Abstract

fissuras lábio palatinas proteína transmembranar 1-Like (CLPTM1L), reside em uma região do cromossomo 5 para as quais o ganho de copiar número foi encontrado para ser o evento genético mais frequente nas fases iniciais do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Este lugar foi encontrado por vários estudos genoma ampla associação a ser associados com câncer de pulmão em fumantes e não-fumantes. CLPTM1L tem sido identificada como uma proteína sobre-expresso em linhas celulares de tumores do ovário humano que são resistentes a cisplatina, a qual é a única visão, até agora, para a função de CLPTM1L. Aqui encontramos a expressão CLPTM1L de ser aumentada em adenocarcinomas do pulmão em comparação com tecidos pulmonares normais pareados e no pulmão linhas de células tumorais por mecanismos não exclusivos para copiar ganho número. Após a perda de acumulação CLPTM1L em células de tumores pulmonares, cisplatina e camptotecina apoptose induzida foram aumentados em proporção direta com o nível de CLPTM1L knockdown. acumulação de Bcl-xL foi diminuído significativamente após a perda de CLPTM1L. Expressão de exógena Bcl-xL abolida sensibilização a apoptóticos matando com CLPTM1L knockdown. Estes resultados demonstram que CLPTM1L, uma proteína sobre-expressos em células de tumor de pulmão, protege contra o stress genotóxico apoptose induzida através da regulação da Bcl-xL. Assim, este estudo implica função CLPTM1L anti-apoptótica como um potencial mecanismo de susceptibilidade à tumorigênese pulmonar e resistência à quimioterapia

Citation:. James MA, Wen W, Wang Y, Byers LA, Heymach JV, Coombes KR, et ai. (2012) Caracterização funcional de CLPTM1L como um gene candidato Lung Cancer Risk no 5p15.33 Locus. PLoS ONE 7 (6): e36116. doi: 10.1371 /journal.pone.0036116

editor: Swati Palit Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Agosto, 2011; Aceito: 30 de março de 2012; Publicação: 04 de junho de 2012

Direitos de autor: © 2012 James et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma NCI Cancer Support Center Grant CA91842 # P30, o projeto Atlas proteína humana, e Grant NCI U19CA148127. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

CLPTM1L é assim chamado com base na sua homologia com fissuras lábio palatinas proteína transmembranar 1, que foi identificado como interrompido em uma família com fissura de lábio e palato [1]. CLPTM1L foi identificado como um transcrito regulado para cima em uma linha de células de tumor de ovário resistente a cisplatina [2]. No entanto, a interpretação dos resultados deste estudo é difícil, porque não há nenhum mecanismo de implicação e o efeito da sobreexpressão de CLPTM1L na sensibilidade cisplatina foi conflitantes em diferentes linhas de células de tumor de ovário, dependendo do seu nível pré-existente de resistência. No entanto, foi sugerido um papel para CLPTM1L na resistência à cisplatina. Curiosamente, o CLPTM1 homólogo foi encontrado para ser expressa em níveis elevados em tumores da mama resistentes à doxorrubicina e a expressão de CLPTM1 é preditiva de resposta à doxorrubicina [3]. Um estudo recente constatou que uma variante genética no gene CLPTM1L (rs402710) está associada com a acumulação de aductos de ADN em tecido pulmonar adjacente tumoral [4]. Esta mesma SNP, entre outras, na região dos genes CLPTM1L e terc está associada a risco de cancro do pulmão [5], [6], [7]. Em um estudo recente sobre o cancro do colo do útero a integração de dados de dosagem do gene e de expressão, o locus CLPTM1L /TERT foi encontrado para ter cópia ganho número em tumores e padrões de expressão que se correlacionaram com aumento de número de cópias [8]. Outro estudo recente revelou que, com número de cópias do ganho entre 5p, CLPTM1L expressão foi aumentado aproximadamente 5 vezes em linhas celulares de cancro do colo do útero mais células epiteliais cervicais normais, enquanto que a expressão dos outros genes em 5p15.33 não foi alterada [9]. Esses insights sobre a função da CLPTM1L, eo fato de que copiam ganho número da região de 5p cromossomo contendo CLPTM1L é o evento citogenética mais frequente nos estágios iniciais de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) [10] são justificação convincente para o estudo do papel de CLPTM1L no cancro do pulmão, bem como outros tipos de cancro.

danos no ADN, tal como a causada por agentes quimioterapêuticos genotóxicos, induz a apoptose através de cinases de quebra de cadeia dupla associada, e subsequente regulação da transcrição de apoptótica efetores principalmente através de p53 [11]. membros da família Bcl-2 regulada por p53, incluindo o Bax são centrais para a activação da apoptose por esta via e ato pela permeabilização da membrana mitocondrial [12]. Anti-apoptótica membro da família Bcl-2, Bcl-xL protege as células cancerosas de p53 induzida apoptose [13] e actua através da ligação e inactivação de Bax, [14] e a ligação de proteínas que recrutam Bax para a membrana mitocondrial [15]. Bcl-XL é frequentemente sobre-expressos em tumores de pulmão, está associada com mau prognóstico [16], [17] e desempenha um papel importante na resistência aos agentes quimioterapêuticos genotóxicos no pulmão e outros tipos de câncer [18], [19], [20] , [21], [22], [23]

Embora uma ligação de CLPTM1L ao cancro é sugerida pelo aumento de número de cópia, genoma ampla associação e estudos em linhas de células de tumor de ovário.; a função de CLPTM1L e o seu papel na tumorigénese é até agora desconhecida. Aqui mostramos que CLPTM1L é um factor anti-apoptótico geralmente sobre-expressa em tumores do pulmão. Knockdown de CLPTM1L transcrição em células NSCLC resulta num aumento da sensibilidade ao stress genotóxico morte mediada por apoptose e diminui a expressão de Bcl-xL de uma forma dependente da dose de expressão CLPTM1L. Além disso, a expressão de exógena Bcl-xL abole sensibilização ao estresse genotóxico apoptose induzida por CLPTM1L knockdown. Este efeito protector não é exclusivo de cisplatina mediada matar. Em vez disso, CLPTM1L age indiretamente como um inibidor geral da via mitocondrial da apoptose por meio de regulamentação Bcl-xL. Estes resultados demonstram um papel para CLPTM1L na resistência quimioterapêutico em células de tumor de pulmão, e sugerem um papel para CLPTM1L na tumorigênese pulmonar através de proteção contra a apoptose através de uma maior acumulação de Bcl-xL.

Resultados

Expression de CLPTM1L no pulmão tumores

relatórios apresentados de cópia ganho número no cancro do pulmão, a evidência GWAS, e aumento da expressão de CLPTM1L em células de tumor de ovário resistentes cisplatina, procurou-se determinar se CLPTM1L foi sobre-expressos em tumores de pulmão. Expressão de ARNm CLPTM1L em tumores NSCLC paciente foi comparada com a de tecidos tumorais adjacentes correspondentes por qPCR. CLPTM1L foi aumentado em uma média de 2,24 vezes atingindo um significado global para expressão diferencial em 30 pacientes estágio I NSCLC (p = 0,0028, de Student Dois-atado T-Test) (Figura 1A). Embora a expressão TERT foi em média de 1,76 vezes maior nos tecidos tumorais, diferenças globais na expressão TERT não atingiu significância e não foram significativamente correlacionada com a expressão CLPTM1L (r

2 = 0,0018, p = 0,994) (Figura S1A). A amostra foi composta de 22 adenocarcinoma e 8 pacientes de carcinoma espinocelular Tabela S1 descreve as características conhecidas da população do estudo. Não houve diferença no tumor sobre-expressão entre carcinomas de células escamosas e os adenocarcinomas (dados não mostrados). Análise de dados de expressão de microarranjo de linhas celulares de tumores pulmonares 148 e 59 linhas de células “normais” imortalizado com TERT e Cdk4 confirmaram estes resultados, revelando uma diferença média dobra 2,02 na expressão CLPTM1L comparação com linhagens de células imortalizadas (p = 1.48E-9, Two Teste t de Student -tailed) (Figura 1B). Estes dados também demonstram que a expressão de CLPTM1L é aumentada em células tumorais por outros de cópia variação do número de mecanismos, como a análise excluindo aquelas linhas de células de tumor com a variação do número de cópias permaneceu significativa (p = 1.28E-8, bicaudal de Student t-teste) e semelhantes em magnitude (1,83 vezes) (Figura 1C). a mudança do número de cópias foi idêntica entre os genes CLPTM1L e terc. No entanto, não foi observada nenhuma correlação entre a expressão e expressão CLPTM1L TERT dentro de linhagens de células tumorais (R

2 = 0,0126, p = 0,175) (Figura S1B). A análise da expressão foi também realizado para os diferentes subtipos de tumor do pulmão. linhas celulares de adenocarcinoma mostraram um 2,15 vezes maior expressão média CLPTM1L através de linhas de células imortalizadas normais (p = 3.59E-7, bicaudal de Student T-Test) e pequena cela linhas de células do cancro do pulmão mostraram um 2,07 vezes maior expressão média (p = 1,15 T-Test E-9, bicaudal de Student) (Figura 1D). Portanto, o aumento da expressão CLPTM1L parece ser uma característica de tumores do pulmão, independentemente do subtipo.

A) acumulação CLPTM1L transcrição tal como medido por qPCR em tecidos de adenocarcinoma do pulmão em relação à média de tecido adjacente normal de tumor combinados em 30 pacientes demonstrando um aumento médio de 2,23 vezes na expressão em tecidos tumorais. B) Acumulação de CLPTM1L transcrição conforme medido por micro-arranjo em linhas de células de tumor de pulmão em relação à média de linhas de células imortalizadas não transformadas que demonstram um aumento médio de 2,02 vezes na expressão em linhas de células de tumor. C) A linha de células de dados de expressão, à excepção das linhas de células tumorais com a variação do número de cópias demonstrando um aumento de 1,83 vezes em linhas de células de tumor. Linha D) celular dividida em linhas celulares de adenocarcinoma e linhas celulares de cancro do pulmão de pequenas células. barras pretas representam valores médios. p-valores foram obtidos utilizando um teste t de Student de duas caudas.

Resistência Confere CLPTM1L ao estresse genotóxico induzido apoptose em células de tumor de pulmão

Uma vez que a expressão aumentada de CLPTM1L está associada com tumores pulmonares, que destinada a modular os níveis CLPTM1L nas linhas celulares de adenocarcinoma de pulmão e determinar a resposta a agentes genotóxicos. Knockdown de CLPTM1L em A549 e H838 linhas celulares de adenocarcinoma de pulmão foi realizada utilizando três vectores virais independentes shRNA e resultou em uma gama de eficiências de até 90% tal como medido por quantitativa PCR em tempo real e por imunotransferência (Figura 2A e B). O efeito do knockdown CLPTM1L em matar por cisplatina foi determinada nestas linhas celulares. As células foram contadas, plaqueadas em número igual a cerca de 50% de confluência, e ensaiaram-se quanto à viabilidade por contagem de células após 48 horas de tratamento com cisplatina. A morte de células de tumor de pulmão de cisplatina foi aumentado por perda de CLPTM1L de uma forma dependente da dose, variando de 53% de viabilidade em células A549 com o vector sozinho a 12% de viabilidade em células com shCLPTM1L-3 (Figura 2C). Do mesmo modo, a apoptose induzida em células A549 com knockdown estável de CLPTM1L usando camptotecina, um inibidor da topoisomerase I células A549 foram plaqueadas em números iguais e ensaiaram-se quanto à viabilidade por ensaio MTS após 48 horas de tratamento com camptotecina. Mais uma vez, a perda de CLPTM1L através de células de tumor de pulmão knockdown sensibilizados shRNA a dose morte por apoptose dependente de uma maneira consistente com o nível de expressão CLPTM1L (Figura S2), demonstrando que os efeitos anti-apoptóticos de CLPTM1L não é exclusivo de cisplatina. Resultados semelhantes foram observados em células H838, o que demonstrou aumento da sensibilidade à camptotecina morte induzida mediante knockdown de expressão CLPTM1L (Figura 2D). Consistente com estes resultados, exógeno sobre-expressão de CLPTM1L em células H1299, que foram determinadas para expressar níveis relativamente baixos de transcrição CLPTM1L endógena comparada com as células A549 por análise de microarray (dados não mostrados), resultou um aumento da viabilidade celular de 27% com vector sozinho a 36% com CLPTM1L sobre-expressão (p 0,04) depois do tratamento com camptotecina em relação ao DSMO controlos do solvente (Figura 2E)

a) Queda de expressão CLPTM1L em células A549 através de shRNA estável.. A confirmação da knockdown por western blot (inserção). B) Queda de expressão em células H838 CLPTM1L através shRNA estável. A confirmação da knockdown por western blot (inserção). C) viabilidade celular relativa de células A549 com CLPTM1L knockdown após 48 horas de tratamento com a mídia ou cisplatina. D) a viabilidade celular relativa de células H838 com CLPTM1L knockdown após 48 horas de tratamento com o veículo DMSO ou 1 uM camptotecina. E) a viabilidade celular relativa das células H1299 com CLPTM1L sobre-expressão de 48 horas após o tratamento com veículo de DMSO ou 10 ^ M de camptotecina. As barras de erro representam um desvio padrão da média de triplicados biológicos.

Anexina V imunofluorescência detectada por citometria de fluxo foi usada como um marcador de apoptose precoce em células A549 com ou sem CLPTM1L knockdown e tratamento com cisplatina. Observou-se um aumento dependente da dose na apoptose com perda de CLPTM1L (Figura 3A). Enquanto apenas 16% das células com vector sozinho foram apoptose após tratamento com cisplatina 10 uM durante 24 horas, 76% das células com shCLPTM1L-3 eram apoptóticas. A resistência à cisplatina induziu apoptose foi encontrado para ser proporcional à quantidade de CLPTM1L acumulação de transcrição nestas células, com um r

2 de 0,9808 (p = 2 × 10

-8) entre cento knockdown e percentagem de células apoptóticas ( Figura S3A). As concentrações de cisplatina nos limites mais baixos de sensibilidade foram usadas para permitir a resolução de sensibilidades conferidos por diferentes níveis de CLPTM1L knockdown. Os agentes que danificam o ADN cisplatina e nitrosamina 4- (metil-nitrosamina) -1- (3-piridil) -1-butanona (NNK), tanto a acumulação de ADN causada quebras na cadeia independentemente da expressão CLPTM1L como detectado pelo método COMET (Figura S4) . Portanto, o aumento observado na sensibilidade ao cisplatino tositivity após a perda de CLPTM1L é devido a um efeito sobre a apoptose ou de sinalização apoptótica, em vez de um efeito sobre os níveis de danos de ADN aguda. Sensibilidade à cisplatina induziu apoptose também foi aumentada com a perda de expressão CLPTM1L por shRNA em células de tumor H838 (Figura 3B), medido pelo ensaio de actividade da Caspase 3/7 colorimétrico. Mais uma vez a resistência à apoptose induzida por cisplatina era proporcional à quantidade de acumulação CLPTM1L transcrição nas células, com um r

2 de 0,8847 (p = 1,3 x 10

-4) entre cento e knockdown relativa actividade da caspase 3 (Figura S3B). O aparecimento de células em cultura é consistente com o aumento da sensibilidade à apoptose induzida por cisplatina após a perda de CLPTM1L (Figura 3C).

A) Anexina ligação por citometria de fluxo de células A549 com CLPTM1L knockdown após 48 horas de tratamento com cisplatina V . B) 3/7 atividade caspase Relativa em células H838 com CLPTM1L knockdown após 48 horas de tratamento com cisplatina. As barras de erro representam um desvio padrão da média. ** – P 0,01 * – p 0,02 por bicaudal teste t de Student. C) micrografias de células A549 com CLPTM1L knockdown após 24 horas de tratamento com 50? M cisplatina mostrando aumento da morte celular genotóxico quando da perda de CLPTM1L.

Regulamento de Bcl-xL Expression é essencial para Efeitos CLPTM1L na apoptose

para investigar o mecanismo de protecção CLPTM1L de apoptose, foram medidos os níveis de proteína de reguladores de apoptose em células A549 não tratados em comparação com os tratados com cisplatina. Para a avaliação do requisito de CLPTM1L para a regulação da apoptose, foram avaliadas as construções knockdown mais eficazes em células A549 (SH2 e SH3). O tratamento de células A549 com 20 pM de cisplatina induziu acumulação de p53 e o p53 alvo pró-apoptótica, Bax, e diminuição da acumulação da proteína anti-apoptótica de Bcl-2, de acordo com o dano do DNA induzido intrínseca via apoptótica (Figura 4A). Expressão destes reguladores apoptóticos não foi afetado pelo knockdown da sozinho CLPTM1L. No entanto, a proteína anti-apoptótica de Bcl-xL, enquanto afectada pelo tratamento com cisplatina em células A549, foi diminuída quando os níveis de CLPTM1L foram reprimido pela expressão shRNA. Knockdown de CLPTM1L com shRNAs reduziu os níveis de proteína Bcl-XL em 81% e 76% em células tratado com cisplatina (p 0,003, bicaudal de Student T-Test), conforme medido por três análises ocidentais independentes (Figura 4B). Por isso, expressos de forma estável exógeno Bcl-xL em células com e sem knockdown de CLPTM1L para avaliar a função de Bcl-xL em CLPTM1L protecção da apoptose. Re-expressão de Bcl-xL foi confirmada por Western blot (Figura 4C). Enquanto knockdown de CLPTM1L aumento da apoptose em células transfectadas vector vazio por 71%, exógeno Bcl-xL eliminou a apoptose dependente CLPTM1L (Figura 4D). Resistência ao stress apoptose induzida genotóxico estreitamente corresponderam a níveis de Bcl-XL e Bcl-xL reconstituição revogada completamente sensibilização ao estresse induzido apoptose genotóxico por CLPTM1L.

A) Western Blot para os reguladores apoptóticos em células A549 com CLPTM1L knockdown após o tratamento com cisplatina mostrando diminuição da expressão Bcl-xL após a perda de CLPTM1L. borrões Bcl-XL para duas populações distintas de células clonais representativos com A549 CLPTM1L knockdown (# 1 e # 2) são mostrados. B) Representação gráfica de expressão Bcl-xL em células com CLPTM1L knockdown de três populationsA549 clonal separado. As barras de erro representam um desvio padrão da média. * – P 0,003 por Student T-Test C) Western blot confirmando expressão de exógena Bcl-xL em células A549 com CLPTM1L knockdown. D) contagens de células viáveis ​​relativas em células A549 com knockdown CLPTM1L e expressão Bcl-xL ectópica após o tratamento com cisplatina demonstrando a abolição do efeito apoptótica de perda CLPTM1L após expressão Bcl-xL ectópica.

Discussão

a sobrevivência de células que sofrem danos no DNA genómico a partir de instabilidade ou stress genotóxico leva à acumulação de alterações genéticas que caracterizam tumores humanos. Revogação de checkpoint do ciclo celular e salvaguardas apoptóticos contra a replicação do DNA danificado é uma característica marcante do câncer. O resultado da protecção contra a apoptose induzida por danos no ADN inclui tanto a vulnerabilidade a mutação somática sem controlo e diminuição da sensibilidade a radioterapia e quimioterapia. O estudo anteriormente referenciado por Zienolddinny et al. sugere que polimorfismos CLPTM1L pode afetar o acúmulo de danos ao DNA [4]. Com base nas nossas observações, é plausível que a protecção contra a apoptose por CLPTM1L contribui para a acumulação de danos do ADN, desse modo conferindo susceptibilidade a tumorigénese. Uma hipótese alternativa é que CLPTM1L desempenha um papel no reconhecimento e reparação de danos no ADN, que afecta a acumulação de tais danos. Outra é que CLPTM1L influencia diretamente a quantidade de danos no DNA em que se incorre pelos agentes genotóxicos. Nossos dados (Figura S4) sugere que a expressão CLPTM1L não afeta diretamente os níveis de danos no DNA aguda incorridos pela cisplatina ou NNK. Além disso, o presente estudo demonstra que CLPTM1L tem um papel apoptose a jusante de danos no ADN e através da regulação da expressão de Bcl-xL, o que é susceptível de afectar a acumulação de danos do ADN. A observação de acumulação diferencial de Bcl-xL após a modulação da expressão CLPTM1L, juntamente com a reconstituição de um fenótipo resistente à apoptose com expressão de exógena de Bcl-xL, fornecem evidências de que CLPTM1L actua a montante de Bcl-xL para conferir resistência ao stress genotóxico apoptose induzida. Em exógenos experiências de expressão de Bcl-xL, verifica-se que menos de Bcl-xL expressa em células contendo vector do que foi observado em experiências anteriores, embora diminuiu a acumulação nas células com CLPTM1L knockdown continua evidente. Ao mesmo tempo, morte apoptótica é ligeiramente mais robusto no vector contendo células observados em experiências anteriores, mas a tendência de aumento da sensibilidade após a perda de CLPTM1L e Bcl-xL permanece. Importante, este estudo mostra que a função anti-apoptótica de CLPTM1L não é exclusivo de sensibilidade a cisplatina, mas é uma inibição geral da via mitocondrial da apoptose.

superexpressão Comum de CLPTM1L em tumores suporta a noção de um oncogênico ou tumor promoção do papel para CLPTM1L em cancros do pulmão. estudos de expressão de proteína realizada e anotado pelo projeto Atlas proteína humana [24] confirmar nossos achados. A imuno-histoquímica em células alveolares e os tumores de pulmão humano normal demonstrou expressão negativa de CLPTM1L em tecidos normais, enquanto que a expressão em 12 tumores de pulmão em média uma pontuação de 1,91 numa escala de 0-3 (Figura S5). Uma pontuação de 0 é negativo, 1 é “fraco”, 2 é “moderado” e 3 é “forte”. Seis destes pacientes foram diagnosticados com carcinoma de células escamosas e seis foram diagnosticados com adenocarcinoma. Não foi observada diferença significativa na expressão entre as duas patologias. Um total de 66 tecidos normais a partir de vários órgãos teve uma média de 0,98 (fraco). Nenhum dos tumores de pulmão testadas foram negativas. Lung linhas de células tumorais A549 (NSCLC) e SCLC-21H (pequenas células) mostraram forte coloração e coloração moderada, respectivamente.

dados de microarranjos de tumor e linhas celulares imortalizadas demonstra que não sejam cópia resultado ganho número de mecanismos em aumento expressão num subconjunto de tumores. Em genoma associações de largura, as contas do locus 5 p15.33 para a maior contribuição para o risco de câncer de pulmão de três loci conhecidos em seres humanos [6]. O locus de 5 p está também implicado no carcinoma de células escamosas cutâneas e melanoma [25], do cancro do ovário [26], o cancro das células germinativas testiculares [27] e o cancro cervical por ganho de número de cópias [8]. No estudo do cancro do colo do útero, CLPTM1L surgiu a partir da 5 p lócus como tendo padrões de expressão que se correlacionaram com aumento de número de cópias. Outro estudo recente de número e de expressão de cópia mudanças em linhas celulares de cancro do colo do útero revelou que com o número de cópias do ganho através 5 p, expressão CLPTM1L aumentou aproximadamente 5 vezes mais células epiteliais cervicais normais, enquanto expressão de outros genes em 5 p15.33 não era alterada [9]. O gene TERT também está dentro desta região genética. Na análise de SNPs na região de 5 p, verificou-se que o cancro do pulmão de SNPs associados não estão associados com o comprimento dos telómeros (dados não mostrados), de acordo com dois outros estudos [28], [29]. Em contraste, um estudo realizado por Rafnar et ai. mostrou uma associação (

p

= 0,017 e 0,027, respectivamente) entre 5 variantes p (rs401681 e rs2736098) e comprimento dos telômeros, embora este efeito só foi observado quando as mulheres com mais de 75 anos com genótipos homozigotos foram incluídos [30 ]. Para o nosso conhecimento, não houve mutações de codificação comuns em qualquer CLPTM1L ou TERT foram identificados. É plausível que tanto TERT e CLPTM1L contribuir para a susceptibilidade neste locus, tendo um efeito co-fundador. Um estudo recente [5] fornece múltiplas linhas de evidência que a associação do cancro do pulmão de rs31489 no gene CLPTM1L é uma observação independente da associação de rs2376100 no gene TERT. O estudo mais recente genotipagem densa de 5 p15.33 encontradas várias associações na 5p15.33, com a região de associação a ser centrado sobre CLPTM1L [7]. Nossa análise anterior mostra que rs31489 é a variante mais fortemente associada com o câncer de pulmão familiar neste locus. O presente estudo indica que CLPTM1L também desempenha um papel funcional importante em relação ao cancro, e que este gene pode ser pelo menos parcialmente responsável pela associação de variantes na região de 5p15.33 com cancro do pulmão. Continuou esforços para definir ainda mais a variação genética de condução suscetibilidade ao câncer de pulmão nesta região genética são um passo importante na avaliação da relação de CLPTM1L e de outros genes na região com a susceptibilidade do tumor de pulmão.

superexpressão Comum de CLPTM1L no pulmão tumores e um papel funcional na estresse induzido apoptose genotóxico identificar CLPTM1L como um fator importante que influencia a sobrevivência do DNA danificado células tumorais e potencialmente suscetibilidade ao câncer de pulmão. Segmentação CLPTM1L, bem como a Bcl-xL, pode revelar-se úteis para abordagens quimioprevenção e terapia de cancro do pulmão. Segmentação estas proteínas anti-apoptóticos também pode ter potencial para sensibilização dos tumores para quimioterapias e radioterapias tradicionais.

Materiais e Métodos

PCR

Paciente Real-Time RT-quantitativa combinado tumor e amostras de RNA normais tumorais adjacentes foram obtidos a partir do núcleo de recolha de tecidos na Universidade de Washington em St. Louis sob o protocolo aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Washington em St. Louis School of Medicine, Office Protection Research Humano. consentimento por escrito foi obtido de todos os pacientes que participaram neste banco de tecidos. Isolou-se ARN a partir de linhas celulares utilizando reagente Tri-zol e protocolos (Invitrogen, Carlsbad, CA). Quantitative PCR em tempo real (qPCR) foi realizada utilizando o método tal como descrito anteriormente (Chaparro, Wen et al., 2005). Em resumo, um micrograma de RNA total por amostra foi convertido em ADNc utilizando o sistema SuperScript First-Strand Synthesis para RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA). ensaio de RT-PCR quantitativo foi realizado utilizando o SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Um microlitro de ADNc foi adicionado a uma mistura de 25 mL de volume total de reacção contendo água, mistura de SYBR Verde PCR Master, e iniciadores. Cada ensaio em tempo real foi feito em duplicado em uma máquina MyIQ BioRad. Os dados foram recolhidos e analisados ​​com o software Stratagene MX3000. O

gene β-actina (ACTB) foi usada como um controlo interno para calcular o nível de expressão relativa (ôc

T) de cada amostra. eficiência conjunto de primers e linearidade foi calculado, e normalização foi realizada em conformidade com as orientações MIQE. A mudança de dobragem da expressão do gene em tecidos de tumor, em comparação com os tecidos normais emparelhadas foi calculada como 2

d, em que d = ôc

T

Normal -. Ôc

T tumor

Análise de Microarray

microarrays de expressão foram realizadas utilizando o Illumina HumanWG-6 V3 plataforma, que contém 48.800 sondas correspondentes a 20.700 genes únicos. ARN (500 ng) foram marcados e hibridados com as matrizes BeadChip como especificado pelo fabricante (www.illumina.com). dados de matriz foram pré-processados ​​com o algoritmo MBCB (Ding, LH et al, Nucl Acids Research, 2008, 36:. E58). e expressão diferencial foi determinada calculando a mudança vezes e teste T

Cultura de Células, As células A549 e a sobre-expressão de knockdown

(ATCC, Manassas, VA), recentemente autenticado por Genética laboratores, Inc. (Cinncinati, OH), foram cultivadas em meio RPMI-1640 mais 10% de FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA) . As células foram transduzidas com vectores lentivirais ARN curto-hairpin (shRNA) com base no vector pLKO.1 e concebidos para direccionar especificamente transcrito CLPTM1L humana (Sigma, St. Louis). vector vazio ou vector derrubar CLPTM1L transcrição foram embalados primeiro em células 293T (Orbigen, San Diego, CA) com plasmídeos auxiliares e então transduzido para as células A549 com 8 ug /ml de polibreno (Sigma, St. Louis, MO). Os meios foram substituídos 24 horas após a transdução, e as células foram divididas 1:4 48 horas após a transdução. Às 72 horas pós transdução, as células que albergam construções lentivirais foram seleccionados com 1 ug /ml de puromicina para 2-4 dias, até que as células infectadas simuladas foram mortos. As células sobreviventes foram reunidas

pBABEpuro vector de expressão ou pBABEpuro:. CLPTM1L, clonado por PCR a partir pOTB7-CLPTM1L, (Thermo Scientific), nos locais EcoRI /SalI de pBABE-puro, foi transfectado para células H1299. As células transfectadas foram seleccionadas com puromicina até que as células transfectadas em falso foram mortos.

pSSFV vector Bcl-xL expressão (plasmídeo Addgene 8749) ou vector vazio foi transfectado em células com e sem knockdown de CLPTM1L como descrito acima. As células transfectadas foram seleccionadas com geneticina (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Viabilidade Ensaio

As células que expressam de forma estável vectores de shRNA como descrito acima, foram semeadas em pratos de 12 poços de cultura de tecidos em densidades iguais de aproximadamente 50% em triplicado. Após fixação durante a noite, seguido por 48 horas de tratamento com as concentrações indicadas de cisplatina (Sigma, St. Louis, MO) dissolvidos em Media, camptotecina (Sigma, St. Louis. MO) dissolvidos em DMSO (Sigma, St. Louis, MO) ou DMSO veículo sozinho. As concentrações de DMSO em meio de cultura foram mantidos consistentes e foram a ou abaixo de 0,08%. As células foram ensaiadas quanto ao número de células viáveis ​​por coloração com azul de tripano e contadas num contador de células-condessa automatizado (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para os ensaios de camptotecina, a viabilidade celular foi medida por Cell Titer 96 Aqueous One Solution Ensaio de Proliferação celular (MTS) em 24 placas de cultura de tecido de poços em triplicado. Os valores P foram determinados pelo teste t de Student de uma cauda.

Citometria de Fluxo

As linhas celulares indicadas foram tratadas durante 24 horas com as concentrações indicadas de cisplatina em 10 cm placas de cultura de tecido. 10

6 as células foram lavadas e suspensas em PBS e coradas com anexina V-FITC. As células em solução de coloração foram diluídas com 500 mL PBS e analisadas em um citômetro de fluxo Coulter.

Caspase 3/7 Ensaio

As linhas celulares indicadas foram semeadas em densidades de 5 × 10

4 culas por po de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços e tratadas como indicado com agentes genotóxicos após a fixação durante a noite. Caspase 3 e 7 de actividade foi medida usando SensoLyte® homogênea Rh110 Caspase – 3/7 Assay Kit (Anaspec, Fremont, CA):

Western Blotting

As linhas celulares indicadas foram tratados com cisplatina na. as concentrações indicadas em placas de 6 poços por 72 horas. As células foram lisadas com 100 ul de inibidores de proteinase de tampão de lise 1X NP40 contendo, tosquiada 10 vezes com uma agulha de calibre 28, centrifugou-se a 16000 × g durante 30 minutos, normalizados pela concentração de proteína, tal como determinado pelo método de Bradford, e o sobrenadante foi fervida durante 10 min. 20 ul de lisado foi normalizada resolvidas por SDS-PAGE e immunoblotting analisadas com anticorpos indicados. Foram utilizados os seguintes anticorpos: anti-coelho CLPTM1L (Sigma, St. Louis, MO), de coelho anti-beta-tubulina (Sigma, St. Louis, MO), de ratinho anti-Bcl-2 do clone 124 (Dako, Carpinteria, CA), de coelho anti-Bax # 2774 (Cell Signaling, Boston, MA), de ratinho anti-p53 (Ab-1) (Oncogene, San Diego, CA), Bcl-xL – Bcl2L1 de coelho (Abcam, Cambridge, MA). Quantificação de análises ocidentais de três culturas independentes foi feito usando software J Imagem disponível online a partir de NIH no https://rsbweb.nih.gov. Os valores P determinado pelo aluno de uma cauda T-Test.

Ensaio Cometa

O método baseado eletroforese em gel para a detecção de danos no DNA foi realizado foi modificado a partir de Olive, et al.

Nature Protocols

1, 23-29 (2006). As células foram tratadas com as concentrações indicadas de NNK, cisplatina ou DMSO solvente a 0,1% durante 24 horas. lâminas de microscópio foram pré-revestidas com agarose de baixo ponto de fusão (Sigma, St. Louis, MO), 1% em dH2O e secou-se. Um mL de agarose de baixo ponto de fusão a 1% em dH2O mantida a 40 ° C foi adicionado a 0,4 mL de uma suspensão de 2 × 10

4 células /mL em meio frio. A mistura de agarose /células (1 mL /slides) foi espalhada nos slides pré-revestidas.