Abstract

A família NEDD4 de ligases de ubiquitina E3 inclui nove membros. Cada uma delas é uma proteína modular, contendo um domínio C2 N-terminal para a localização de células, WW domínios de duas a quatro centrais para o reconhecimento de substrato, e, um domínio catalítico HECT C-terminal, que é responsável por catalisar a reacção de ubiquitinação. Os membros desta família são conhecidos por afectar vias centrais para a patogénese de cancro colo-rectal, incluindo Wnt, TGFp, EGFR, e as vias de p53. Recentemente,

NEDD4

mRNA foi relatado para ser sobre-expressos em câncer colorretal, mas o estágio do tumor não foi considerado na análise. Expressão dos outros membros da família não foi estudado em cancro colo-rectal. Aqui, nós determinamos os padrões de todos os nove membros da família NEDD4 em 256 pacientes que apresentavam doenças que vão desde adenoma pré-maligna de câncer em estágio IV colorectal expressão.

NEDD4

mRNA aumentou significativamente em todas as fases do cancro colorectal. Em contraste,

NEDD4L

mRNA, o homólogo mais próximo de

NEDD4

, foi o membro da família mais altamente reprimidos, e foi significativamente regulada negativamente em todos os estágios tumorais. Encontramos também proteínas NEDD4L foi significativamente diminuído por western blot em amostras de câncer colorretal em comparação com mucosa normal adjacente. Além disso, NEDD4L, mas não NEDD4L cataliticamente inactivo, WNT canónica inibida sinalização igual ou inferior ao nível de β-catenina

In vitro

. Estes achados sugerem que NEDD4L pode desempenhar um papel supressor de tumor no cancro colorectal, possivelmente através da inibição da sinalização de Wnt canônica

Citation:. Tanksley JP, Chen X, Coffey RJ (2013) NEDD4L é regulada negativamente em Câncer e inibe Colorectal Canonical sinalização Wnt. PLoS ONE 8 (11): e81514. doi: 10.1371 /journal.pone.0081514

editor: Chunming Liu, da Universidade de Kentucky, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de julho de 2013; Aceito: 23 de outubro de 2013; Publicação: 28 de novembro de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Jarred Tanksley foi apoiada por NCIP5095103, RO1CA46413 e GM007347. Xi Chen foi apoiada por RO1CA158472. Robert J. Coffey foi apoiada por NCIP5095103 e RO1CA46413. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais comum nos Estados Unidos pela incidência, e perdendo apenas para o câncer de pulmão na mortalidade, causando cerca de 50.000 mortes por ano [1]. O processo de desenvolvimento de neoplasias no CRC esporádica normalmente começa com uma mutação de inactivação no

polipose adenomatosa coli (APC)

gene que resulta na activação aberrante da via de sinalização WNT canônica [2]. Nos restantes casos, existe muitas vezes uma mutação no

CTNNB1, que codifica β-catenina [3]. O resultado de cada uma destas mutações é a diminuição ou a perda da capacidade de uma célula para orientar devidamente citoplasmática β-catenina ao multi-proteína E3 ligase de ubiquitina, que contêm repetição proteína beta-transducina (β-TRCP), que poli-ubiquitylates β -catenina, e tem como alvo para o proteassoma para degradação [4]. Em vez disso, β-catenina acumula-se no núcleo, e os seus parceiros com o factor /ABL transcrição TCF para conduzir um programa de transcrição que, finalmente, resulta na neoplasia. Neste cenário, é a incapacidade da célula para controlar os níveis de β-catenina através da degradação mediada por ubiqitin que promove a tumorigénese. No entanto, o processo de ubiquitinação como um todo é pensado para ser regulada positivamente em cancro, o que levou à utilização de inibidores de proteassoma no tratamento CRC [5].

ubiquitinação é um processo sequencial, de três passos envolvendo um E1, E2, E3 e ligase de ubiquitina que resulta na ligação covalente de ubiquitina (s), uma proteína de 76 amino ácidos, a um resíduo (s) de uma proteína Lys ou substrato-alvo. É fundamental para a homeostase celular, principalmente, visando proteínas para o proteassoma ou lisossoma para a degradação através da fixação de cadeias de ubiquitina (poli-ubiquitinação). No entanto, ubiquitinação, também tem sido demonstrado que desempenham papéis importantes no tráfico, localização e actividade das proteínas, especialmente quando há a adição de apenas uma porção ubiquityl, denominados mono-ubiquitinação [6]. especificidade alvo é fornecida principalmente pelo E3 ligases, que catalisam a etapa final do anexo ubiquitina. No genoma humano, há mais de 600 E3 ligases, contra cerca de 30 E2s e duas E1s. Um dado E3 pode ter muitos objetivos, e podem ativar ou inibir várias vias de sinalização celular [7]. Existem duas grandes famílias de E3s:. O novo gene (ANEL) família realmente interessante, que compreende 95% de todas as E3s, ea homóloga à família E6-AP terminal carboxilo (HECT), compreendendo os restantes 5% [8]

A família NEDD4 de HECT do tipo E3s inclui nove membros [9]. Cada membro é uma proteína modular, com um domínio N-terminal C2, os domínios de duas a quatro centrais WW, e, um domínio catalítico HECT C-terminal. Os domínios WW são responsáveis ​​pela selecção do alvo, e interagir com um motivo de quatro amino ácido (motivo PY, PPXY) na proteína alvo, enquanto que os auxiliares de domínio C2 na localização celular adequada. O domínio HECT é responsável pelo recrutamento de E2, que serve como um transportador para a ubiquitina e directamente conjuga ubiquitina ao resíduo Lis-alvo, um processo que requer um local activo resíduo de Cys. O membro fundador desta família, NEDD4, foi recentemente mostrado ser regulada para cima no CRC, e para promover a proliferação de células de CRC

in vitro

, embora o mecanismo permanece pouco claro [10]. Além desse estudo, nada se sabe sobre os padrões da família NEDD4 na CRC de expressão. É de notar, muitos dos membros da família NEDD4 foram encontrados para alvejar proteínas que são jogadores integrais nas vias que se pensa ser mais importante na gênese e progressão da CRC.

Neste estudo, buscou-se determinar a expressão de mRNA os níveis de cada um dos nove membros da família NEDD4 em tumores a partir de um grande grupo de indivíduos com neoplasia colorectal. Descobrimos que

NEDD4

é o membro mais altamente upregulated da família. Surpreendentemente,

NEDD4L

, que partilha a maior homologia de sequência com o

NEDD4

, era o membro mais altamente reprimidos da família no CRC. Confirmou-se a regulação negativa da NEDD4L ao nível da proteína em amostras humanas de CRC. Recentemente, foi demonstrado que NEDD4L degradar DVL2, inibindo assim a sinalização de Wnt, tal como determinado por actividade reduzida TOPFlash [11]. Nós também descobrimos que inibe a actividade NEDD4L TOPFlash igual ou inferior ao nível de β-catenina. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que NEDD4L tem o potencial para atuar como um supressor tumoral em CRC.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Todas as amostras humanos utilizados em nosso manuscrito foram recolhidos e analisados ​​de acordo com um protocolo aprovado pelo Institutional Review Boards na Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, e Moffitt Cancer Center, Tampa, FL. As amostras utilizadas nesta publicação foram descritos anteriormente [12], [13]. Os dados obtidos foram analisados ​​de forma anónima.

amostra de tecido humano microarrays análise

Um total de 250 amostras de tecido CRC humanos foram coletadas em VUMC (N = 55) e MCC (N = 195). Destas amostras de CRC, 33 eram Fase I (13,2%), 76 Estágio II (30,4%), 82 Estágio II (32,8%) e 59 Stage IV (23,6%). tecido normal adjacente foi recolhido a partir de MCC dez desses pacientes. Destes, dois foram coletadas de Fase I, cinco da Fase II, e três do III pacientes Stage. Uma seis adenomas adicionais foram coletadas no MCC. As amostras utilizadas nesta publicação foram descritos anteriormente [12], [13]. ARN a partir destes tecidos foi obtido e hibridado com a Affymetrix Human Genome U133 mais 2,0 GeneChip expressão de matriz. Foram analisados ​​os seguintes sondas:

NEDD4

(213012_at),

NEDD4L

(237498_at, 241396_at, 212445_s_at, 212448_at),

WWP1

(212637_s_at, 212638_s_at),

WWP2

(1552737_s_at, 1554580_a_at, 204022_at, 210200_at),

ITCH

(209743_s_at, 209744_x_at, 217094_s_at, 235057_at, 239101_at),

SMURF1

(1559426_at, 212666_at, 212668_at, 215458_s_at, 232665_x_at ),

Smurf2

(205596_s_at, 227489_at, 232020_at),

NEDL1

(210331_at, 215584_at), e

NEDL2

(232080_at, 243080_at). Dos quatro sondas específicas para

NEDD4L

, que foca nossa atenção para 212445_s_at, uma vez que codifica uma porção da proteína traduzida. Três das quatro sondas NEDD4L foram significativamente regulada negativamente de forma semelhante, enquanto um (237498_at) permaneceu inalterada com a progressão.

Os pacientes do grupo VUMC teve um acompanhamento médio de 50,2 meses, com acompanhamento mínimo -se de 0,4 meses e um máximo de 111,3 meses. Aqueles no grupo MCC teve um acompanhamento médio de 44,7 meses, com um mínimo de 0,92 e um máximo de 142,8 meses. Todas estas amostras foram coletadas e analisadas de acordo com um protocolo aprovado pelos Conselhos de Revisão Institucional, tanto VUMC e MCC.

Western blot análise

CRC tecidos e amostras da mucosa do cólon normais adjacentes foram coletados a partir de 20 indivíduos em ressecção cirúrgica no VUMC e congelados em nitrogênio líquido. As amostras foram então lisadas em ureia 8 M, sonicado, e centrifugou-se a 14.000 rpm. O sobrenadante foi removido, e a proteína quantificado medindo a absorvância a 280 nm. As amostras foram depois corrido num gel de poliacrilamida a 7,5% e transferido para membranas de nitrocelulose. As membranas foram colocados a hibridar com anticorpos anti-NEDD4L (1:2000) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) e anti-α-tubulina (1:2000) (tuba) (Calbiochem, San Diego, CA), e detectados utilizando HRP apropriados anticorpos secundários -conjugated eo método de quimiluminescência. As intensidades das manchas foram então quantificadas utilizando o software ImageJ, e analisados.

TOPFlash ensaio

As transfecções foram realizadas utilizando Metafectene (Biontex, San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante. células HEK293 (2 × 10

5) foram plaqueadas numa placa de 12 poços, deixadas a ligar, e transfectadas no dia seguinte com 0,1 ug de cada plasmídeo. Foram utilizados os plasmídeos seguintes: TOPFlash plasmídeo repórter, FOPFlash plasmídeo repórter, pcDNA3.1, NEDD4L (KIAA0439) (Addgene plasmídeo 27000), e NEDD4L (C A) (Addgene plasmídeo 27001) [14]. Construções contendo o tipo selvagem (wt) β-catenina e mutante β-catenina (ΔN89) eram um presente de Ethan Lee da Universidade de Vanderbilt. No dia após a transfecção, o meio foi removido, e meio isento de soro contendo 20 ng /ml e 100 ml Wnt3a R-espondina /ng (Vanderbilt anticorpo e proteína de Recursos Partilhados) foi adicionado. No dia seguinte, as células foram lisadas e processadas de acordo com o kit de ensaio de luciferase (Promega, Fitchburg, WI). TOPFlash atividade foi normalizada para a actividade FOPFlash, e dobre-ativação foi determinada através da normalização da actividade TOPFlash e FOPFlash em células não estimuladas. Todos os experimentos foram realizados em triplicado, pelo menos, três vezes.

NEDD4L knock-down

plasmídeos lentivirais contendo shRNA (Open Biosystems, Huntsville, AL) contra humana

NEDD4L

foram transfectadas em células HEK293 utilizando Metafectene. No dia seguinte, foi adicionado meio fresco. No dia seguinte, o meio foi filtrada (filtros de 0,45 um). Para infectar DLD-1 e células RKO, 2,0 × 10

5 células foram semeadas em cada poço de uma placa de 6 poços, e infectadas com o lentivírus. Após dois dias, observou-se expressão da GFP, e as células infectadas foram seleccionadas com puromicina (5 ug /ml) e classificadas para expressão da GFP. Eficiência de knock-down foi determinada por western blot NEDD4L.

A análise estatística

Para comparar o nível de cada sonda entre normal, adenoma expressão, e as amostras de tecido de câncer, o teste de Wilcoxon foi utilizado [12], [13]. Para determinar os níveis de proteína relativos, os níveis de proteína NEDD4L foram normalizados para níveis tuba, log-transformada, e comparados usando um teste t pareado. Análise de sobrevivência de Kaplan-Meier foi realizada no conjunto de dados de microarray, a fim de determinar a sobrevivência de doenças específicas. sobrevida específica da doença foi definida como uma morte relacionada ao câncer documentado [12]. Os níveis de significância na experiência de ensaio de repórter TOPFlash foram determinados utilizando o teste t de Student.

Resultados

Os níveis de expressão dos membros da família NEDD4 em CRC

Os nove membros do NEDD4 família de ubiquitina ligases E3 são proteínas modulares (Figura 1). Como um todo, a família NEDD4 é conhecido por estar envolvido na regulação de um número de proteínas e percursos que são centrais para o desenvolvimento de CRC. A Tabela 1 é uma compilação de substratos conhecidos, as vias de sinalização afetadas, e os níveis de expressão em vários tipos de câncer de todos os membros da família NEDD4. Há alta homologia de sequência entre os membros da família, o que explica as metas compartilhadas de muitos dos membros da família. No entanto, existem também exemplos de diferentes membros da família que têm efeitos opostos sobre a mesma via de sinalização. Por exemplo, NEDD4 faz com que a regulação negativa da Smad1 e CBL, que inibe a sinalização de proteína morfogenética óssea (BMP) e activa o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) de sinalização, respectivamente [15], [16]. Por outro lado, os impactos NEDD4L factor de crescimento transformante-β (TGF-p) de sinalização, mas não a sinalização de BMP, através da degradação da SMAD 2 e 3 e do receptor de tipo I TGFp, e anula EGFR sinalização através da degradação mediada por ubiquitina do CDC42 activada cinase 1 (ACK1) [14], [17], [18]. Além disso, NEDD4 foi mostrado para regular negativamente o supressor tumoral PTEN [19]. No entanto, NEDD4 foi mostrado para promover a proliferação de células CRC

in vitro

, independente de um efeito sobre os níveis de PTEN [10].

Os nove membros da família NEDD4 são proteínas modulares. Na sua extremidade N-terminal, cada um tem um domínio C2, que desempenha um papel na localização celular adequada. A porção central de cada proteína contém domínios de duas a quatro WW, que são responsáveis ​​pelo reconhecimento do alvo. WW domínios são 20-23 aminoácidos, motivos baseados-Trp que reconhecem motivos PY (PPXY, LPXY), bem como alguns fosfo-Ser- ou motivos baseados em fosfo-Thr. No terminal-C é o domínio HECT, que conjuga directamente uma porção ubiquityl à proteína alvo. Os membros da família são agrupados por nome e homologia. Coceira é mais estreitamente homólogas a WWP1 e 2 do que para outros membros da família.

A fim de determinar um papel potencial para a família NEDD4 na iniciação ou progressão da CRC, nós submetido 250 CRC amostras de pacientes tumorais de fases diferentes, seis amostras de adenoma, e 10 amostras normais adjacentes para análise de microarray, observando como a expressão de cada membro da família mudou com progressão (Figura 2A). Curiosamente, o par de perto homólogo de

NEDD4

e

NEDD4L

eram opostas regulado (Figura 2B, C).

NEDD4

(213012_at) tenderam para cima na fase adenoma, mas foi significativamente elevado na fase 1 CRC e permaneceu significativamente elevado durante a progressão do tumor. Por outro lado,

NEDD4L

(212445_s_at) expressão diminuída, tendendo para baixo em adenomas, e diminuiu significativamente em todas as fases do CRC (Figura 2C).

(A) A expressão de todos os nove família NEDD4 membros foi examinada em CRC pelo perfil de microarray. É mostrado aqui a dobra-variação média de todas as sondas para cada gene individual no Nl (N = 10), DA (n = 6), Ca1 (N = 33), Ca2 (N = 76), Ca3 (N = 82) , e CA4 (N = 59). (B)

NEDD4

(213012_at) é o membro mais altamente regulada da família NEDD4 no CRC. (C)

NEDD4L

(212445_s_at) é o membro mais altamente reprimidos da família NEDD4 no CRC. Nl = normal, Ad = adenoma, e Ca1-4 = CRC, fase I-IV. * P . 0,05

proteína NEDD4L é diminuído em CRC

Como os níveis de transcrição de um gene em particular nem sempre se correlacionam com níveis de proteína, o próximo determinar se a diminuição da

NEDD4L

níveis de mRNA resultou numa diminuição da proteína NEDD4L. Para isso, foi realizada a análise western blot na CRC humana e amostras de tecidos normais adjacentes a partir de 20 pacientes em uso de tecidos recolhidos no Vanderbilt University Medical Center (Figura 3A, B). Observou-se uma diminuição significativa nos níveis de proteína NEDD4L (~42%) em CRC humano em comparação com o tecido normal, um resultado consistente com a análise de micro-arranjo.

os níveis de (A) NEDD4L foram determinados por Western blotting de CRC (Ca ) e) mucosa normal adjacente (Nl de vinte indivíduos. Níveis foram normalizados para tuba e Nl foi comparado com Ca. NEDD4L foi significativamente regulada negativamente (~42%) em CRC (* p 0,05). Os dados são representados em formato gráfico de caixa e bigode. As linhas que ligam os pontos de dados mostram os níveis NEDD4L relativas em um determinado NL-Ca par combinado. denota vermelhas diminuição dos níveis NEDD4L em Ca, enquanto o preto indica um aumento. (B) Os lisados ​​gerada a partir de NL-Ca pares combinados foram transferidas para NEDD4L e TUBA. Mostrado aqui estão quatro pares representativos.

A seguir, procuraram determinar se os níveis de expressão NEDD4L correlacionam com a sobrevivência específica da doença em nosso grupo de pacientes. Nós comparamos a sobrevida dos pacientes no quartil mais elevado de expressão NEDD4L com que aqueles no quartil mais baixo (Figura 4). Descobrimos que os pacientes com a mais alta expressão NEDD4L exibiu um longo período de sobrevida específica da doença do que aqueles pacientes com os níveis mais baixos de expressão. Essa diferença, no entanto, não atingiu significância estatística (p = 0,079).

sobrevivência específica da doença em pacientes com CCR com a expressão mais alta e mais baixa NEDD4L foi comparada usando análise de Kaplan-Meier. Os pacientes com amostras de tumores no quartil mais elevado de expressão NEDD4L mostrou tendência a uma sobrevida específica da doença mais longo de um período de 60 meses. p = 0,079.

NEDD4L suprime WNT canônica sinalização

A diminuição significativa na expressão NEDD4L no CRC sugere a possibilidade de que NEDD4L desempenha um papel tumor-supressora na CRC. Dada a centralidade da WNT canônica de sinalização para o início e progressão da CRC, nós investigamos se NEDD4L pode suprimir a sinalização de Wnt canônico pela realização do ensaio repórter TOPFlash, que mede a atividade WNT canônica fundindo LEF elementos TCF /resposta a um repórter da luciferase do pirilampo. NEDD4L inibiu a actividade de sinalização de Wnt TOPFlash quando canónica foi activada através da adição de Wnt3a e o coactivador, R-espondina (Figura 5A). A inibição parece ser dependente da capacidade de NEDD4L para ubiquitylate proteínas alvo, tal como a forma cataliticamente inactiva de NEDD4L, em que o local activo cisteína foi mutada para uma Ala [NEDD4L (C A)] mostrou qualquer inibição da actividade TOPFlash ( Figura 5A) [20]. Estes resultados suportam a recente descoberta de que NEDD4L inibe a sinalização WNT por ubiquitylating e direcionamento DVL2 ao proteassoma para degradação [11]. No entanto, também descobrimos que NEDD4L inibiu a sinalização de Wnt canónica quando em peso ou mutante (ΔN89) β-catenina foi utilizado como um activador (Figura 5B), sugerindo NEDD4L suprime a sinalização de Wnt jusante de DVL na presença de APC mutante ou CTNNB1.

(a) NEDD4L TOPFlash inibe a actividade em células HEK293 em comparação com o vector vazio (CTL) ou cataliticamente inactiva NEDD4L [NEDD4L (C a)]. Wnt3a (20 ng /ml) e R-espondina (100 ng /ml) foram usadas para activar a sinalização de Wnt canónica. (B) Quando duas construções β-catenina diferentes, β-catenina (WT) e β-catenina (ΔN89), são utilizados para activar WNT canónica sinalizando uma redução significativa na actividade TOPFlash foi observada na presença de NEDD4L sobreexpressão, em comparação com vector vazio ou NEDD4L (C A). Todos os resultados são normalizados para a atividade FOPFlash. * P . 0,05

Para estender este trabalho, nós examinamos os efeitos de crescimento de derrubar NEDD4L endógeno em duas linhas de células CRC humanos, DLD-1 e RKO. células DLD-1 contêm uma mutação truncando no

APC

, enquanto as células RKO não têm nem uma mutação no

APC

nem

CTNNB1

, mas não têm uma mutação de inactivação em

NKD1

, um regulador negativo inducible de sinalização Wnt [21]. Knock-down foi verificada por transferência de western (~ 80%) (dados não mostrados). Nós medimos o crescimento em plástico, e em agar macio e colágeno. Foi observado não haver diferenças significativas no crescimento em células com NEDD4L knock-down comparação com os controlos mexidos (dados não mostrados). Além disso, NEDD4L knock-down não teve efeito sobre o tamanho do tumor em xenoenxertos de ratinho nu (dados não mostrados).

Discussão

O presente estudo foi realizado para começar a entender se existe um papel para o membros da família NEDD4 de ubiquitina ligases E3 em CRC. Nove membros desta família compreendem, cada um e tem sido demonstrado que um impacto, pelo menos, uma das vias celulares centrais para a iniciação e progressão de CRC. Vários membros têm sido mostrados para ser desreguladas em um número de diferentes tipos de cancro. No entanto, não tenha sido previamente realizada uma avaliação sistemática dos níveis de todos os membros da família no CRC humana de expressão. Notavelmente,

NEDD4

expressão de mRNA foi recentemente mostrado a ser regulada no CRC, mas esta análise não considerar o estágio de CRC, ou incluem adenomas [10]. Sentimos que o primeiro passo para começar a entender esta família de E3s em CRC foi examinar os níveis de expressão de cada membro da família em CRCs a partir de uma grande coorte de pacientes. Optamos por realizar nossa análise em todas as fases, incluindo adenomas, pois há normalmente alterações nas vias semelhantes em pontos semelhantes durante a progressão CRC [2]. Alguns destes percursos têm diferentes funções em diferentes fases. Por exemplo, a via de TGF é um supressor tumoral no início de CRC, mas promove a progressão e metástase mais tarde [22].

Aqui, nós avaliamos como a expressão de cada NEDD4 mudanças membro da família com a progressão de adenoma para Estágio IV CRC. O membro da família mais bem regulada era

NEDD4

, de acordo com as conclusões acima referidas [10]. Em seguida, iremos demonstrar que a sobre-regulação ocorre no início de CRC (fase I), e regulação positiva é mantida durante a progressão. O membro da família o mais altamente regulados negativamente em nosso conjunto de dados foi

NEDD4L

. Encontrámos esta surpreendente, dado que NEDD4L compartilha a maior homologia de sequência com NEDD4, e foi demonstrado ter uma sobreposição significativa com NEDD4 na selecção alvo [7]. Recentemente, os níveis de proteína NEDD4L foram mostrados a ser reprimidos no câncer gástrico, e aqueles pacientes com o menor expressão por análise de imuno-histoquímica teve um pior prognóstico [23]. NEDD4L também foi encontrada para ser tanto regulada positivamente regulada negativamente e no cancro da próstata, o aumento em células cancerosas invasivas da vesícula biliar, e regulados negativamente em gliomas malignos mais agressivos [24] – [27]. Estes achados não são inesperadas dado o número de alvos e vias de sinalização celular sobre a qual NEDD4L foi encontrado para agir.

Um relatório recente mostrou que NEDD4L inibe ambas as WNT vias de sinalização canônicos e não canônicos por ubiquitylating DVL2 e alvejando-o para o proteassoma para a destruição [11]. Aqui, nós descobrimos que NEDD4L também podem inibir a sinalização de Wnt canónica ao nível de, ou a jusante de, β-catenina. Isto está em contraste com o papel acima mencionado, em que os investigadores mostraram que NEDD4L não poderia inibir TOPFlash Quando a sinalização foi activado por um mutante β-catenina (S37A). Em seu estudo, foi utilizado isoforma 2 de NEDD4L (NM_001144964.1), enquanto que nós usamos uma isoforma NEDD4L diferente (KIAA00439). Estes dois ADNc diferem na sua extremidade N-terminal; a construção utilizada no nosso estudo tem um 141 resíduos de aminoácidos adicionais no terminal N imediato, o que modifica o domínio C2, e 20 em menos resíduos de um segmento que precedem o segundo domínio WW. Isso pode contribuir para diferenciais localização ou substrato alvo. Além disso, diferentes construções β-catenina foram testados; que usamos em peso e mutante β-catenina (ΔN89), e, no relatório anterior, foi utilizado β-catenina (S37A).

Nós descobrimos que derrubar a expressão de endógena

NEDD4L

em duas linhas de CRC não teve nenhum efeito sobre o crescimento. Isto pode ser devido ao facto de estas linhas celulares já desenvolveram um mecanismo para superar os efeitos inibidores do crescimento de NEDD4L, ou que as células já alcançado uma redução na expressão endógena NEDD4L a um nível abaixo do necessário para a inibição do crescimento. Estudos futuros irá abordar esta superexpressão peso NEDD4L em uma bateria de linhas CRC. Em última análise, pode ser necessário criar um modelo de rato em que NEDD4L é nocauteado no início do processo de desenvolvimento de neoplasias.

Em conclusão, examinamos a expressão do mRNA da família NEDD4 de ligases de ubiquitina E3 em um grande coorte de indivíduos com neoplasia colorretal. O membro mais altamente regulada positivamente é

NEDD4

, que tem sido mostrado previamente para aumentar a proliferação de células de CRC humanos

in vitro

[10]. O membro mais altamente reprimidos é

NEDD4L

. De acordo com os achados anteriores, NEDD4L superexpressão em células HEK293 inibida sinalização Wnt canônica [11]. Aqui, nós também mostram que NEDD4L inibe a sinalização de Wnt na ou a jusante da β-catenina, o que é importante no contexto da mutação de activação mais comum na via de sinalização Wnt canónica que são encontrados no CRC. Por isso, propomos que NEDD4L pode agir como um supressor tumoral em CRC inibindo a sinalização de Wnt canônico.

Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer Bruce Aronow, Dan Ayers, Tim Yeatman, e Josh Smith por sua assistência com a análise de dados, e Jim Higginbotham por sua ajuda com a classificação de fluxo. Os autores também agradecem Emily Poulin por sua assistência editorial.