Abstract

O câncer de pâncreas é uma doença quase sempre fatal em consequência da invasão precoce de estruturas adjacentes e metástases e a falta de uma modalidade de tratamento eficaz. Nossos estudos anteriores mostraram que Qingyihuaji Fórmula (QYHJ), uma fórmula medicina chinesa sete erva, tiveram efeitos significativos anti-cancerosas no câncer pancreático. Aqui, foram examinados os efeitos de QYHJ na invasão de células de cancro do pâncreas e metástases e o potencial mecanismo (s) associado. Descobrimos que QYHJ inibiu o crescimento de tumores e metástases em ratinhos nus com xenoenxertos de células de cancro pancreático humano. Um estudo adicional indicou que QYHJ inibida epitelial-mesenquimal-a transição (EMT), que é caracterizada por um aumento da expressão de E-caderina diminuiu e vimentina, N-caderina e lesma. A interleucina 6 (IL-6), uma citocina pró-inf lamatória produzida principalmente por macrófagos, poderia promover EMT e invasão de células de cancro. Em contraste, o tratamento com QYHJ inibiu a inflamação relacionada com o cancro nos tumores através da diminuição da infiltração de macrófagos associados a tumores e a produção de IL-6, impedindo assim a invasão de células e metástase. Estes resultados sugerem que a medicina tradicional chinesa base de plantas QYHJ pode inibir a invasão de células do cancro do pâncreas e metástases, em parte, pela inversão inflamação-suportando tumor

citação:. Zhang J, Wang P, Ouyang H, Yin J, Liu A, Ma C, et ai. (2013) Segmentação Inflamação Cancer-relacionados: Medicina Chinesa Inibe epitelial-a-mesenquimal Transição no cancro do pâncreas. PLoS ONE 8 (7): e70334. doi: 10.1371 /journal.pone.0070334

editor: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, Itália |

Recebido: 03 de fevereiro de 2013; Aceito: 18 de junho de 2013; Publicação: 29 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela National Science Foundation da China (81001061, 81072942, 81173461); Shanghai Science Fund Nature, Shanghai, China (09ZR1406800); Programas de Doutorado Fundação do Ministério da Educação da China (20090071120076); Comissão de Ciência e Tecnologia de Xangai Nascente-Star Programa (11QA1401300); e Talentos Medical Programa de Formação de Bureau of Shanghai Saúde (XYQ2011008). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas continua a ser um dos cânceres mais difíceis de tratar [1]. O mau prognóstico de pacientes com câncer de pâncreas é em grande parte devido à invasão local precoce de estruturas adjacentes e metástases à distância [2]. A maioria dos pacientes com cancro pancreático são diagnosticadas com doença metastática, e apenas 10% a 20% dos pacientes com doença localizada é operável no momento do diagnóstico [3]. Gemcitabina monoterapia ou terapia de combinação com Erlotinib tornou-se a quimioterapia padrão para o tratamento de cancro do pâncreas avançado; No entanto, a sobrevivência média é de 5-6 meses [4]. Assim, é importante encontrar uma abordagem terapêutica que auxilia na prevenção e /ou tratamento de metástases do cancro do pâncreas.

epitelial-mesenquimal-a transição (EMT), o processo de células perder o seu fenótipo epitelial e adquirir um fenótipo mesenquimal migratório, foi aceite a desempenhar um papel importante na metástase do câncer em várias neoplasias humanas, incluindo câncer de pâncreas [5], [6]. EMT tem sido mostrado para afetar negativamente a sobrevida global dos pacientes com câncer pancreático [7]. Além disso, EMT contribui para a resistência às drogas em câncer pancreático [8]. Assim, a inibição da EMT em células de câncer de pâncreas pode facilitar o desenvolvimento de uma estratégia eficaz na prevenção e /ou tratamento de câncer pancreático metastático.

A evidência crescente sugere que algumas ervas medicinais chinesas, tais como

Coptis chinensis

(Huang lian),

Scutellaria baicalensis

(Huang Qin),

Camellia sinensis

(Lu cha),

Wedelia chinensis

(Peng qi ju) e Songyou Yin (um composto à base de plantas chineses), contendo alguns compostos bioactivos ou uma variedade de fitoquímicos, podem inverter EMT e reduzir a metástase [9] – [13]. Assim, estas ervas podem ser utilizados como tratamentos complementares e alternativos e /ou como terapia adjuvante para terapias citotóxicas convencionais. QYHJ, uma fórmula medicinal chinesa sete erva e usada para o cancro do pâncreas na China, foi mostrado para inibir o crescimento de tumores e metástases em ratinhos nus com xenoenxertos de cancro do pâncreas de células [14] – [16]. Além disso, QYHJ combinada com a medicina ocidental convencional tem sido mostrado para prolongar o tempo de sobrevivência em doentes com metástases hepáticas de cancro pancreático [17]. No entanto, o mecanismo molecular subjacente permanece obscura.

Aqui, demonstramos que QYHJ inibe o crescimento de tumores e metástases em ratinhos nus com xenoenxertos de células de cancro pancreático. Os resultados indicaram que QYHJ inibiu a inflamação relacionada com o cancro nos tumores através da diminuição da infiltração de macrófagos associados a tumores e a produção de IL-6, que em última análise diminuiu EMT e invasão celular. Portanto, os achados sugerem que QYHJ é capaz de inibir a invasão de células do cancro do pâncreas e metástase no câncer pancreático humano em parte, invertendo a inflamação-sustentável tumor.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Todas as experiências com camundongos foram conduzidos de acordo com as orientações dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório. O protocolo do estudo foi também aprovado pela Comissão sobre o Uso de Animais Vivos em Ensino e Pesquisa da Universidade Fudan, de Xangai. Durante o estabelecimento de um modelo de metástase hepática e um modelo ortotópico de câncer pancreático, anestesiaram-se os ratos com 3% de pentobarbital sódico (40 mg /kg) e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

linhas de células e ratos

a linha de células de cancro pancreático humano BxPC3 foi obtido a partir da American Type Culture Collection. SW1990HM, uma linha de carcinoma pancreático humano altamente metastático, foi subclonado a partir de SW1990 pelo nosso grupo [18]. Todas as células foram cultivadas em cultura em soro fetal de vitelo RPMI1640 /10% e mantidas numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera a 37 ° C. Todas as linhas celulares foram regularmente autenticado, verificando a sua morfologia e testado quanto à ausência de contaminação por micoplasma (MycoAlert, Lonza, Rockland, ME, EUA).

fêmea BALB /c-nu /nu nu idade 4 -6 semanas foram obtidos do Instituto de Shanghai de Materia Medica, Academia chinesa de Ciências (Xangai, China), e alojados em cabines de fluxo laminar sob condições específicas livres de patógenos e fornecidos com comida e água

ad libitum

.

medicamentos e reagentes

QYHJ, uma fórmula medicinal chinesa de sete ervas, composto

Scutellria barbata

(Ban zhi lian),

Heydyotis diffusa

(Bai hua ela ela cao),

Amorphophallus kiusianus

(ela liu gu),

Coix lacryma-jobi

(Yi s),

Gynostemma pentaphyllum

(Jiao gu lan),

Ganoderma luncidum

(Ling zhi) e

Amomum cardamomum

(Bai dou Kou). QYHJ foi preparado como previouly decribed [14] – [16]. Resumidamente, os pós de fórmula QYHJ foram produzidos por Jiang-yin Tianjiang Pharmaceutical Co, Ltd. A fim de assegurar a padronização e manter a fiabilidade dos interbatch QYHJ, uma cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de impressão digital cromatográfica foi desenvolvido para o seu controlo de qualidade. Os cromatogramas de impressões digitais de fórmula QYHJ foi mostrado na Figura S1. A decocção final QYHJ foi preparado por dissolução do pó de ervas em água destilada para a concentração requerida. A dosagem diária para ratinhos nus foi de 18 g /kg, calculada de acordo com a seguinte fórmula de ratinho-humano de transferência db = Da × (Rb /Ra) × (Wb /Wa) 2/3, em que D, R, e W representam de dosagem, o coeficiente de forma e peso do corpo, respectivamente, e a e b representam humano e de ratinho, respectivamente. Humano recombinante de interleucina-6 (IL-6) foi obtido a partir de R D Systems (R D Systems) e dissolvida em PBS estéril contendo 2% de albumina de soro bovino (BSA). Foram utilizados os seguintes anticorpos: de coelho anti-E-caderina, anti-vimentina, anti-N-caderina e Slug-anti (Cell Signaling Technology, Beverly, MA); de coelho anti-CD68 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); de cabra anti-IL-6 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA); GAPDH (Epitomics, Burlingame, CA).

Criação de uma metástase Modelo fígado em ratinhos nus

Um modelo de metástases hepáticas do câncer de pâncreas foi estabelecido como descrito anteriormente [18]. Resumidamente, foram anestesiados ratos nus com hidrato de cloral; o baço foi exposta; e células de cancro pancreático SW1990HM (5 × 10

6 /0,2 mL de PBS) foram injectadas no baço, utilizando uma seringa. O baço foi retornado para o abdómen, e a ferida foi fechada em uma camada com grampos de sutura. Seis semanas após a injecção, os ratinhos foram examinados grosseiramente na necropsia para metástases hepáticas. Em seguida, avaliou-se a metástase do tumor através da contagem do número de colónias metastáticas em uma secção histológica da porção média de cada amostra de fígado de cada murganho e por determinação da relação entre a área metastático à área total em cortes histológicos da porção média de cada hepática [19], [20] .O metastático à relação da área total foi calculada usando o Adobe Photoshop versão 7.0 (Adobe Systems) e software ImageJ versão 1.29 (National Institutes of Health), e os resultados são expressos em percentagens.

ortotópico modelo de câncer pancreático

O modelo ortotópico de câncer de pâncreas foi estabelecido como descrito anteriormente [21]. Resumidamente, 2 × 10

6 SW1990HM células cancerígenas pancreáticas por animal em 100 ul de solução salina tamponada com fosfato foram injectadas por via subcutânea no flanco esquerdo de um ratinho nu. Os tamanhos dos tumores foram medidos 3 vezes por semana utilizando um paquímetro. Quando os tumores crescidos subcutaneamente atingiram um tamanho de 0,5 a 1 cm

3, eles foram removidos assepticamente dos ratinhos e transferidos para placas de Petri contendo 10 ml de solução salina tamponada com fosfato. Macroscopicamente áreas vitais do tumor foram cortadas em 1 mm

3 peças utilizando um bisturi. Os ratos foram então anestesiados com pentobarbital de sódio a 3% (40 mg /kg) e todos foram feitos esforços para minimizar o sofrimento. Uma pequena incisão transversal foi criado no flanco abdominal esquerdo, e o pâncreas foi cuidadosamente exposto. Um bolso de 2 a 3 mm foi preparado na cauda do pâncreas, usando a veia grande do baço como uma estrutura principal, e foram inseridas peças tumorais. O pâncreas foi então reinserido no abdômen e na parede abdominal foi fechada com 6-0 não absorvíveis.

ensaio imunoenzimático (ELISA) ligado a enzima

As concentrações de soro de IL-6 e TNF-α foram medidos utilizando um ELISA. A amostra de sangue foi armazenada a temperatura ambiente durante 30 min, centrifugadas (12000 x g) durante 15 minutos, e, em seguida, criopreservado a -80 ° C. As concentrações de IL-6 e TNF-α foram medidos utilizando um kit ELISA de sanduíche (DuoSet; R D Systems, Minneapolis, MN, EUA)

A imuno-histoquímica e imunofluorescência

A imuno-histoquímica (IHC. ) foi realizada como descrito anteriormente [19]. Resumidamente, as amostras de tecido de tumor foram fixados em formalina a 10% e embebidos em cera de parafina. seções 3 mícrons sem corante foi então cortado a partir dos blocos de parafina para análise IHC. As secções foram coradas com anticorpo de coelho anti-vimentina (1:200) e de coelho anti-E-caderina (1:100) e de coelho anti-CD68 (1:200) a 4 ° C durante a noite. O anticorpo secundário e método do complexo avidina-biotina peroxidase foi utilizado de acordo com os protocolos padrão fornecidos pelo fabricante (Vector Laboratories, CA). Um controle de imunoglobulina-negativo foi usada para descartar a ligação não específica. Os procedimentos foram realizados por dois investigadores independentes (PW e JZ) e um patologista (JF), os quais foram cegos para o tipo de modelo /tratamento para a série de espécimes. Para avaliar quantitativamente TAM infiltração em cada grupo, calculou-se a relação entre a área que foi positivo para a coloração CD68 à área total dos cortes histológicos de dez campos capturados usando microscopia de luz (200 ×). E-caderina e vimentina foram determinados de acordo com nosso relatório anterior [16].

Para imunofluorescência de coloração, células e lâminas foram fixadas com paraformaldeído 4% e 10% de formalina, respectivamente. Os slides foram tratados com 10 mM de tampão de citrato (pH 6,0) para a recuperação de antigénio, de acordo com as instruções do fabricante. As células ou lâminas foram então incubadas durante a noite com anti-vimentina (1:200), anti-caderina-E (1:100), anti-CD68 (1:200) e anti-IL-6 (1:200) a 4 ° C durante a noite. As células ou lamelas foram então incubadas com anticorpo secundário conjugado com fluorescência durante 1 h. Finalmente, as células foram lavadas e montadas com meio de montagem contendo DAPI (Vector Laboratories). Um controlo negativo em que o anticorpo primário foi omitido foi utilizado para testar a especificidade do anticorpo. As imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência confocal Leica.

Análise Western Blot

análise de Western blot foi realizada tal como descrito em nosso relatório anterior [19]. Resumidamente, as proteínas foram extraídas a partir de células cultivadas e quantificadas com o kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL, EUA) utilizando BSA como um padrão. Quantidades iguais de proteína de células diferentes foram separadas utilizando 10% de SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad). As membranas foram bloqueadas com leite não gordo a 5% e incubadas com os anticorpos primários. As proteínas alvo foram detectadas utilizando um kit de quimioluminescência aumentada (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia).

fecho da ferida Assays

ensaios de encerramento de feridas foram realizados como previamente descrito [19]. As células foram plaqueadas em placas de 6 poços. A monocamada de células foi ferido por desenhar manualmente um sulco através da monocamada com uma ponta de pipeta 1-10-ul. O meio de cultura de células foi então substituído com meio fresco, 100 ng /mL de IL-6 ou do veículo foi adicionado como requerido, e o fechamento da ferida foi monitorizada a 48 h, usando microscopia de contraste de fase. Após o ferimento, a área da ferida foi quantificada usando o Image J versão 1.29 (National Institutes of Health) software. Os experimentos foram realizados em duplicado.

Invasion Ensaio

celular invasão foi determinada utilizando câmaras de invasão de Matrigel (membrana Matrigel-revestido, BD Biosciences). As células (1,0 x 10

4) foram semeadas em meio isento de soro na câmara superior e deixou-se invadir para o 10% de FCS presente na câmara inferior como um quimioatractor. Após 48 h, as células que tinham viajado através e aderidas ao lado inferior da membrana foram contadas como descrito previamente [19].

Análise estatística

Os dados são expressos como a média ± desvio padrão ( SD). As análises estatísticas foram realizadas utilizando análise de variância modelos (ANOVA) e teste t de Student. Um valor de P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote de software SPSS 15.0.

Resultados

QYHJ Suprime fígado metástase de câncer no pâncreas humano in vivo

Em primeiro lugar, confirmou a eficácia do QYHJ em suprimindo metástases hepáticas de câncer pancreático. Ratinhos nus foram inoculados intrasplenically com a linha celular de cancro pancreático humano SW1990HM e divididos aleatoriamente para o QYHJ ou o grupo de controlo. Uma semana após a randomização, os ratos no grupo QYHJ foram tratados oralmente com QYHJ (0,2 ml, sonda, diariamente), enquanto os ratinhos do grupo de controlo recebeu solução salina normal como controlo, durante 4 semanas (dias 7-35). Seis semanas após a injecção, os ratinhos foram sacrificados e os seus fígados colhidos. Tanto o QYHJ- e células tratadas com controlo de tumores formados quando implantado no baço, mas os ratinhos tratados com QYHJ desenvolveram significativamente menos metástases do fígado do que aqueles tratados com o controlo de solução salina normal. Além disso, os ratinhos tratados com QYHJ exibido menos colónias metastáticas e uma diminuição metastático a razão da área total (Figuras 1A e B). Juntos, estes resultados indicam que QYHJ poderia suprimir metástase hepática em câncer pancreático humano.

A. Um modelo de metástases do fígado foi determinado como descrito em Materiais e Métodos. Os ratinhos receberam um tratamento de 28 dias de QYHJ ou solução salina normal como controlo. Os ratinhos foram sacrificados 6 semanas após a injecção, e os fígados foram colhidas. fígados representativos de ratos sem pêlo são mostrados. H E de coloração foi realizada em secções de tumores metastáticos (M) e fígado (N) de tecidos normais. Os nódulos metastáticos são indicados por setas. n = 6 por grupo. ampliação original, × 200. B. metástases hepáticas foram quantificadas por contagem do número de colónias metastáticas em uma secção histológica da porção média de cada amostra de fígado de cada murganho e por determinação da relação da metastático à área total em cortes histológicos da porção média cada fígado. O teste t de Student foi utilizado para determinar a significância estatística.

QYHJ inibe o crescimento de tumores de pâncreas humano em um Nude Modelo rato ortotópico

Temos demonstrado que o tratamento com QYHJ reduz metástases hepáticas em camundongos nus inoculados intrasplenically com células de câncer pancreático humano. Nós estendemos este trabalho para obter esclarecimentos adicionais sobre os efeitos da QYHJ no tumor primário no pâncreas e na metástase hepática. Os ratinhos nus receberam implantes com fragmentos de tumor pancreático e, em seguida, foram divididos aleatoriamente em dois grupos: um grupo recebeu QYHJ e o outro recebeu solução salina normal como controlo. O tratamento foi administrado durante 28 dias (Figura 2A). Os tumores no pâncreas foram identificados em 8 de 10 ratinhos (80%) em ambos os grupos. metástases hepáticas não eram aparentes em ambos os grupos, devido às “sementes e do solo” interações do tipo específico de células que regulam a cronologia e os locais de alvos metastáticos e ao curto período de observação [22]. No entanto, QYHJ inibiu significativamente o crescimento de tumores pancreáticos humanos num modelo ortotópico de ratinhos nus (Figura 2B). O peso médio do tumor foi de 0,90 ± 0,25 g no grupo de controlo e 0,51 ± 0,28 g no grupo QYHJ (P = 0,036) (Figura 2C). Além disso, apareceu QYHJ para desacelerar a perda de peso corporal em ratinhos nus que foram induzidas pela carga tumoral, embora esta diferença não foi significativa (Figura 2D). Estes resultados sugerem que QYHJ pode inibir câncer pancreático em um modelo de ratinho nu ortotópico.

A. Fluxograma da documentação técnica de tratamento experimental. B-D. Modelos ortotópicos de cancro pancreático foram estabelecidas como descrito em Materiais e Métodos. Três dias pós-estabelecimento, os ratinhos foram tratados oralmente com ou sem QYHJ durante 28 dias, e, em seguida, os tumores foram removidos e pesados. De fotografias de tumores transplantados ortotópicos de ambos os grupos são mostradas na B. O tumor pesos são mostrados em C, e o peso corporal dos ratinhos em ambos os grupos é mostrado em D. N = 10 por grupo. O teste t de Student foi utilizado para determinar a significância estatística.

QYHJ Inibe a EMT de células do cancro do pâncreas

EMT, um programa de desenvolvimento em que as células epiteliais adquirem uma morfologia de células fusiformes e exibem motilidade celular, tem sido proposto como um pré-requisito para a invasão e disseminação de células de carcinoma e como um precedente para a formação de câncer de pâncreas e metástase [6], portanto, medimos a expressão da grande marcador epitelial e-caderina e os marcadores mesenquimais vimentina, N-caderina e Slug nos tecidos tumorais de os dois grupos. Imunoistoquímica e /ou análise de Western blot revelou que o tratamento de QYHJ induziu a expressão de E-caderina, e suprimido a expressão de vimentina, N-caderina e o Slug factor de transcrição (Figura 3). Estes dados sugerem que QYHJ poderia inibir EMT em células de cancro pancreático humano.

A. H E de coloração e coloração IHC com anticorpos anti-Ecadherin e anticorpos anti-vimentina foram realizadas utilizando secções de tumores transplantados ortotópicos. N, tecido de pâncreas normal; T, tumor. ampliação original, × 200. análise de mancha ocidental B. foi utilizado para medir a expressão dos marcadores relacionadas EMT-E-caderina, N-caderina, vimentina e Slug em células derivadas de três amostras de xenoenxerto representativos de cada grupo. As intensidades das bandas foram medidos por densitometria e a expressão da proteína indicada relativa foi mostrado (inferior).

A inflamação relacionada ao câncer QYHJ Suprime no cancro do pâncreas

Vários estudos têm indicado que Câncer inflamação relacionada promove o desenvolvimento de tumores [23], [24]. Além disso, algumas citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-8, IL-6 e TNF-a, ter mostrado activar EMT e, finalmente, para facilitar a invasão de células e metástase [25] – [29]. Portanto, utilizou-se um ensaio de imunossorvente ligado a enzima para examinar os níveis séricos das duas citocinas pró-inflamatórias de IL-6 e TNF-α em ratinhos nus. Séricos de IL-6 níveis foram mais baixos nos ratos tratados com QYHJ (15,50 ng /L ± 4,49 ng /L) em comparação com os que receberam o tratamento de controlo (29,06 ng /L ± 6,99 ng /L, P 0,01). Além disso, no soro de TNF-α foi diminuída após o tratamento com QYHJ (19,94 ± 3,55 ng /L vs 29,50 ± 5,09 ng /L, P 0,01) (Figura 4A). Estes dados demonstram que QYHJ diminuiu a produção de citocinas pró-inflamatórias. infiltração de leucócitos é observado na maioria dos tumores e está envolvido na invasão tumoral e metástase [30]. macrófagos associados a tumores (TAMs) são um componente importante do infiltrado de leucócitos [31]. infiltrados TAM foram mostrados para correlacionar com a progressão do tumor e um mau prognóstico em pacientes com câncer [32], [33]. Descobrimos que a infiltração pela TAM foi bloqueada por QYHJ (Figura 4B). Além disso, QYHJ diminuiu a expressão de IL-6 na TAM (Figura 4C). Tomados em conjunto, estes resultados mostraram claramente que QYHJ reduziu a infiltração TAM e inibiu a IL-6 expressão, eventualmente, suprimir a inflamação relacionada ao câncer.

A. Um modelo ortotópico de ratinhos nus foi criada e tratada com QYHJ ou veículo, tal como descrito acima. O sangue foi recolhido de cada ratinho, e as concentrações no soro das citoquinas pró-inflamatórias de IL-6 e TNF-alfa foram detectadas por ELISA. O teste t de Student foi utilizado para determinar a significância estatística. B. A fim de avaliar a infiltração TAM, CD68 coloração foi realizada utilizando IHC. ampliação original, de 200 ×. TAM infiltração foi avaliada quantitativamente por cálculo da razão da área de CD68-positivo para a área total de cada campo, e o valor médio de dez campos inferiores a 200 × microscopia foi determinada. * P 0,05. A microscopia confocal C. de tecidos de câncer de pâncreas tratados com anti-CD68 (vermelho) e anti-IL-6 (verde). os núcleos das células foram contrastadas com DAPI.

IL-6 induz o cancro do pâncreas celular EMT

Para confirmar ainda mais a correlação entre EMT e do microambiente inflamatório tumor, foram avaliados os efeitos da IL 6 em células de câncer pancreático EMT

em

vitro

. SW1990HM, que exibiu um nível elevado de expressão de vimentina, e BxPC3, que exibiu um nível elevado de expressão de E-caderina, foram tratados com IL-6 recombinante humana. IL-6 de tratamento resultou num aumento da expressão de vimentina em células SW1990HM e diminuição da expressão de E-caderina nas células BxPC3, tal como detectado por immunocytofluorescence (Figura 5A). Estes resultados foram confirmados por análise de Western blot (Figura 5B). Portanto, nossos resultados indicaram que o excesso de produção da citocina pró-inflamatória IL-6 promovido EMT de células de câncer pancreático.

A. As células de cancro do pâncreas e SW1990HM BxPC3 foram tratados com IL-6 (100 ng /mL) durante 24 h. As células foram então coradas para detectar a E-caderina e vimentina (verde). os núcleos das células foram contrastadas com DAPI. ampliação original, × 200. células cancerosas B. pancreático foram tratados com IL-6 (100 ng /mL) durante 24 h. A proteína total foi extraída, e a expressão de E-caderina e vimentina foram detectados por Western blotting. GAPDH foi utilizado como um controlo de carga.

IL-6 promove a migração celular cancro do pâncreas e Invasion

Os efeitos da IL-6 sobre a migração celular foram investigados usando uma cicatrização de feridas ensaio. Os resultados mostraram que mais células se mudou para dentro da ferida no zero da IL-6 de células tratadas em comparação com as células que não receberam tratamento com IL-6 em ambas as linhas celulares (Figura 6A). Para examinar a capacidade de invasão das células de câncer de pâncreas tratados com IL-6, foi realizada uma

in vitro

ensaio de invasão usando uma câmara de Transwell revestido com matrigel. Conforme esperado, IL-6, o tratamento resultou no aumento da invasão de células

In vitro

em ambas as linhas celulares (Figura 6B). Estes resultados, combinados com a observação de que a IL-6 induzida EMT de células de câncer pancreático indicou que a inflamação relacionada ao câncer foi associada a um aumento da capacidade de EMT e invasão (Figura 7).

A. taxas de migração de células de células de cancro do pâncreas tratados com IL-6 (100 ng /ml) ou apenas veículo foram comparadas por meio de ensaios de cura de feridas. observações microscópicas foram registados a 48 horas após a arranhar a superfície de uma camada confluente de células. O asterisco indica a ferida estava completamente curada. B. A capacidade invasiva de células de cancro do pâncreas tratados com IL-6 (100 ng /ml) ou apenas veículo foram comparadas usando ensaios de invasão de Matrigel. Os números de células que viajou através da membrana foram contadas em 10 campos sob uma lente objectiva 20 x. ampliação original, × 200. Os resultados representam as médias ± desvio padrão de valores obtidos em três experiências independentes. A significância estatística foi calculada usando o teste t de Student.

QYHJ como alvo a inflamação relacionada ao câncer no câncer de pâncreas através de uma diminuição TAM infiltração e produção de IL-6. Porque IL-6 pode promover a migração de células cancerosas e invasão através da indução de EMT, a supressão da inflamação relacionada ao câncer por QYHJ pode inibir a invasão de células de câncer pancreático e metástase.

Discussão

A apresentam resultados demonstraram que a medicina tradicional chinesa base de plantas QYHJ pode inibir a invasão de células do cancro pancreático e metástases através da supressão da inflamação relacionada com o cancro, em particular a redução da IL-6 derivada de TAM. Estas descobertas estendem nossas observações anteriores sobre a importância do microambiente do tumor como um alvo chave da medicina tradicional chinesa.

Medicina Tradicional Chinesa (MTC), que se baseia em uma teoria única e experiência prática solitária prazo, é muito popular na China. Tem sido relatado que 90% dos doentes com cancro chineses modernos receberam algum tipo de TCM durante o seu regime de tratamento [34]. As taxas de TCM utilizados por prestadores de cuidados de saúde e dos interesses dos doentes fora da China continuam a subir anualmente, especialmente no campo da oncologia [35]. Aplicação de TCM como uma terapia adjuvante do cancro tem sido relatado para aumentar a eficácia de ambos quimioterapia e radioterapia e para ajudar a reduzir os efeitos adversos de cada tratamento [36], [37]. Além disso, os medicamentos chineses de plantas utilizadas na medicina tradicional chinesa, foram recentemente reconhecido como uma importante fonte de novo o desenvolvimento de drogas, incluindo drogas anti-câncer [38], [39]. No presente estudo, confirmamos que QYHJ inibiu a metástase em câncer pancreático; No entanto, os mecanismos subjacentes permanecem obscuros.

Estudos recentes confirmaram que a inflamação relacionada ao câncer afeta muitos aspectos de malignidade, incluindo a proliferação e sobrevivência de células malignas, a angiogênese, metástases, ea resposta ao tratamento [24]. células inflamatórias promotoras de tumores incluem os subtipos de macrófagos, mastócitos e neutrófilos, assim como linfócitos T e B. Os macrófagos constituem o principal componente do infiltrado celular imunitária observada em praticamente todas as doenças malignas [31]. Admite-se que, em geral, e do programa Câncer sinais derivados da célula hospedeira macrófagos para adquirir um M2-polarizado e como fenótipo tumoral em contrário-suporte [40]. Em muitos casos, os números elevados de TAM estão associadas a um prognóstico pobre, [33] [32]. TAM podem libertar factores de crescimento (e.g., TGF-β), factores pró-inflamatórias (e.g., IL-6) e de enzimas (por exemplo, MMP2, MMP9) que promovem a angiogénese, tumorigénese, e metástase [24]. Todos estes factores ou enzimas podem promover EMT. Por exemplo, as citocinas pro-inflamatórias TNF-α, IL-6 e IL-8 pode induzir EMT e promover a metástase do cancro [25] – [29]. Além disso, uma investigação clínica confirmou que estas citocinas foram significativamente elevados em pacientes com câncer de pâncreas e foram associados com um prognóstico pobre [41]. Por conseguinte, as drogas que têm como alvo a inflamação relacionada com cancro têm o potencial para reeducar um infiltrado inflamatório indutor de tumores ou para impedir que tais células de migrarem para o local do tumor. No presente estudo, mostramos que QYHJ reduzida TAM infiltração e efetivamente inibidos várias citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α e IL-6, que sugeriu que QYHJ poderia inibir a inflamação relacionada ao câncer no câncer de pâncreas.

durante o processo de EMT, sinais extrínsecos activar a transcrição intrínseca factores de caracol, Slug, torção e ZEB1, que reprimem a expressão de e-caderina e promover a expressão da vimentina e N-caderina, de tal modo que as células mudam de um fenótipo epitelial polarizada para um fenótipo mesenquimal migratório [42]. As células de carcinoma “EMTed” são pensados ​​para ser responsável por semear disseminação à distância, acabou levando a mortalidade relacionada com o cancro [5], [7]. Portanto, a hipótese de que QYHJ inibe a metástase de células de câncer de pâncreas, potencialmente, suprimindo EMT. Como esperávamos, nossos resultados confirmaram que o tratamento QYHJ resultou em aumento da expressão da caderina-E e diminuição da vimentina, N-caderina e Slug, que indicou que QYHJ inibiu EMT de células e suprimiu a invasão da célula.

IL-6 , que é produzida principalmente por células mononucleares, macrófagos e uma menor percentagem de fibroblastos, células endoteliais, linfócitos T e B, condrócitos e células âmnio [43], é uma citoquina pleiotrópica que faz com que a carcinogénese, promove o crescimento do tumor e facilita a metástase de células tumorais [ ,,,0],25] – [27]. Evidências sugerem que a IL-6 é frequentemente elevado e, portanto, está associado a um mau prognóstico em muitos tipos de cancro, incluindo o cancro do pâncreas [44], [45]. Além disso, novas terapias enfocadas IL-6 estão actualmente em ensaios clínicos [46]. Uma vez que foi demonstrado que a TAM QYHJ reduzida infiltração e efectivamente inibiu a produção de IL-6, que procurado para confirmar se a redução da produção de IL-6 foi relacionada com a supressão da capacidade invasiva e EMT de células.