Abstract
Fundo
Eletroporação, um método para aumentar a permeabilidade de membranas a iões e pequenas moléculas, é utilizado na clínica com fármacos quimioterapêuticos para o tratamento do cancro (electroquimioterapia). Eletroporação com o cálcio faz com ATP (adenosina trifosfato) exaustão e de células de câncer morte e poderia ser um tratamento de câncer romance. Este estudo visa compreender a relação entre o campo aplicado elétrica, concentração de cálcio, depleção de ATP e eficácia
Métodos
Em três linhas de células humanas -. H69 (cancro do pulmão de pequenas células), SW780 ( cancro da bexiga), e U937 (leucemia), foi determinada a viabilidade após o tratamento com cálcio 1, 3, ou 5 mM e oito de 99 microsiemens por pulsos com 0,8, 1,0, 1,2, 1,4 ou 1,6 kV /cm. A análise de montagem foi aplicado para quantificar a eficácia de matar células em presença de cálcio. Tratamento pós-intracelular de ATP foi medida em células H69 e SW780. Pós-tratamento intracelular ATP foi observada com microscopia confocal de células U937 marcadas com quinacrina.
Resultados
Ambos H69 e células SW780 mostrou dependente da dose (concentração de cálcio e campo elétrico) diminuição intracelular ATP (p 0,05) e viabilidade reduzida. A morte de células efetiva de 50% foi encontrada em 3,71 kV /cm (H69) e 3,28 kV /cm (SW780), reduzido a 1,40 e 1,15 kV /cm (respectivamente) com cálcio 1 mM (EC50 menor para maiores concentrações de cálcio). Quinacrine intensidade de fluorescência de células U937 electroporado em cálcio foi um terço menor do que nos controles (p 0,0001).
Conclusões
dose-dependente de cálcio eletroporação reduziu a sobrevivência das células e ATP intracelular. O aumento de cálcio extracelular permite o uso de um campo eléctrico mais baixo.
importância geral
Este estudo suporta o uso de electroporação de cálcio para o tratamento de cancro e, eventualmente, reduzindo o campo eléctrico aplicado em ensaios futuros.
Citation: Hansen EL, Sozer EB, Romeo S, Frandsen SK, Vernier PT, Gehl J (2015) dose-dependente ATP Exaustão e Cancer Cell Death Eletroporação seguinte cálcio, efeito relativo da concentração de cálcio e intensidade do campo elétrico. PLoS ONE 10 (4): e0122973. doi: 10.1371 /journal.pone.0122973
Editor do Academic: Boris Rubinsky, Universidade da Califórnia em Berkeley, Estados Unidos
Recebido: 29 Dezembro, 2014; Aceito: 11 de fevereiro de 2015; Publicação: 08 de abril de 2015
Direitos de autor: © 2015 Hansen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. ELH foi apoiado por uma bolsa de estudos do dinamarquês Cancer Society (R81-A5208-13-S7) e por uma subvenção da Acção COST “Rede Europeia para o Desenvolvimento da Electroporation- As tecnologias baseadas e Tratamentos “(TD1104-010414-042351). SR foi apoiado por uma bolsa da Acção COST (TD1104-040514-041263). JG foi um Real Academia Sueca de Ciências Research Fellow apoiado por uma bolsa da Acta Oncologica Foundation (2009-2014). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Os autores declaram a patente “aplicações terapêuticas de eletroporação de cálcio para induzir eficazmente necrose tumoral” (PCT /DK2012 /050496, co-inventores da SKF e JG) foi submetido. Outros autores declaram não haver conflitos de interesse. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
Eletroporação é um método usado para gerar aumento da porosidade das membranas celulares, aplicando permeabilising pulsos elétricos [1]. O método pode ser utilizado para induzir a passagem de fármacos de outra forma não-permeando [2-5] ou iões cálcio, tais como [6,7] em células através da membrana celular [8].
electroporação reversível, onde célula membranas selar após permeabilização transiente, é utilizado na clínica em combinação com fármacos quimioterapêuticos para o tratamento local de tumores malignos (Eletroquimioterapia) [9-11]. Substituindo cálcio para agentes quimioterápicos neste procedimento (eletroporação de cálcio) poderia ser um romance, o tratamento eficiente e barato câncer [6].
É de grande interesse clínico para explorar a possibilidade de minimizar a magnitude do campo eléctrico durante o tratamento , tanto na prevenção de contrações musculares e no desenvolvimento de eletrodos que podem tratar tumores profundas. Expondo as células para dividir a dose electroporação foi mostrada para aumentar a sensibilidade das células para electroquimioterapia, um fenómeno chamado electrosensitation [12]. Nosso estudo tem como objetivo investigar um possível aumento da sensibilidade também para o tratamento eletroporação irreversível quando se aumenta o cálcio extracelular. eletroporação irreversível (IRE) [13] é uma outra terapia baseada eletroporação, onde campos elétricos fortes são utilizados para matar as células cancerosas através de permeabilização da membrana irreversível. Aumentando eléctrodo intervalo terapêutico, reduzindo o campo eléctrico é uma preocupação especial na IRE, bem como outras terapias de electroporação com base [14]. Para IRE, adição de cálcio pode aumentar o raio e eficácia do tratamento.
O cálcio é um segundo mensageiro ubiquitous envolvida em inúmeros processos celulares, incluindo necrose controlada (necroptosis) [15-18]. O gradiente de concentração de cálcio através da membrana celular é fortemente regulada, a fim de manter a homeostase celular. Em células normais, a concentração intracelular de cálcio ionizado é mantida a cerca de 100 nM, substancialmente mais baixo do que a concentração extracelular, que, tipicamente, superior a 1 mm [16,19]. O gradiente é mantida por meio de bombas de membrana numerosos, tais como Ca
2 + -ATPases, que consomem ATP (trifosfato de adenosina) para que a energia seja expelir o excesso de cálcio a partir da célula ou transferi-lo para compartimentos celulares, tais como o retículo endoplasmático ou mitocôndrias [20-22].
Temos demonstrado anteriormente que os níveis de ATP celular cair seguintes eletroporação de cálcio [6]. Quando um aumento dramático no cálcio intracelular ocorre, potencialmente por electroporação de cálcio, um aumento da actividade de Ca
2 + -ATPases apressadamente consome celular de ATP [19]. Um aumento no cálcio também afecta as mitocôndrias conduzindo à perda de produção de ATP [20]. Além disso, a criação de poros transientes na membrana plasmática podem fazer com que a fuga de ATP para fora da célula [23]. Em geral, ATP celular diminui quando um nível tóxico de cálcio é induzida para dentro da célula, possivelmente através destes mecanismos. Este esgotamento ATP pode contribuir para a iniciação da morte celular [6,24].
O cálcio eletroporação é comparável em eficácia para Eletroquimioterapia
in vitro
[7] e está actualmente a sofrer o primeiro ensaio clínico em um estudo randomizado de fase II duplo cego não-inferioridade (ClinicalTrials.gov-ID NCT01941901). Mais conhecimento sobre o mecanismo de eletroporação de cálcio é necessária para melhor compreender e explorar essa modalidade antitumoral.
Para investigar a relação entre a concentração de cálcio e campos elétricos pulsados na obtenção de esgotamento ATP e morte de células suficientes
in vitro
, foram utilizadas as linhas celulares conhecidos por terem a capacidade de resposta diferente ao tratamento electroporação cálcio
in vivo
: cancro do pulmão humano de células pequenas H69 com uma sensibilidade elevada (77-100% de necrose em tumores 6 dias após a electroporação de cálcio; [ ,,,0],9]) e linha de células de cancro da bexiga humano SW780 com baixa sensibilidade (1-60% de necrose nos tumores 6 dias após a eletroporação de cálcio; dados não publicados). Nós também exploraram os efeitos de curto prazo de electroporação de cálcio no conteúdo de ATP de uma linha celular de leucemia de humano (U937) utilizando imagiologia confocal com a quinacrina marcador fluorescente.
Este estudo investiga a relação entre o campo eléctrico aplicado, a concentração de cálcio , sensibilidade da linha celular e o efeito sobre o conteúdo ATP e sobrevivência.
Materiais e Métodos
Três linhas de células humanas foram utilizados para experimentos. Experimentos que analisam o conteúdo ATP e viabilidade realizado na Universidade de Copenhagen Hospital Herlev usado câncer de pulmão H69 humano de pequenas células e linhas celulares de cancro da bexiga humano SW780. A linha de células de leucemia humana U937 foi usada para experimentos no Centro de Pesquisa Frank Reidy para Bioelectrics.
celular cultura
A linha de células de câncer de H69 humano de pequenas células do pulmão estavelmente transfectadas com reforçada proteína verde fluorescente (EGFP) regulado pelo promotor citomegalovírus [25] foi gentilmente cedido pelo Departamento de radiação Biologia, Copenhagen University Hospital. O carcinoma de células transicionais da bexiga humano SW780 foi gentilmente cedido pelo Dr. Lars Dyrskjøt Andersen, Departamento de Medicina Molecular do Hospital Universitário Aarhus [26]. A linha celular de monócitos histiocitária linfoma humano U937 (ATCC CRL-1593,2) foi gentilmente cedido por Olga Pakhomova, Frank Reidy Centro de Pesquisa para Bioelectrics, Old Dominion University.
Todas as linhas celulares foram mantidas em RPMI 1640 meio de cultura contendo 10 % de soro fetal de vitelo (Gibco, Invitrogen), 100 U /ml de penicilina e estreptomicina 100 ug /ml a 37 ° C e 5% de CO
2.
a electroporação protocolo
células em tampão HEPES (HEPES 10 mM (Lonza), sacarose 250 mM, MgCl 1 mM de
2 em água estéril) com uma concentração final de 6,1 x 10
6 células /ml, foram arrefecidas em gelo durante 5 min. Por electroporação de cálcio (CAEP), 20 ul de tampão HEPES contendo CaCl
2 foi adicionado em cuvetes de electroporação com separação eléctrodo 4 mM (Molecular BioProducts Inc., San Diego, CA, EUA) para se obter uma concentração final de 0 mM, 1 mM, 3 mM, ou 5 mM de CaCl
2 após a adição de 180 ul de suspensão de células. As cuvetes foram mantidos em gelo durante 5 min antes da electroporação (EP). EP consistiu de 8 pulsos de 99 mS com 0,8 kV /cm, 1,0 kV /cm, 1,2 kV /cm, 1,4 kV /cm ou 1,6 kV /cm, respectivamente, entregue a uma frequência de 1 Hz usando um electroporator onda quadrada BTX T820 ( BTX Harvard Apparatus). Após 20 minutos de incubação a 37 ° C e 5% de CO
2, as células foram diluídas em meio de cultura de 5 ml (concentração final 2,4 x 10
5 células /ml).
ensaio de ATP
nível celular de ATP foi medida em células SW780 H69 e tratado com cálcio, com ou sem a electroporação utilizando um ensaio de luminescência de ATP (ATP Enliten ensaio; Promega) após lise das células. Para o ensaio de ATP 11,5 × 10
4 células /ml H69 células ou 4,6 × 10
4 células /ml de células SW780 em meio de cultura 100 ul foram em placas de 96 poços, em conformidade com a optimização inicial.
as células foram tratadas de acordo com o protocolo de electroporação. As células electroporadas com tampão HEPES, células não-electroporado com cálcio, e células não tratadas foram usadas como controlos. Células três vezes descongelado e congelado, em seguida, sonicado (Ultrasonic Bath Branson 1200), foram utilizados como (células mortas) de controle. Após a centrifugação do sobrenadante placas de 96 poços foi removida. teor celular de ATP 1, 2, 4, e 8 horas após o tratamento foi determinada por lise das células (30 min), então a adição de 100 ul RL /l de reagente e medindo a emissão de luz usando um luminómetro (LUMIstar, Ramcon).
MTS Viabilidade ensaio
viabilidade de H69 e SW780 células tratadas com cálcio, com ou sem a electroporação foi avaliada utilizando MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (carboxymethophenyl) -2- (4-sulfonil) -2H-tetrazólio) ensaio (Cell Titer 96 Aqueous celular não radioactivo ensaio de Proliferação; Promega). ensaio MTS é um método colorimétrico que permite estimar a taxa de metabolismo em células viáveis. Após a suspensão de células 100 uL de tratamento (2,4 × 10
5 células /ml) foi semeada em placas de 96 poços. Após 24 horas de incubação do reagente 20 ul MTS /PMS foi adicionado a cada (concentração final de 333 ug /ml de STM e 25 uM PMS) bem. Após 1 hora de incubação a 37 ° C e 5% de CO
2 a viabilidade celular foi avaliada através da medição da densidade óptica (DO) utilizando um Multiscan-Ascent leitor de ELISA (ThermoLabsystems, Finlândia) a 490 nm com as medições de fundo a 690 nm.
relações de montagem entre os parâmetros experimentais e dados de sobrevivência de células
A análise dos dados foi realizada utilizando MATLAB (Natick, MA, EUA) software. A sobrevivência de células (expresso como percentagem de controlo) de linhas de células SW780 e H69 em 24 h após tratamento foi representada graficamente contra a amplitude do campo eléctrico a cada concentração de cálcio considerado. O melhor ajuste de curva foi então derivada. A partir das curvas de montagem, a intensidade do campo eléctrico (E
50) necessária para matar pelo menos 50% de células em cada concentração de cálcio foi extraído, a fim de quantificar a eficiência de morte celular de electroporação na ausência ou na presença de cálcio.
imaging ATP
usando a imagem confocal com um SP8 microscópio Leica TCS, teor de ATP após a eletroporação foi avaliada em células U937 usando o quinacrine corante fluorescente (Sigma-Aldrich, EUA), um não- marcador específico com elevada afinidade para os nucleótidos de adenina [15]. Quatro foram exploradas condições: As células tratadas com cálcio externo 3 mM; As células expostas a pulsos electroporating (1 kV /cm, 8 × 99 microsiemens, 1 Hz); células expostas a ambos cálcio externo 3 mm e pulsos electroporating; e amostras de controlo não tratadas. As células foram incubadas a 37 ° C durante 30 minutos em meio de crescimento contendo 10 ^ M, quinacrina seguido pelo protocolo de electroporação descrito na secção 2.2. (Concentração de células, mas mesmo utilizado arrefecimento excluídos e as células foram electroporadas em 1 mm cuvetes em presença de iodeto de propídio 10 uM). Imediatamente após as células de electroporação foram transferidos respectivamente para cobrir as câmaras de vidro para imagens contendo meio RPMI 1640, 1,6 uM quinacrina e 1,25 uM de iodeto de propídio (Molecular Probes, EUA; um indicador de permeabilização da membrana) com diluição a 1: de ambas as células e os corantes 6 (Cell concentração de 1 × 10
6 células /ml) e para placas de 96 poços para ensaio de viabilidade. Nós fotografada a fluorescência quinacrina 15 minutos após o tratamento. A intensidade de fluorescência foi medida em 9 imagens por condição. Em cada imagem, fluorescência de vinte células selecionadas aleatoriamente foi integrado com uma média de utilização (180 células total) de software MATLAB.
resazurina ensaio de viabilidade
viabilidade das células U937 foi avaliada utilizando o ensaio resazurina (Life Technologies , EUA) realizada 24 horas após a exposição. Dez microlitros de reagente (Prestoblue, Molecular Probes) foi adicionado a cada cavidade contendo 90 ul de suspensão de células (concentração de células de 2,4 x 10
5 células /ml). Após 1 hora de incubação a 37 ° C e 5% de CO
2, a viabilidade celular foi avaliada por medição da fluorescência utilizando Sinergia 2 leitor de microplacas (Biotek Instruments, EUA).
Análise estatística
As diferenças de ATP intensidade luminescente entre os grupos testados com ensaio de ATP luminescência foram validados e analisados com um modelo de diminuição exponencial com correção de Bonferroni usando o software SAS (versão 9.2). valores de luminescência foram log transformados antes da análise. Two-way ANOVA (análise de variância) com correção de Bonferroni foi utilizado para avaliar diferenças de viabilidade entre os grupos testados com ensaio de proliferação MTS também usando SAS 9.2 software. T-teste foi utilizado para a avaliação de diferenças entre os grupos testados com ensaio de viabilidade resazurina e para grupos com imagem criada analisados com o software MATLAB.
Resultados
ATP celular e viabilidade após a eletroporação de cálcio
única de cálcio (sem electroporação).
a exposição das células a concentrações crescentes de cálcio extracelular, na ausência de electroporação não teve nenhum efeito aparente no nível de ATP celular ou a viabilidade em comparação com controlos em qualquer uma das duas linhas de células (Figuras 1A e 1B, 2A e 2B)
os níveis de ATP celular determinada 1, 2, 4, e 8 horas após o tratamento electroporação cálcio de duas linhas de células humanas (H69, uma linha celular de cancro do pulmão de pequenas células (a).; e SW780, uma linha celular de cancro da bexiga (B)). As concentrações de cálcio extracelular de 0 mM, 1 mM, 3 mM, ou 5 mM e aplicada campo eléctrico de 0,8 kV /cm, de 1,0 kV /cm, ou 1,2 kV /cm. Os resultados estão ilustrados como percentagem de controlo (sem electroporação, nenhum cálcio adicionado). . Normalizada para controlar em cada momento (%), média-D.P., n = 6.
A viabilidade, avaliada utilizando o ensaio MTS, de H69, uma linha de células do cancro do pulmão de pequenas células humana (A); e SW780, uma linha humana cancro da bexiga de célula (B) 24 horas após o tratamento com eletroporação cálcio. As concentrações de cálcio extracelular finais de 0 mM, 1 mM, 3 mM, ou 5 mM e aplicada campo eléctrico de ambos os 0,8 kV /cm, de 1,0 kV /cm, ou 1,2 kV /cm. Células três vezes descongelado e congelado, em seguida, sonicado foram usados como (células mortas) de controle. Os resultados estão ilustrados como percentagem de controlo (sem eletroporação, cálcio sem adição), eletroporação (EP), média + SD, n = 6.
Eletroporação apenas (sem cálcio).
o aumento do campo eléctrico não teve nenhum efeito significativo sobre o teor de ATP das células H69, quando expondo-os a electroporação sozinho (Fig 1A). os níveis de ATP em eletroporados-somente H69 amostras aumentou ao longo do tempo durante a incubação conforme anteriormente observado [6]. Não houve diminuição significativa da viabilidade das células tratadas com H69 campo eléctrico pulsado sozinho (Fig 2A).
O aumento do campo eléctrico de 0,8 a 1,2 kV /cm que não tem um efeito significativo sobre o teor de ATP das SW780 células, quando expondo-os a electroporação sozinho (Figura 1B). Como mostrado na Fig 2B, houve um declínio de 28% na viabilidade das células SW780 tratados com 0,8 kV campo eléctrico /cm, indicando que electroporação sozinho causou a morte das células, embora não seja estatisticamente significativa.
Cell Calcium electroporação-H69 ATP .
os níveis de ATP diminuiu em H69 células com concentrações crescentes de cálcio e aumento do campo elétrico (Fig 1A). electroporação de cálcio usando 0,8 kV /cm diminuiu significativamente o nível de ATP intracelular quando combinado com cálcio 5 mM em comparação com controlos não tratados (p 0,05). Quando se utiliza 1,0 kV /cm e 1,2 kV /cm, todas as concentrações testadas de cálcio (1, 3, e 5 mM) diminuiu significativamente o nível de ATP intracelular em comparação com controlos não tratados e de cálcio sozinho (p 0,001). Aumentando o campo eléctrico 0,8-1,0 kV /cm de electroporação de cálcio com cálcio 1 mM diminuiu significativamente o nível de ATP (p 0,05). Aumentando ainda mais o campo 1,0-1,2 kV /cm não teve qualquer efeito adicional no nível de ATP.
electroporação-H69 cálcio viabilidade celular.
Como se pode ver na Fig 2A, electroporação de cálcio causada diminuição significativa na H69 viabilidade celular para todas as doses testadas superiores de cálcio 1 mM, com 0,8 kV /cm (P 0,05). Novos aumentos no campo elétrico ou concentração de cálcio não teve um efeito adicional significativo sobre a viabilidade H69 (Fig 2A).
eletroporação-SW780 cálcio ATP celular.
Como mostrado na Figura 1B, 1, 3 ou 5 mM de electroporação de cálcio diminuíram de forma significativa os níveis de ATP em todas as condições de impulso em comparação com controlos não tratados, bem como cálcio sozinho (p 0,05). Aumentando o campo eléctrico 0,8-1,0 kV /cm, e 1,0-1,2 kV /cm de tratamento com a electroporação de cálcio 1 mM diminuiu significativamente o nível de ATP (p 0,0001). A adição de cálcio no procedimento de electroporação diminuiu significativamente ATP em todas as condições de impulsos (P 0,0001)..
electroporação-SW780 cálcio viabilidade celular
Como se mostra esquematicamente na Figura 2B, a electroporação de cálcio causada diminuição significativa na viabilidade celular SW780 para todas as doses testadas superiores de cálcio 1 mM, com 0,8 kV /cm (p 0,0001) (Fig 2B). Aumentando o campo eléctrico de 0,8 a 1,2 kV /cm afectada significativamente SW780 viabilidade na presença de cálcio (p 0,001). a morte de células máximo SW780 necessários 1,2 kV /cm e cálcio 5 mM levou a valores mais baixos no ensaio MTA do congelamento e descongelamento das células três vezes com sonicação posterior (p 0,001).
análise de ajuste dos dados de sobrevivência de células
depois de uma análise com curva MATLAB ferramenta de montagem, descobrimos que a função de melhor ajuste para a relação entre a sobrevivência das células após 24 horas e a amplitude do campo elétrico em concentrações de cálcio fixos, era uma função exponencial de dois parâmetros,
y (x) = a · exp (-b · x)
onde
x
é a amplitude e campo elétrico
y (x)
é a percentagem de sobrevivência celular. Os resultados em células SW780 são relatados na Fig 3. O E
50 parâmetro para cada concentração de cálcio considerado foi extraído utilizando a função encontrados. Os resultados, esquematicamente apresentados na Tabela 1 para ambos os H69 e a linha de células SW780, permitiu-nos quantificar o aumento da eficiência de morte celular de electroporação, na presença de cálcio. Em ambas as linhas celulares, e para todas as concentrações de cálcio testados, o campo eléctrico necessário para reduzir para metade a sobrevivência das células 24 horas após o tratamento na presença de cálcio extracelular foi de duas a três vezes mais baixa do que no caso de electroporação sozinho. Diferentes respostas foram obtidas entre as duas linhas celulares. A linha celular H69 necessária maior amplitude de campo eléctrico (cerca de 20%) do que as células SW780 para obter uma redução de 50% na viabilidade das células, com uma concentração extracelular de cloreto de cálcio de 1 a 5 mm. A linha celular SW780 podem ser mais sensíveis ao tratamento com doses baixas de cálcio do que as células H69
in vitro
.
sobrevivência celular (%) em função do campo eléctrico (E) a electroporação de cálcio usando 0, 1, 3, ou 5 mM de cálcio em células de cancro da bexiga humano SW780 avaliada utilizando o ensaio de MTS 24 horas após o tratamento. Eléctrica amplitude de campo de 0,8 kV /cm, de 1,0 kV /cm, de 1,2 kV /cm, de 1,4 kV /cm, ou 1,6 kV /cm foi aplicado. ajuste de curvas foram obtidos utilizando o software MATLAB. Os resultados estão ilustrados como percentagem de controlo (sem eletroporação, cálcio sem adição), média ± SD, n = 6.
imagens de fluorescência confocal de ATP e permeabilidade
usado imagens de fluorescência confocal de células marcadas com quinacrina para investigar alterações nos níveis e distribuição de ATP [27-30] intracelulares. Figura 4 mostra imagens representativas seleccionado tomadas 15 minutos após o tratamento. A fluorescência média de quinacrina cálcio amostras electroporadas foi de cerca de 30% menor do que nas amostras somente de cálcio (p 0,0001), representado esquematicamente na figura 5A. O campo eléctrico necessárias para matar metade das células (E
50) sob as condições explorado na presença de 3 mM de cálcio, foi estimada em 0,70 kV /cm.
U937, uma linha celular de leucemia humana. concentrações de cloreto de cálcio extracelulares finais de 0 mM ou 3mM e aplicada campo eléctrico de 1,0 kV /cm. fluorescência Quinacrine (linha superior), 10 mM; de iodeto de propídio fluorescência (linha do meio), 7,5 mM; imagens de fase celulares contraste (linha inferior).
U937, uma linha de células de leucemia humana. (A) da intensidade de fluorescência celular de U937 quinacrina 15 min após a electroporação de cálcio. A concentração extracelular foi quinacrina 10 fiM durante o carregamento e electroporação. As concentrações de cálcio extracelular finais de 0 mM ou 3mM e aplicada campo eléctrico de 1,0 kV /cm foram utilizadas. As colunas representam a média de 180 células (9 experiências x 20 células). unidades arbitrárias (UA), a média + DP, viabilidade n = 9. (B) células U937 medida 24 h após a eletroporação de cálcio. A viabilidade avaliada por resazurina U937 usando ensaio de proliferação celular. As concentrações de cálcio extracelular de 0 ou 3 mm. campo eléctrico aplicado de 1,0 kV /cm. Os resultados estão ilustrados como percentagem de controlo (sem eletroporação, cálcio sem adição), média + SD, n = 6.
permeabilização de células U937 marcadas pelo afluxo de iodeto de propídio foi adiada e mais irregular depois de cálcio eletroporação em comparação com eletroporação sem cálcio (Fig 4).
também observamos alterações morfológicas nas células electroporated cálcio que exibem de forma irregular integridade comprometida membrana, formação de bolhas, o encolhimento ou a forma da célula irregular (Fig 4).
Resazurina ensaio de viabilidade
os resultados do ensaio de viabilidade (Fig 5B) de células U937 mostram que houve mais células viáveis na amostra tratada com o cálcio por si só que na amostra electroporada-cálcio (p 0,0001).
Discussão
Este estudo explora a resposta em nível de ATP celular e viabilidade de parâmetros eletroporação e concentrações de cálcio diferente para o tratamento eletroporação cálcio. Ambas as linhas de células H69 e SW780 apresentaram uma diminuição dependente da dose no ATP celular e viabilidade com aumento do campo eléctrico, juntamente com o aumento da concentração de cálcio (Figura 1A e 1B). Os resultados não revelarem inteiramente se o tratamento pode ser optimizado de acordo com a sensibilidade da linha de células individuais. Os resultados mostraram que a linha celular H69 necessário um elevado campo eléctrico máximo para induzir a depleção de ATP (Figura 1A) e de células-kill (Fig 2A).
A diferença entre as respostas das duas linhas celulares para o explorado parâmetros de concentração de cálcio e do campo eléctrico pode ser parcialmente explicado pela diferença no tamanho da célula. A resposta celular a eletroporação de cálcio é menos dependente do tamanho da célula
in vivo
por causa de uma falta generalizada de espaço extracelular, afetando a capacidade das células para “esconder” da exposição do pulso [31], uma razão que
os resultados in vitro sobre
limiares podem não necessariamente prever a eficácia in vivo.
cálcio electroporação causou uma diminuição a curto prazo significativa na fluorescência quinacrina em células U937, o que pode indicar a depleção do ATP, e o tratamento de células diminuiu significativamente viabilidade após 24 horas. Mais investigações sistemáticas a seguir podem utilizar um ensaio de ATP-específica, tal como a partir de luminescência luciferina-luciferase.
electroporação irreversível (IRE) é um procedimento em que as células são expostas aos parâmetros de campo eléctrico aplicado fortes o suficiente para induzir danos permanentes da membrana celular, conduzindo finalmente a homeostase iónica interrompido e a morte das células [14]. IRE faz com que a ablação do tecido com menor eficiência de tratamento na margem do tecido alvo onde a intensidade do campo eléctrico é menor. A capacidade de obter uma maior morte de células e provocar a ablação de tecido ao aumentar o campo eléctrico é o fundo para usando IRE para o tratamento do cancro [13], e é actualmente utilizado para o tratamento de insuficiência renal [32], [33] e tumores pancreáticos hepáticas [34 ], e, potencialmente, para prostática [35] e tumores intracranianos [36]. Verificou-se que o aumento da concentração de cálcio extracelular durante a electroporação induz uma maior morte celular, o que implica que a adição de cálcio, até mesmo em doses baixas, poderia potencialmente melhorar o efeito terapêutico de IRE em regiões de baixa intensidade de tecidos alvo, como os resultados da Tabela 1 demonstram . Portanto, a adição de cálcio com o procedimento IRE poderia potencialmente aumentar o raio e a eficácia do tratamento.
IRE e electroporação usado em combinação com medicamentos quimioterapêuticos, está a ganhar aceitação geral como uma modalidade de tratamento para tumores sólidos, e é usado como tratamento paliativo para pacientes impróprios para cirurgia (orientação clínica AGRADÁVEL 446, março de 2013 [2,9-11]). Cálcio eletroporação provou comparável em eficácia para Eletroquimioterapia
in vitro
[7] e está actualmente a sofrer o primeiro ensaio clínico de não inferioridade para o tratamento de metástase cutânea (ClinicalTrials.gov-ID NCT01941901). A eficiência da electroporação calium como uma modalidade de tratamento do cancro romance também está a ser investigada para o tratamento de tumores em órgãos internos [37,38].
Estudos anteriores investigaram a electroporação de cálcio mostraram que o tratamento afecta ATP celular e viabilidade [ ,,,0],6]. Este estudo corrobora essa teoria com uma demonstração de dependência da dose, e ainda suporta o uso de cálcio como uma alternativa eficiente e barata de quimioterápicos em procedimentos de eletroporação.
Para o nosso conhecimento da relação entre a concentração de cálcio e campo elétrico na cálcio tratamento electroporação de células cancerosas anteriormente não foi investigada. Os nossos dados mostram que a electroporação de cálcio é eficaz com os campos eléctricos reduzida se a concentração de cálcio é aumentado. Mais pesquisas são necessárias para entender completamente como esta modalidade de tratamento do câncer romance induz a morte celular e do papel que a depleção de ATP e rompimento da homeostase do cálcio desempenha no efeito terapêutico de eletroporação cálcio.
Conclusões
o efeito de electroporação de cálcio é influenciada por respostas de linhas de células individuais e depende tanto da concentração de cálcio e na amplitude do campo eléctrico. O estudo demonstra que a electroporação de cálcio reduz significativamente ATP celular e sobrevivência de células de cancro. Os resultados apóiam ainda mais a utilização de eletroporação de cálcio como uma modalidade terapêutica no tratamento de cancro, bem como a possibilidade de reduzir o campo elétrico aplicado em futuros ensaios com eletroporação.
Reconhecimentos
Os autores agradecem Olga Pakhomova para oferecer oportunidades de resazurina ensaio de viabilidade, e graças a Marianne Fregil para a prestação de assistência técnica excelente.