Abstract

A via Notch contribui para a auto-renovação das células e inibição da diferenciação de células epiteliais do cólon normal, iniciando tumor. expressão desregulada de Notch1 e Jagged1 é observada no cancro colorectal. Cabeludo /potenciador de dividir a família (HES), os alvos mais caracterizadas de Notch, envolvido no desenvolvimento de muitos cancros. Neste estudo, exploramos a função de HES1 na tumorigénese do cancro colorectal. Derrubando induzida Hes1 senescência celular CRC e diminuiu a capacidade de invasão, enquanto que a sobre-expressão de Hes1 aumento da atividade STAT3 fosforilação e up-regulada nível de proteína MMP14. Nós exploramos ainda mais a expressão de Hes1 no cancro colorectal humana e encontrou alta expressão de mRNA Hes1 está associada com mau prognóstico em pacientes com CCR. Estes achados sugerem que Hes1 regula a capacidade de invasão através da via STAT3-MMP14 em células CRC e alta expressão Hes1 é um preditor de mau prognóstico da CRC

Citation:. Weng M, Tsao P, Lin H, Tung C , Mudança M, Chang Y, et al. (2015) Hes1 aumenta a capacidade Invasão de células de câncer colorretal através da STAT3-MMP14 Caminho. PLoS ONE 10 (12): e0144322. doi: 10.1371 /journal.pone.0144322

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 24 de junho de 2015; Aceito: 15 de novembro de 2015; Publicação: 09 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Weng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Liver Disease Prevention Fundação tratamento Research, Taiwan, a MTW. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais comum [1] e a ressecção cirúrgica é o tratamento padrão para CRC fase inicial. Quimioterapias, incluindo oxaliplatina, irinotecano, e flouracil são amplamente utilizados para tratar a doença avançada [2]. As terapias contra factores de crescimento endotelial vascular ou seus receptores, tais como bevacizumab [3], aflibercept [4], e regorafenib [5], prolongar a sobrevivência de pacientes com cancro colo-rectal avançado. No entanto, apesar dos avanços na ressecções cirúrgicas e terapias sistémicas, incluindo quimioterapia adjuvante, muitos pacientes ainda morrem de CRC, e câncer colorretal é a quarta no número de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1].

As alterações genéticas e epigenéticas dirigir a iniciação e progressão da sequência adenoma-carcinoma em cancro colo-rectal [6] e a activação aberrante da sinalização de Notch1 é uma da via identificados [7, 8]. sinalização Notch contribui para a auto-renovação das células tumorais, iniciando-expansão do conjunto de células progenitoras intestinal, e a inibição da diferenciação normal do cólon célula epitelial [9-11]. sinalização Notch é ativada através da ligação dos dois grupos de ligantes, Jagged (Jagged1, 2) e Delta-like (DLL1, 3, 4). maior expressão de ARNm de Notch1 e Jagged1 e suas proteínas foram observados em tecidos de CRC em comparação com o tecido não tumoral adjacente [12]. Além disso, a expressão da proteína Notch1 foi positivamente correlacionada com o estágio do tumor [12] e grau de patologia (alta expressão Notch1 no carcinoma pouco diferenciado) [8, 13].

Um dos alvos mais caracterizadas de Notch é o peludo /potenciador de split (HES) da família [14]. Esta meta mostra a promessa na indução de diferenciação celular do tumor intestinal [15]. A sobre-expressão de HES1 tem sido associada com o desenvolvimento de pancreático [14, 16, 17], da mama [18] e do ovário [19] cancros e os seus resultados a sub-regulação de diferenciação acelerada e diminuição da proliferação celular em vários modelos de cancro [20, 21 ]. Até à data, tem havido poucos dados sobre a expressão Hes1 no cancro colorectal [7, 22, 23]. Desde a alta expressão de Notch é observado em câncer colorretal e está associada com o estágio do tumor, estávamos interessados ​​em saber se Hes1 está envolvido na tumorigênese de adenocarcinoma de cólon.

No presente estudo, nós exploramos a expressão de Hes1 no cancro colorectal humana e correlacionados a sua expressão com os resultados clínicos. a alta expressão de mRNA Hes1 está associada com mau prognóstico em pacientes com CCR. Na análise funcional, descobrimos que a supressão da expressão Hes1 induz mais senescência celular CRC e diminui a capacidade de invasão das células CRC através da regulação da expressão MMP14.

Material e Métodos

As culturas de células

293 células T humanos e linhas celulares de cancro do cólon: HCT116, Caco2 e SW48 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Eles foram mantidos em DMEM (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) suplementado com 10% de soro fetal de bovino e 1% de penicilina /estreptomicina 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% num incubador humidificado.

Reagentes

O plasmídeo EF.hHES1.Ubc.GFP e EF.deltaBHES1.Ubc.GFP plasmídeo foram adquiridos do laboratório de Linzhao Cheng [24] via addgene Inc. (Cambridge, MA). O Flag-HES1 foi gerado por digestão com BamHI EF.hHES1.Ubc.GFP e Xhol, e a inserção do plasmídeo digerido para os múltiplos locais de clonagem do vector pcDNA4-TAG (Invitrogen, Carlsbad, CA). Stattic foi obtido a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). ARNsi de controlo e ARNsi HES1 foram obtidos de Qiagen (Venlo, Países Baixos). Lipofetamine RNAiMAX (Invitrogen) foi utilizado como um reagente de transfeco de siARN. O protocolo foi realizado de acordo com as instruções do fabricante a uma concentração final de 10 nM.

Western Blot

As transferências de Western foram realizados como previamente descrito [24]. Os anticorpos primários utilizados foram Hes1 (Millipore, Billerica, MA), MMP14 (Abcam, Cambridge, UK), STAT3, fósforo-STAT3 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Bandeira e actina (Sigma-Aldrich). As membranas foram depois incubadas com um anticorpo primário específico durante a noite, lavou-se, em seguida, incubadas com um anticorpo secundário apropriado conjugado com peroxidase de rábano, e desenvolvido utilizando ECL (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA).

extracção de ARN e real tempo de reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR)

O ARN total a partir de amostras de doentes foi extraída com o kit de extracção de ARN (da Qiagen) de tecido homogeneizado com Trizol (Invitrogen). O ARN total a partir das linhas de células foi extraído com um kit RNeasy Mini (Qiagen). O ARN foi transcrito de forma inversa com o ADN utilizando o kit High Capacity cDNA de transcrição reversa (Applied Biosystems, Foster City, CA). Expressão de Hes1 e MMP2, MMP3, MMP7, MMP9 e MMP14 mRNA foram avaliados usando Green Power PCR Master Mix SYBR (Applied Biosystems). ARNm de GAPDH foi usada como um controle endógeno. A expressão de ARN foi analisada utilizando o método 2-ΔΔCt. Os iniciadores para a expressão de ARNm foram demonstrados na Tabela S1.

ensaio de proliferação

A viabilidade celular foi determinada pelo MTT [brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5- diphenyltetrazoliumbromide, Sigma-Aldrich Co.] ensaio.

invasão in vitro de ensaio

A actividade invasiva foi medida usando um sistema de membrana de cultura de invasão em que uma membrana de policarbonato com poros de 8 ^ m (Millipore , Billerica, MA) revestidas com Matrigel (R D Systems Inc., Minneapolis, MN) a 5 mg /mL foi colocado entre os poços superior e inferior de uma câmara de sistema de cultura de invasão da membrana. Em seguida, 5 × 10

4 HCT116 ou células SW48 foram colocados em cada poço da câmara superior. Após uma incubação de 48 horas a 37 ° C, as células que tinham migrado através da membrana revestidos foram removidos a partir da câmara inferior com 1 mM de EDTA em PBS e ponto transferidas para uma membrana de policarbonato com poros de 3 um. As células coradas foram apagados com Giemsa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), e o número de células em cada blot foi contado sob um microscópio com uma ampliação de 50 x. Cada experiência foi repetida três vezes, e cada amostra foi ensaiada em triplicado.

SA-β-gal ensaio de actividade

células Caco2 foram tratados com uma senescência β-Galactosidase A coloração kit (Cell Signaling) . O protocolo foi feito de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 2 * 10

5 células Caco2 foram transfectadas com ARNsi e plaqueadas numa 35 mm assim durante 24 horas. As células foram então lavadas com PBS, fixadas em solução fixadora 1X durante 10 minutos à temperatura ambiente, e lavados duas vezes com PBS. As células foram então incubadas com solução de coloração β-galactosidase durante 10 h a 37 ° C. células coradas de azul foram contados em 400 × ampliação.

CRC Human tecido

criosecções colorretais foram preparadas a partir de amostras cirúrgicas de câncer colorretal que foram coletados de setembro de 2000 a junho de 2003, após a obtenção do consentimento informado por escrito . Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da National Taiwan University Hospital. Todos os tecidos foram congelado de fresco ou imersos no composto óptima temperatura de corte (OCT) (Ames Company, Elkhart, IN), e manteve-se a -80 ° C até à sua utilização. estadiamento clínico dos casos de câncer foi determinado com base na classificação UICC-TNM.

A análise estatística

As comparações das variáveis ​​entre os dois grupos foram realizadas por meio do teste t de Student dois atados com expressos em média + erro padrão da média (EPM). Todas as experiências foram realizadas pelo menos em triplicado. T pareado testes foram utilizados para a comparação de tumor e não tumor expressão de mRNA. Utilizou-se o método de Spearman para analisar as correlações entre Hes1 e MMP14. expressão alta e baixa Hes1 e MMP14 foram definidos de acordo com o nível de expressão mediana em cada grupo. A sobrevivência foi calculada pelo método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank. Os valores de P inferiores a 0,05 foram considerados significativos.

Resultado

Derrubar a capacidade invasão gene Hes1 prejudicada

Para explorar os papéis de Hes1 em células cancerígenas do cólon, nós examinaram os níveis de expressão HES1 em linhas celulares de cancro do cólon 6 utilizando RT-PCR quantitativo e encontrados os níveis de expressão elevada em HES1 CaCo2 e células SW48 e baixos níveis de expressão em células HCT116 HES1 (Fig 1A). Em seguida, expressos de forma estável ou um HES1 HES1 mutante a que falta o domínio de ligação do ADN, em células de cancro do cólon HCT116 e HT29 (Fig 1B). Observou-se maior capacidade de invasão das células que sobre-expressam HES1 em comparação com células infectadas com o plasmídeo de controlo pcDNA4. Não foi demonstrada capacidade aumentada invasão em células HCT116 e HT29 que expressa mutante HES1, sugerindo que o domínio de ligação ao ADN é importante para a capacidade de invasão de células cancerígenas do cólon (Fig 1C). A seguir, empobrecido HES1 nas células SW48 e Caco2 utilizando siRNA (Figura 1D), e observados menos invasão de células transfectadas com ARNsi HES1 do que aqueles com ARNsi de controlo (Figura 1E). Para determinar o papel da HES1 na característica do cancro de células de CRC, um ensaio de proliferação foi realizado e mostrou nenhuma alteração significativa após depleção HES1 (Fig S1).

(A), a expressão de ARNm HES1 nas linhas de células do cólon . (B) a expressão da proteína Hes1 e bandeira em cima superexpressão de Hes1 e mutante Hes1 em células HCT116 e HT29. capacidade (C) celular invasão muda após superexpressão Hes1 e mutante Hes1 em células HCT116 e HT29. (D) Expressão da proteína em células Caco2 HES1 e SW48 sobre siARN HES1 transfecção. (E) a capacidade celular invasão muda em cima siRNA Hes1 transfecção. (F) Imagens representativas de senescência β-galactosidase na Caco2 e células SW48. (G) A quantificação de células positivas senescência β-galactosidase na Fig 1F. (* P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,005).

esgotar o gene Hes1 induzida mais células da CRC em senescência

Tem HES1 sido relatado que é necessário para a reversibilidade de quiescência celular e evita a senescência prematura em fibroblastos quiescentes [25]. Nós derrubado Hes1 em células SW48 e Caco2 e observaram significativamente mais expressão da beta-galactosidase em Hes1 derrubado células, sugerindo mais senescência nas células Hes1depleted (Fig 1F e 1G).

Knockdown do gene Hes1 diminui invasão através da regulação MMP14

Como vários metaloproteinases de matriz (MMP) mediar a invasão das células cancerosas [26], estudamos a expressão de um painel de MMPs em células de câncer de cólon em cima Hes1 knockdown. Observou-se que apenas o nível de expressão após a diminuição da MMP14 HES1 knockdown ao nível do ARNm em células Caco2 (Fig 2A). Então, nós encontramos knock-down chumbo Hes1 a MMP14 diminuição nível de proteína em células SW48 (Fig 2B). Por outro lado, a sobre-expressão de HES1 levou a um aumento da expressão de mRNA MMP14 (Fig 2C). Nós ectopicamente expressa um gene mutante HES1, que carrega uma truncagem no seu domínio função, e não observamos o aumento da MMP14 nas HCT116 e HT29 células (Fig 2C).

(A) Uma série de MMP a expressão de ARNm em cima do siARN HES1 transfecção em células Caco2. diminuição proteína (B) mediante MMP14 siARN HES1 transfecção em células SW48 (c) expressão de ARNm de MMP14 sobre HES1 e mutante HES1 sobreexpressão em células HCT116 e HT29. (* P 0,05, ** p 0,01)

HES1 expressão regulada MMP14 depende da via de STAT3

Foi relatado que HES1 activa transdutores de sinal e activadores da transcrição 3 (STAT3) via [27, 28], e que STAT3 controla a expressão MMP1 em células de cancro do cólon [29, 30]. Nós, portanto, avaliar se a atividade STAT3 desempenha um papel na regulação da MMP14 de HES1 em células de câncer de cólon. esgotamento Hes1 por knockdown reduzida expressão da proteína MMP14 siRNA nas células Caco2 e SW48. depleção HES1 resultou numa diminuição da STAT3 fosforilação e nenhuma mudança de STAT3 total no Caco2 e células SW48 (Figura 3A e 3B). Ectopicamente superexpressão um FLAG marcado plasmídeo STAT3 constitutivamente ativo, resultou em aumento dos níveis de proteína MMP14 em células HCT116 (Fig 3C e 3D). a sobre-expressão ectópica de HES1 expressão aumentada MMP14, bem como STAT3 phosphyorylation nas células HCT116. Além disso, a fosforilação da STAT3 e expressão da proteína MMP14 foi reduzida quando as células foram tratadas com stattic, um inibidor da activação de STAT3 (Figura 3E e 3F). Nossos resultados sugerem que HES1 regular a expressão MMP14 através de up-regulação da actividade STAT3 em células de câncer de cólon.

Hes1 e expressão MMP14 não estão relacionados com o estágio do tumor

Como expressão Notch1 está associada a tumor etapa, avaliamos a expressão de Hes1 em tecidos CRC humanos. Foram analisados ​​74 emparelhado adenocarcinoma de cólon humano e seus tecidos não tumorais de cólon adjacentes da coorte paciente National Taiwan University Hospital (Tabela 1). Nós descobrimos que o nível de Hes1 (Fig 4A) ou mRNA MMP14 (Fig 4B) expressão não estava relacionado com o estágio do tumor.

(A) mRNA Hes1 (

p

= 0,06 por Uma maneira ANOVA) e (B) a expressão do mRNA MMP14 (

p = 0,60

by One way ANOVA) não foi correlacionada com o estágio do tumor.

High expressão de Hes1 no CRC é associado com menor sobrevida

Nós investigou também se Hes1 e expressões MMP14 se correlacionam com a sobrevivência do paciente. a expressão de ARNm e a expressão de ARNm HES1 MMP14 foram correlacionados positivamente no tecido tumoral (coefficiency correlação = 0,238, p = 0,035). expressão alta Hes1 nos tumores foi correlacionada com o tempo de sobrevivência mais curtos (Fig 5A). Alta MMP14 também foi correlacionada com uma menor sobrevida (Fig 5B).

Os pacientes foram divididos em Hes1 /MMP14 grupos baixas e altas com base na expressão mediana ERH /MMP14 e sua sobrevivência estava planejando utilizando a análise de Kaplan-Meier ( uptick indica eventos censura). (A e B) paciente CRC com alta expressão Hes1 e MMP14 é associada com a sobrevivência pobre. (C e D) No subgrupo de pacientes com estágio I-III CRC, alta Hes1 e expressão MMP14 é significativamente associada com a sobrevivência pobre. (E e F) No subgrupo de pacientes com CCR em estágio IV, Hes1 e expressão MMP14 não está associado com a sobrevivência.

Nós estratificada ainda mais esses pacientes de acordo com as suas doenças metastáticas. Para os pacientes com doenças avançadas cedo ou localmente, alta expressão Hes1 ou alta MMP14 foi associada com a sobrevivência significativamente menor. No entanto, HES1 e MMP14 níveis de expressão não foram relacionados para a sobrevivência de pacientes com doenças metastáticas (Fig 5C-5F). Como MMP desempenha um papel na invasão e metástase do cancro, pode ser menos de prognóstico para pacientes com tumores que foram já metastizaram em diagnóstico

De acordo com a análise multivariada de regressão de Cox análises, HES1 (HR, 2,41;. 95% IC , 1,07-5,43) e MMP14 (HR, 2,36; IC 95%, 1,02-5,46) permaneceram positivamente associado com mortes por câncer colorretal. Metástase também foi associado significativamente (HR, 10,05; IC 95%, 4,11-24,60), com mortes por câncer colorretal (Tabela 2). Em relação à interação entre Hes1 e metástases, os pacientes apresentaram alta Hes1 ainda tiveram um risco aumentado de morte por câncer colorretal.

Discussão

A homeostase de auto-renovação, proliferação e diferenciação de caule e células progenitoras são regulados por Notch, WNT, FGF e as vias de sinalização Hedgehog [31-33]. No intestino, estas vias também estão envolvidos na formação de vilosidades e desenvolvimento de tumor colo-rectal [9, 34, 35]. A via de WNT exibe interações cruz-regulação com a via Notch [36, 37]. APC

min (múltiplos neoplasia intestinal), ratinhos nos quais o gene APC portador de uma mutação no codão 850 de truncamento e a via de WNT é desregulada, pode desenvolver centenas de intestino delgado e pólipos do cólon [38]. activação Notch é essencial para a formação de adenoma do cólon em APC

murganhos Min [10]. A inibição da HES1 na APC

murganhos Min diminuiu a proliferação de células tumorais e tem levado a diferenciação de células de tumor em células epiteliais intestinais [15].

HES1 desempenha um papel importante na carcinogénese CRC. Ele liga-se directamente ao promotor do gene Hath1 e suprime a expressão Hath1 [39]. Hath1 é um supressor tumoral que inibe a proliferação e capacidade independente de ancoragem de células de cancro do cólon [40, 41], e promove a diferenciação de células secretoras intestinal [42]. É bem sabido que HES1 evita a senescência prematura em fibroblastos quiescentes [25]. Aqui, demonstramos que empobrecem HES1 em células de cancro do cólon não afectou a proliferação celular, mas um aumento da expressão de beta-galactosidase, o que indica que a depleção HES1 induz a senescência celular do cancro do cólon. Infra-regulação da senescência induzida Hes1 também tem sido relatada em células hepatocelular através da regulação CDKN1C /p57 [43].

A seguir, caracterizado que Hes1 promovido invasão celular pelo aumento da expressão MMP14. MMP14 é uma protease chave na migração de células /invasão e angiogénese [44, 45]. Alta expressão de MMP14 foi relatada em câncer de pulmão e glioma [46, 47]. HES1 interage com STAT3 e promove a sua fosforilação [28]. Além disso, a STAT3 foram relatados para regular a MMP-2 e MMP-9 de expressão e actividades directamente através de ligação ao seu promotor [48-50]. No presente estudo, observaram-se também que a sobre-expressão da STAT3 aumento da expressão de MMP14 (Figura 3). Nossos resultados sugerem que a regulação positiva de MMP14 por Hes1 em células CRC é dependente da via STAT3.

Por fim, observamos que tanto a alta Hes1 e expressão MMP14 foram correlacionados com a sobrevivência pobre. resultado semelhante foi encontrado no subgrupo de pacientes com início ou localmente avançado CRC, mas não em pacientes que o tumor tenha metastizado. No estudo de Veenendaal, que observaram maior expressão Hes1 em cancros do cólon primários, mas perdeu expressão em metástases regionais e à distância [23]. Esse achado sugere atividade Notch reduzida em tumores colorretais secundários e pode explicar por que o nível de expressão Hes1 não está associado com a sobrevivência quando tumor se metastasied em nosso estudo. Em contraste, Reedijk et ai. relatado anteriormente que a alta Hes1 não está relacionado com a sobrevivência dos pacientes de CRC através da análise de 130 dados de microarranjos de US National Cancer Institute Colon Registro Familiar do Câncer. Alta expressão foi definida como o primeiro quartil das pontuações Allred [7]. Embora conflitos resultam da Reedijk com a nossa descoberta, o estágio do tumor, definição de expressão elevada e abordagem metodológica são diferentes nestes dois estudos. O verdadeiro papel prognóstico da Hes1 em warrants CRC mais uma confirmação.

Em conclusão, a ativação aberrante da via Notch inibe a diferenciação celular e contribui para carcinogênese. Hes1 é um repressor da transcrição chave e reguladores essenciais para a via Notch. Aqui, demonstramos que sobreexpressão de HES1 aumenta a capacidade de invasão celular através da via da STAT3-MMP14. expressão Hes1 está correlacionada com a expressão MMP14 na CRC e é um preditor de sobrevida do paciente. Segmentação da via Notch-Hes1 pode ser explorada para fins terapêuticos em cancros Notch activado.

Informações de Apoio

S1 Fig. (A) a mudança viabilidade celular em cima do siRNA Hes1 transfecção nas células SW48

doi:. 10.1371 /journal.pone.0144322.s001

(TIF)

S1 Table. Primers para RT-PCR

doi: 10.1371. /Journal.pone.0144322.s002

(DOCX)

Reconhecimentos

Nós gostaríamos de agradecer ao Prof. Linzhao Cheng para graciosamente fornecendo HES1 e delta-HES1 plasmídeos via Addgene.