes up-regulamentados e 1, 297 genes regulados negativamente que eram consistentemente para cima ou para baixo-regulado em todos os tecidos tumorais 6 em comparação com os tecidos normais adjacentes (Tabela S2 e S3 Tabela). Entre genes diferencialmente expressos, foram identificados 2 significativamente up-regulada e 22 significativamente genes em uma falsa Descoberta Rate (FDR) de 0,1 (Tabela S2 e S3 Tabela) regulada para baixo. Nós posteriormente realizada a análise de enriquecimento GO utilizando o teste hypergeometric e método de múltiplos de ajuste de teste BH através WebGestalt2 [21] e definidas as vias enriquecidos em um

p valor

de 0,001. A distribuição hipergeométrica é uma distribuição de probabilidade discreta que descreve o número de sucessos em uma sequência de

n

chama de uma população finita, sem reposição, assim como a distribuição binomial descreve o número de sucessos para desenha com substituição. teste Hypergeometric ajuda a descobrir qual GO termos estão sobre-representados em uma lista gene grande. De acordo com os resultados do teste hipergeométricas, o processo de M-fase e metabólica ADN do ciclo celular foram predominantemente activado, enquanto que vias envolvidas em funções imunes foram significativamente reprimido em NSCLC (Tabela 1). Além disso, genes up-regulados foram predominantemente enriquecido em “cromossomo” em oposição a genes que foram predominantemente enriquecidas em “membrana celular” down-regulada (Tabela 2).

diferencialmente expressos miRNAs em NSCLC tecidos em comparação com os tecidos normais emparelhados

Realizamos expressão miRNA perfilar usando os mesmos 6 amostras pareadas do tumor primário e seu tecido normal adjacente. Obtivemos 25-regulada e 24 miRNAs que foram consistentemente para cima ou para baixo-regulado em todos os tecidos tumorais 6 em comparação com os tecidos normais adjacentes antes de teste de significância (Tabela S4 e S5) Tabela regulada para baixo. Com base numa análise mais rigorosa, obtivemos um único significativamente up-regulada miRNA, hsa-miR-96, em um falso Descoberta Rate (FDR) de 0,1. Examinamos ainda mais o nível de expressão dos seus potenciais alvos de mRNA (Estes objectivos têm conservado locais entre os vertebrados ou mamíferos ligação miRNA e foram preditos usando TargetScan): 13 dos 728 totais genes alvo candidato (Tabela S2 e Tabela S6) (conta para 2,24% dos 581 genes up-regulamentados) foram regulados positivamente e 48, do total (Tabela S3 e Tabela S6) (conta para 3,70% dos 1, 297 genes regulados negativamente) foram regulados negativamente (Figura 1A). Em seguida, validado HSA-miR-96 de expressão com base em RT-PCR quantitativo em um conjunto independente de 35 NSCLC e as suas amostras de soro (para o soro, os valores de expressão foram normalizados para as pessoas normais sem história de cancro ou outras doenças em que o tempo), e encontrado HSA-miR-96 foi significativamente regulada para cima em ambas as amostras de tecidos e soro de doentes com NSCLC (Figura 2). Portanto, hsa-miR-96 pode ser um fator importante para contribuir para o desenvolvimento NSCLC e pode ter um grande potencial para ser utilizada para diagnosticar.

(A) resultados Microarray dos candidatos alvo regulada de hsa-miR -96 em NSCLC. Nós ensaiadas 6 emparelhado NSCLC tecido normal vs.. C e N representam câncer e tecido normal adjacente, respectivamente. Os genes de marcas asterisco pertencem ao grupo correlacionados e os restantes genes estão agrupados no grupo anti-correlacionadas de acordo com a relação de expressão destes genes com os seus miARNs reguladoras. (B) A validação dos resultados de microarray por qRT-PCR. Foram selecionados 10 candidatos alvo regulada negativamente de HSA-miR-96 e realizaram experiências qRT-PCR para a validação da expressão de ARNm relativa em referência ao da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH). Os valores relativos de expressão são as médias ± SE. *,

P Art 0,05 por

t

teste; **,

P Art 0,001 por

t

teste

Foram realizados dois grupos de comparações: (1). Tumor vs. tecidos pulmonares normais adjacentes, e (2) soro de cancro vs soro de não-cancro. Relativa expressão HSA-miR-96 foi determinada em referência a um controlo de snRNA U6 interna. Os valores de expressão relativa são a média normalizada ± SE.

Como miRNAs sempre reprimir a expressão dos genes-alvo, as 48 metas para baixo-regulados de hsa-miR-96 pode ser mais susceptível de contribuir para NSCLC desenvolvimento através da regulação hsa-miR-96. Foram selecionados 10 alvos regulada negativamente de HSA-miR-96 para validar os seus níveis de expressão de mRNA utilizando qRT-PCR em 20 NSCLC e descobriu que todos eles eram significativamente regulada para baixo em tecidos de tumor quando comparada com os tecidos normais adjacentes (Figura 1B ). Para investigar como esses 48 alvos de mRNA potenciais regulada pode afetar o desenvolvimento das NSCLC, que os classificou com base em termos GO, e descobriram que estes genes estavam envolvidos em uma variedade de processos biológicos básicos, incluindo o metabolismo, regulação biológica, comunicação celular, processo de desenvolvimento, o sistema imunológico, e etc. (Figura S2).

Classificação de mRNAs com base em sua relação com miRNA regulação

Para caracterizar como miRNAs podem regular seus mRNAs alvo, foi realizada uma extensa análise sobre a expressão correlacionada de miRNAs e seus mRNAs alvo. miARNs são expressos como RNAs precursoras longas que são processados ​​por uma nuclease celular, Drosha, antes de serem transportados por um mecanismo de exportina-5-dependente no citoplasma [22], [23]. Uma vez no citoplasma, miARNs são clivados pela enzima mais DICER [24], [25], e isto resulta em 17-24 nt miARNs que estão associados com um complexo celular que é semelhante ao complexo de silenciamento induzido por ARN que participa interferência de ARN. No entanto, miARNs regular principalmente da tradução do mRNA, ao passo que os siRNAs destruição de ARN directa através da via interferência de RNA (RNAi) [8], [26]. Portanto, a abundância de miRNAs pode depender principalmente de sua expressão original e não importadas de forma exógena. Além disso, várias linhas de evidência sugerem que a elevação de miARN chumbo expressão para a sub-regulação dos genes alvo, e redução de miARN chumbo expressão para a sobre-regulação dos genes-alvo [13], [27]. Por conseguinte, a hipótese de que o efeito de miARNs nos seus mRNAs alvo é dependente de nível-expressão. Nós usamos uma medida inovadora para avaliar regulação miRNA, denominado

valor de regulação

. Em primeiro lugar temos que assumem um valor de regulação de um miARN é positivamente correlacionada com o seu nível de expressão. Uma vez que um miARN sempre tem mais de um genes alvo [28], que, em seguida, assumir que um valor de regulação de um determinado miARN está negativamente correlacionada com o número de seus alvos. Portanto, nós definimos um valor de regulamento para miRNA como o desvio no nível de expressão de um determinado miRNA dividido pelo número de alvos de mRNA expressos.

Durante o desenvolvimento do câncer, o regulamento pode variar de caso para controlar um determinado miRNA e, por conseguinte, o valor de regulação de um determinado miARN é igual à variação de expressão miARN dividido pelo número de alvos expressos. Quando a expressão de um miRNA é regulada em cancros, o seu valor regulamentação se torna negativo se o número de suas metas expressas não é alterado significativamente. Para um ARNm alvo, o seu valor de regulação é a soma de todos os valores de regulação de reguladores seus miARN. Com base nessas definições, classificamos todos os genes diferencialmente expressos em cancros em diferentes grupos com base em suas correlações-correlacionados ou anti-correlacionados com a regulação miRNA. Antes de fazer isso, previmos as potenciais genes alvo destes miRNAs consistentemente para cima ou para baixo-regulados.

Foram utilizados três métodos para prever os potenciais alvos de miRNAs. O software TargetScan se concentra mais em sementes de miRNA (2-8nt na região 5 ‘do maduro miRNA), como evidência sugere a importância desta região para o reconhecimento do alvo miRNA [29], [30], [31], [32]. Além disso, a conservação da sequência de locais-alvo tem sido considerada como uma característica importante para reduzir a taxa de falsos positivos [30]. Por isso, previu alvos miRNA potenciais usando TargetScan e sites de destino conservados entre vertebrados e mamíferos usando

P

método CT de TargetScan [33]. No entanto, os sites de sementes nem sempre conferem a repressão, eo software miRanda também leva em consideração de outra região do miRNA, além de sementes locais [34]. Em seguida, usamos miRanda como um outro método alternativo para prever alvos de miRNA. O software dois eram frequentemente usadas para prever alvos de miARN, e, além disso, ambos podem ser usados ​​para prever alvos de novos miARNs como o illuminia miARN microarray “humanMI_V2” contém muitos novos miARNs que são gerados a partir de esforços de sequenciação da próxima geração em todo o mundo. Obtivemos 16,160 pares de miRNA-alvo conservadas entre os vertebrados ou mamíferos usando

P

método CT de TargetScan (Tabela S6), 70,320 pares de miRNA-alvo usando TargetScan sem considerar o estado de conservação (Tabela S8), e 77,988 pares de miRNA-alvo usando miranda (Tabela S10). Observou-se que 48,841 pares de miRNA-alvo estavam presentes em ambos os resultados TargetScan e Miranda (69,46% dos resultados TargetScan, 62,63% dos miRanda resultados), e 12.403 pares de miRNA-alvo de resultados TargetScan conservados eram comuns com resultados Miranda (76,75% dos conservada resultados TargetScan). Portanto, havia cerca de 70 resultados% de previsão que eram comuns nos dois métodos diferentes, e conservadas resultados de previsão de TargetScan exhibite uma proporção maior de genes compartilhados.

Temos primeiro utilizou os resultados de previsão conservadas para classificar mRNAs com base em sua relação com a regulação miRNA. Em particular, nós definimos 197 e 190 genes como anti-correlacionadas e correlacionados, respectivamente, e 1491 como “outros”, cujo miRNA regulação valores são nulos (Tabela S7). Nós investigamos ainda mais a distribuição do valor regulação miRNA, o nível de expressão do gene e a potencial relação entre estes dois parâmetros. Nos 197 genes anti-correlacionadas, 171 (conta para 13,18% de 1, 297 genes regulados negativamente) foram regulados negativamente e 26 (conta para 4,48% de 581 genes up-regulamentados) foram up-regulada. distribuição de genes com base no valor de regulação também sugerido que o grupo anti-correlacionada foram sempre regulada negativamente por miARNs (Figura 3A). Nos 190 genes correlacionados, 140 (conta para 10,79% de 1, 297 genes regulados negativamente) foram para baixo-regulado e 50 (conta para 8,61% de 581 genes up-regulamentados) foram up-regulada. distribuição de genes com base no valor de regulação sugeriu que o grupo correlacionada foram sempre regulada para baixo (Figura 3A). Para 1.491 genes em “outros”, 986 (conta para 76,02% de 1.297 genes regulados negativamente) foram para baixo-regulado e 505 (conta para 86,92% de 581 genes up-regulamentados) foram regulados positivamente (Tabela 3). Em conclusão, estes resultados indicam que miARNs tendem a infra-regular a expressão do gene, especialmente para as do grupo de anti-correlacionada. Nós também investigou potenciais funções do grupo anti-correlacionado, que deveriam ser regulados por miRNAs, e descobriu que eles estavam envolvidos em uma variedade de processos biológicos, incluindo o metabolismo, sistema imunológico, morte celular, o desenvolvimento do organismo multicelular, e comunicação celular ( Figura S3).

Nós classificamos todos os mRNAs de expressão variável durante o desenvolvimento do cancro do pulmão com base na sua relação com miRNAs. Os resultados são classificados em correlacionada, anti-correlacionado, e outros (nenhuma correlação). Os mRNAs correlacionados mostrar expressões correlacionada com suas expressões de miRNA reguladoras e os mRNAs anti-correlacionadas não são. Três métodos diferentes foram utilizados para prever potenciais alvos de miRNA: “conservada” são os genes que têm conservado miRNA locais entre os vertebrados ou mamíferos de ligação, e estes genes foram previstos usando o

P

método CT de TargetScan ; “TargetScan” são os genes que estão previstos usando um script perl de TargetScan sem considerar conservação. “MiRanda” são os genes que são alvos potenciais previstos com base em miRanda v3.3a na plataforma Linux. distribuição (A) Gene dos mRNAs correlacionados e anti-correlacionados foi traçada com base em seus valores de regulação miRNA. distribuição (B) Gene dos três grupos de ARNm foi representada graficamente com base nos seus valores de expressão. O valor da expressão foi definida através da referência a do tecido normal adjacente (log2). (C) A relação entre a expressão do gene e regulação miRNA.

Verificou-se ainda mais este resultado usando previsões de TargetScan sem considerar conservação da sequência e previsões de Miranda. Usando Miranda, temos 482 e 294 genes como anti-correlacionadas e correlacionados, respectivamente, e 1102 como “outros”. Usando TargetScan sem considerar conservação, temos 472 e 285 genes como o anti-correlacionadas e correlacionados, respectivamente, e 1121 como “outros”. Nós investigamos ainda mais a intersecção entre TargetScan e Miranda, e descobriu que os três métodos partilhado cerca de 80% no grupo anti-correlacionadas; TargetScan e Miranda partilhado cerca de 70% de genes no grupo correlacionada, enquanto

P

método CT compartilhada apenas cerca de 50% de genes com os dois métodos no grupo correlacionada. Consistente com os resultados de previsões conservadas, miARN no grupo anti-correlacionada parecem regular a proporção mais elevada de ARNm regulada para baixo em comparação com os restantes grupos definidos com base nos dois métodos seguintes (Tabela 3), e o grupo anti-correlacionada exibiram surpreendentemente diferente distribuição do valor regulação, em comparação com o grupo correlacionada (Figura 3A).

em seguida, examinou-alvo nível de expressão dos três grupos de regulação e constatou que o nível do grupo de anti-correlacionada expressão foi mais elevado do que os restantes grupos (Figura 3B). Outras investigações de valores de regulação com o nível de expressão mostraram que os genes altamente expressos no grupo anti-correlacionado tendiam a ser regulada por miRNAs, enquanto genes humilde expressas tendem a ser sobre-regulada. Genes no grupo correlacionada se comportar da maneira oposta (Figura 3C). Este resultado sugeriu que os genes altamente expressos podem contribuir mais para genes-down regulamentada no grupo anti-correlacionadas do que genes up-regulamentados no mesmo grupo.

relação potencial dos miRNAs com metilação na regulação do mRNA expressão

como metilação é outro mecanismo importante para regular a expressão de mRNA, que mais estudou como ele pode interagir com a regulação miRNA. Em primeiro lugar, categorizou os genes-alvo para HCG (alto teor de CpG), LCG (teor de CpG intermediário) e ICG (baixo teor CPG) classes (Tabela S2 e S3) Tabela de acordo com um método descrito anteriormente [35]. Verificou-se que nos resultados de predição conservadas, tanto o anti-correlacionadas e grupos correlacionados continha mais genes de HCG do que os outros ou todos os genes (Figura 4A), e o resultado sugere que os genes de HCG têm maior probabilidade de ser regulada por miARNs que conservaram alvo locais.

(A) A distribuição de densidade de CpG-genes classificadas em cada grupo. Estes genes alvo foram previstas utilizando três métodos diferentes: “conservada” são os genes que têm conservado miRNA locais entre os vertebrados ou mamíferos de ligação, e estes genes foram previstos usando o

P

método CT de TargetScan; “TargetScan” são os genes que estão previstos usando um script perl de TargetScan sem considerar conservação. “MiRanda” são os genes que são alvos potenciais previstos com base em miRanda v3.3a na plataforma Linux. (B) Relação entre CpG densidade ilha e expressão do gene. Três grupos foram classificados:. Todos os genes expressos em NSCLC, os genes regulados por miARN, e outros genes que não podem ser influenciados por miARNs

Uma vez que um grande número de genes altamente expresso no foram encontrados grupo anti-correlacionadas, nós ainda perguntou se esses genes HCG são sempre altamente expresso e tendem a miRNA-regulado. Em todos os genes expressos em NSCLC, genes HCG não foram vistos como dominante em genes altamente expressos em comparação com os genes ou LCG ICG. As expressões de pico de HCG gama de 5 a 10, enquanto que aqueles dos genes ICG ou LCG estão numa gama de 2 a 7. miARN tende a regular mais genes ao nível da expressão relativa de 5 a 10, por conseguinte, quando regulada por miARNs, o pico da ICG ou expressões de genes LCG deve ser nesta gama, e observou-se que havia menos LCG genes nesta gama de expressão, em comparação com genes de hCG ou ICG. No entanto, os “outros” (genes sem variação do valor de regulação) também tem um pico na gama de expressão, mas não houve diferença na densidade de genes entre as três classes de CpG (Figura 4B). Em resumo, os genes de HCG pode ser enriquecido genes que são regulados por miRNAs devido aos seus elevados níveis de expressão, mas isso obviamente não é a única razão.

análise GO também realizada entre o miRNA-regulado e miRNA-insensitive grupos para mostrar que seus genes e funções são diferentes do anti-correlacionadas e os grupos correlacionados (Figura 5 e Figura S5). Como é mostrado na Figura 5, o grupo miARN-regulada contém mais genes nos seguintes processos: regulação da transcrição, ligação de ácidos nucleicos, de comunicação celular, metabolismo, regulação e desenvolvimento. Estas diferenças demonstram de outro ângulo por que miRNAs tendem a afetar genes HCG com sítios-alvo de miRNA conservadas como CpG conteúdo ilha está sempre correlacionada com a regulação gênica e diferenciação funcional, e esses genes pode ser de importância para as funções celulares básicas de diferentes vertebrados ou mamíferos [36 ]

P

. 0,05 foi considerado significativo [67]

Discussão

neste estudo, nós investigamos o mRNA. e miARN perfis de NSCLC. ARNm perfis revelado que um número de genes diferencialmente expressos-estão envolvidos na activação do ciclo celular em NSCLC. Este resultado é consistente com os resultados de estudos anteriores, que sugerem que o ciclo celular anormal está associado a risco elevado de câncer de pulmão [37], [38]. Os genes regulados de deslocamento encontram-se predominantemente a ser enriquecida em sistemas imunológico, bem como as localizadas nas membranas celulares, os quais são geralmente correlacionadas com a comunicação célula-célula e participam no processo imunológico. Inibições destes genes foram supostamente para facilitar o desenvolvimento do câncer pulmonar e progressão, e isso pode, em certa medida, devido à fuga de células cancerosas de detecção e destruição pelo sistema imunológico do hospedeiro [39], [40], [41].

em miRNA profiling comparação, encontramos hsa-miR-96 foi significativamente sobre-regulada em NSCLC. 48 HSA-miR-96 alvos potenciais foram predominantemente enriquecido no grupo mRNA regulada para baixo e estão envolvidos numa variedade de processos biológicos de acordo com as anotações GO. Com base em estimativas de valor de regulamentação, que mostrou que 42 deles pertencem ao grupo anti-correlacionado (Figura 1A, quadro S7). As nossas experiências de validação revelou que a forma madura de HSA-miR-96 é altamente expresso não só em tecidos de cancro, mas também nos soros de pacientes com cancro. Este resultado sugere que hsa-miR-96 tem um grande potencial para ser utilizado como um biomarcador não invasivo para o diagnóstico de NSCLC.

O nosso conhecimento atual sobre HSA-miR-96 é bastante limitado. Reside na zona intergénica entre NRF1 e UBE2H em [42] cromossoma humano 7 e tem uma distribuição muito ampla entre os animais, a partir de nemátodos aos mamíferos, e é mais conservada entre vertebrados (Figura S4). Estudos anteriores sugeriram que funciona para regular a progressão da diferenciação em células de mamífero cocleares ciliadas externas e internas [43], e é associada com comportamentos agressivos humanos [44]. Em relação a cancros, HSA-miR-96 tem sido relatada a ser altamente expresso no cancro da bexiga [45], carcinoma da próstata [46], e leucemia mielóide crónica [47]. Ele pode ser detectado na urina e está correlacionada com a fase e o grau com base na citologia urinária de carcinoma urotelial [48]. -Regulação de hsa-miR-96 resultados na baixa de regulamentos de FOXO3a fator de transcrição e FOXO1, e, portanto, induz a proliferação celular no cancro da mama humano [49], [50]. Em nossos testes, encontramos um conjunto de alvos potenciais que podem se correlacionam com a função de hsa-miR-96 no desenvolvimento NSCLC, mas nenhum dos potenciais alvos foram validados por meio de experimentos. Portanto, novas experiências é da essência em revelar relação entre HSA-miR-96 e NSCLC. Além disso, irá aumentar o tamanho da amostra para investigar possíveis relações de HSA-miR-96 de expressão com o prognóstico, e outras características de NSCLC.

Em geral, miARNs Acredita-se que se ligam a região não traduzida a 3 ‘ de um mRNA alvo e para baixo-regular sua expressão no mRNA ou níveis de proteína, mas principalmente a nível mRNA [51]. Portanto, quando a expressão de um miARN é elevada, os mRNAs que são regulados pelo miARN deverá ser regulada para baixo; quando a expressão de miRNA é reprimido, seus mRNAs alvo deve aparecer-regulamentação. No entanto, de acordo com nossos resultados, os mRNAs anti-correlacionadas são sempre regulada para baixo e apenas uma pequena fração dos genes são regulados positivamente. Uma análise mais aprofundada sugerido que no grupo de anti-correlacionado, ARNm sub-regulada são sempre altamente expresso, e os ARNm sobre-regulada são sempre expressos modesto. Por conseguinte, a existência de mais genes altamente expressos podem ser um importante contribuinte para o efeito. A razão pela qual mRNAs altamente expressas tendem a ser regulada por miRNAs e mRNAs humilde expressas tendem a ser up-regulada por miRNAs sugere uma existência de um equilíbrio regulatório que funciona para manter todo o transcriptoma em um intervalo dinâmico otimizado.

Em nossa análise, que não conseguimos encontrar quaisquer pistas que são responsáveis ​​pela diferença entre o anti-correlato e os mRNAs correlacionados. classificação GO não mostrou qualquer diferença óbvia ou (Figura S5). Além disso, os níveis de expressão dos mRNAs alvo que têm um alto valor de regulação não apresentaram variação significativa, e vice-versa (Tabela S2, Tabela S3, Tabela S7, Tabela S9, Tabela S11), e genes cuja expressão são significativamente variado não são necessariamente significativamente regulada. Uma vez que um mRNA é muitas vezes regulada por mais de um miRNAs [28], ainda não somos capazes de saber como esses miRNAs interagir uns com os outros, e que tipo de interações diretas são mais eficazes. Além disso, os miRNAs podem reprimir seus genes-alvo apenas no nível de proteína [52] e as metas não podem apresentar mudanças perceptíveis ao nível mRNA. Existem outros factores que estão envolvidos na regulação do ARNm em níveis epigenética, tais como histona metilação [53], [54] e acetilação [55], [56], e que são sempre capazes de interferir com miARN centrada redes [57] , [58], fazendo decifrar tais redes mais difícil.

Outra observação interessante é que os genes em qualquer um do grupo correlacionada ou o grupo anti-correlacionada têm uma proporção maior de genes de HCG do que no grupo de “outros”. Tanto a correlacionados e os grupos anti-correlacionada for considerado mais provável para ser influenciada ou regulada por possivelmente miARNs. Este resultado sugere que miARNs tendem a regular os genes de hCG. Outras investigações demonstraram que os genes HCG tenderam a expressar em um nível superior, quando comparado com ICG ou genes LCG. Portanto, pode haver uma possibilidade de que mais genes HCG são influenciados por miARNs. No entanto, as comparações com base em todos os alvos potenciais não demonstrou qualquer diferença entre estes grupos (Figura 4A). Como o padrão rigoroso alvos selecionados têm conservado locais de ligação de miRNAs entre os vertebrados ou mamíferos, genes alvo mais HCG no grupo miRNA-influenciada pode estar correlacionada com a evolução gene entre os vertebrados.

GO comparação entre o regulado e os grupos não regulamentados demonstraram eles eram muito diferentes como o ex sempre contém mais genes envolvidos na regulação da transcrição, a ligação de ácido nucleico, de comunicação celular, metabólicas e de regulação do desenvolvimento. A função dos genes e sua expressão é sempre correlacionado com o conteúdo ilha CpG de promotores. Sugeriu-se que as funções de manutenção da casa são significativamente sobre-representados na classe HCG, ao passo que os termos associados com funções específicas característicos de células mais diferenciadas ou altamente regulados são significativamente sobre-representados na classe LCG [36], [59]. miARN tem sido proposto para ser um mecanismo de regulação primária, uma vez que está presente a partir de baixo para os organismos altas, por conseguinte, pode preferir para regular uma proporção mais elevada de genes de HCG para as funções celulares básicas.