Abstract

Fundo

O regulamento aberrante de phosphatidylinositide 3-cinases (PI3-K) /proteína quinase Akt, AMP-ativada (AMPK) e alvo da rapamicina em mamíferos (m-TOR ) vias de sinalização no cancro levou um interesse significativo na supressão destas vias para tratar o câncer. O ácido cafeico (CA) tem sido relatado possuir acções anti-inflamatórias importantes. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais os derivados de CA, incluindo éster de fenetilo ácido cafeico (CAPE) e fenilpropilo éster de ácido cafeico (CAPPE), exercem efeitos inibidores sobre a proliferação de células de cancro colo-rectal humano (CRC) ainda não foram elucidados.

Metodologia /Principais achados

CAPE e CAPPE foram avaliados quanto à sua capacidade de modular estas vias de sinalização e suprimir a proliferação de células CRC tanto

in vitro

e

in vivo

. efeitos anti-câncer destes derivados CA foram medidos utilizando ensaios de proliferação, análise do ciclo celular, ensaio de western blot, ensaio de gene repórter e imuno-histoquímica (IHQ) ensaios de coloração tanto

in vitro

e

In vivo

. Este estudo demonstra que a capa e CAPPE exibem uma inibição dependente da dose da proliferação e sobrevivência de células de CRC através da indução de G

0 /L

uma paragem do ciclo celular e aumento de vias apoptóticas. O consumo de CAPE e CAPPE inibiu significativamente o crescimento de tumores colorretais em um rato modelo de xenotransplante. Os mecanismos de ação incluiu uma modulação da PI3-K /Akt, AMPK e m-TOR cascatas de sinalização tanto

in vitro

e

in vivo

. Em conclusão, os resultados demonstram mecanismos anti-câncer inovadoras de derivados CA contra o crescimento de células CRC humanos.

Conclusões

derivados CA são agentes anti-câncer potentes que aumentam a ativação da AMPK e promover a apoptose em células de CRC humanos. A estrutura dos derivados da CA podem ser utilizados para o desenho racional de novos inibidores que têm como alvo células de CRC humanos

citação:. Chiang e-PI, Tsai SY, Kuo YH, Pai MH, Chiu HL, Rodriguez RL, et ai. (2014) Derivados de ácido caféico inibir o crescimento de cancro do cólon: Envolvimento da PI3-K /Akt e AMPK vias de sinalização. PLoS ONE 9 (6): e99631. doi: 10.1371 /journal.pone.0099631

editor: Chih-Pin Chuu, Institutos Nacionais de Pesquisa em Saúde, Taiwan

Recebido: 03 de julho de 2013; Aceito: 16 de maio de 2014; Publicação: 24 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chiang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este material é baseado no trabalho apoiado, em parte, pelo Ministério da Educação, Taiwan, ROC no âmbito do plano ATU, concessão Conselho Nacional de Ciência, no âmbito de acordos NSC-100-2320-B-039-003, 100-2628-B005-002-MY4, 101-2320-B-039-054-MY3, 101-2320- B-005-006-MY3, 102-2911-I-005 -301, 101-2811-B-039-024, o Departamento de Saúde Grant no âmbito de acordos DOH 102-TD-B-111-004 e DOH-102- TD-C-111-005 e China Medical University (CMU) conceder ao abrigo de acordos CMU101- Award -10, CMU100-Asia-11, CMU101-Ásia-3, e CMU101-S-25. Todas as opiniões, conclusões, conclusões ou recomendações expressas nesta publicação são de responsabilidade do autor (es) e não refletem necessariamente a opinião do Ministério da Educação, Conselho Nacional de Ciência, Departamento de Saúde, Universidade Nacional Chung Hsing, Taipei Medical University , Universidade Ásia, University of California Davis e da China Medical University. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de câncer e mortalidade por câncer em muitos países [1], [2]. Nos Estados Unidos sozinho, cerca de 50.000 mortes são atribuídas a esse tipo de câncer por ano [1], [2]. Muitos estudos têm indicado que as mutações do phosphatidylinositide 3-quinase (PI3-K) /Akt e cinase de proteína activada por mitogénio (MAPK) /extracelular-sinal-regulado quinase moléculas (ERK), são frequentemente observados em vários tipos de cancro [3] , [4]. Por exemplo, a activação oncogénica de moléculas de PI3-K /Akt aumenta a proliferação de células, aumentando o nível de ciclina D1 [5], [6]. É bem conhecido que a expressão aberrante das proteínas ciclina D1 e Cdk4 está envolvida na proliferação de células de CRC [7]. Supressão da PI3-K /Akt e vias de sinalização /ERK MAPK conduz ao bloqueio da proliferação celular e demonstra a importância destas cascatas de sinalização no controlo tanto a progressão do ciclo celular e crescimento celular durante o desenvolvimento do cancro [4], [8] . Por conseguinte, as vias de MAPK /ERK sinalização de PI3-K /Akt e desempenham um papel predominante na determinação do destino de crescimento do tumor. células cancerosas malignas destacam do tumor primário e migrar através de barreiras estruturais, incluindo membranas basais e matriz extracelular estromal circundante (ECM) [9]. invasão tumoral e metástase ambos requerem um aumento da expressão das metaloproteinases da matriz (MMPs) e a degradação da ECM [9], [10]. As MMPs são endopeptidases dependentes de zinco capazes de componentes ECM degradantes [11]. Enzimas tais como a MMP-9 ECM degradar e criar um microambiente que mantém o desenvolvimento de tumores [10], [11].

da proteína quinase ativada por AMP (AMPK) é uma molécula de detecção de combustível que funciona como um regulador de balanço de energia [12]. AMPK tem sido mostrado para ser expressa ubiquamente em células de mamífero e para ser envolvida na homeostase de energia [13]. Um aumento do monofosfato de adenosina (AMP) /trifosfato de adenosina (ATP) relação, o que reflecte uma diminuição no estado de energia da célula, leva à activação da proteína AMPK por fosforilação [14]. O aumento da activação de AMPK é pensado para ser inversamente correlacionadas com o risco de cancro [15]. Estudos recentes sugeriram ainda que a activação da PI3-K /Akt e MAPK /ERK moléculas de sinalização está associada com uma diminuição do nível de fosforiladas AMPK (activado), no decurso da progressão do tumor [16], [17]. Estudos adicionais concluir-se que os agonistas de AMPK são eficazes no tratamento do cancro [15], [18], enquanto que outros estudos mostraram que a síntese de ácidos gordos enzima lipogénica (FASN) é regulado pela ingestão de energia e desempenha um papel crucial na carcinogénese [19] . Um estudo recente relatou que a expressão FASN está correlacionada com o crescimento e a progressão da CRC [20]. A fosforilação (ou seja, a activação) da Akt foi mostrado para induzir a expressão de FASN e para desencadear malignidade agressivo em células cancerosas [21]. Em contraste, o tratamento com um agonista de AMPK, levando à activação de AMPK, suprimiu a expressão de FASN e bloqueou o crescimento do tumor colorrectal [22] – [24]. Além disso, estudos epidemiológicos indicaram ainda que a AMPK (PRKAG2) polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) está associada com o risco de CRC humana [25]. Assim, a homeostase de energia mediada por AMPK tem atraído um interesse nesta via como um meio de tratamento de cancro do cólon humano.

Muitos estudos têm demonstrado que a função compostos de ácido fenólico como antioxidantes potentes [26]. Entre eles, o ácido caféico (CA) é um composto fenólico não-vitamina encontrada em grande parte em vegetais e frutas. Em adição à sua actividade antioxidante, CA exerce efeitos anti-inflamatórios em diversos tipos de células [27], [28]. Estudos recentes indicaram que éster fenetil ácido cafeico (CAPE), um derivado CA naturalmente isolado de própolis de abelhas, também exerce seus efeitos benéficos através de atividades antioxidantes e anti-inflamatórias [29], [30]. Além disso, foi demonstrado que Cabo inibe a proliferação de células cancerosas e agir como um potencial agente anti-cancro [31], [32]. No entanto, não há nenhum relatório dos efeitos inibidores dos derivados da CA no percurso AMPK e /ou expressão FASN durante a progressão da CRC. Além disso, a falta de resultados consistentes em numerosos estudos e a incapacidade de determinar o mecanismo de acção dos derivados de CA pode explicar a dificuldade em demonstrar o

In vivo Os benefícios de CA suplementação derivado contra CRC. Nós investigamos, portanto, os efeitos inibitórios de vários derivados CA em células CRC humanos tanto

in vitro

e

in vivo

. Os resultados demonstraram que os derivados CA como Cabo e éster de fenilpropil ácido caféico (CAPPE) proliferação celular significativamente inibida em células CRC humanos. CAPE e CAPPE induzida paragem do ciclo celular através da supressão das PI3 K-/Akt e mTOR vias de sinalização. Além disso, os derivados de CA reduziu os níveis de ATP celular e expressão suprimida FASN. O mecanismo de ação foi associada, em parte, com um aumento da via AMPK. Os resultados deste estudo sugerem que os derivados CA atuar como agentes quimiopreventivos contra CRC humana, modulando as vias de sinalização da PI3-K /Akt, mTOR e AMPK tanto

in vitro

e

in vivo

.

Materiais e Métodos

Reagentes e anticorpos

células cancerígenas do cólon humano HCT-116 e SW-480 foram comprados da American Type Culture Collection (Walkersville, MD). Os anticorpos monoclonais seguintes foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology, Inc .: Anti-N-caderina (# 4061), PTEN (# 9559), PDK1 anti-fosforilação (Ser241; # 3061), o total de-PDK1 (# 3062), anti -phosphorylation Akt (S473; # 4060), o total-Akt (# 9272), anti-fosforilação GSK3α (S21; # 9327), total- GSK3α (4337), anti-fosforilação GSK3β (S9; # 9323), total- GSK3β (# 9315), FOXO3 anti-fosforilação (T32; # 9464), FOXO3 total- (# 12829), TSC1 total- (# 6935), TSC2 total- (# 3990), LKB1 total- (# 3047), total- 14-3-3 (# 8312), anti-fosforilação ERK 1/2 (T202 /Y204; # 9101), o total-ERK 1/2 (# 9102), anti-fosforilação AMPKα (T172; # 2535), total- AMPKα (# 5832), m-TOR anti-fosforilação (S2448; # 5536), o total de m-TOR (2983), anti-FASN (# 3180), anti-NF-kB (p65) (# 3033), anti -Cdk4 (# 2906), anti-p21

WAF /CIP1 (# 2947), anti-ciclina e (# 4132), anti-ciclina D1 (# 2978), anti-c-myc (# 9402) e anti -Lamin A (# 2032) (Danvers, MA). O anti-β-actina (# A2066) anticorpo e o composto C (inibidor específico da AMPK) foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO). A Akt ativa (Myr-Akt1, Addgene plasmídeo # 9008) e controlar vector vazio (pcDNA3, Addgene plasmídeo # 10792) foram obtidos a partir Addgene. A necrose tumoral α (TNF-α) proteína recombinante foi de R D System (Minneapolis, MN). O Kit Extracto Reagente proteína nuclear foi adquirido a partir de Pierce Biotechnology Inc. (Lackford, IL). O kit de ensaio de detecção de luminescência de ATP (kit ATPLite) foi comprado de Perkin Elmer Life Science (Boston, MA). O plasmídeo NF-kB elemento de resposta (NF-kB-RE) e kit de Dual-Luciferase Reporter Assay foram adquiridos a Promega (Madison, WI). PI (propídio iodo) e anti-antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) (# 610664) anticorpos monoclonais foram adquiridos da BD Biosciences Inc. (Franklin Lakes, NJ). derivados CA, incluindo capa e CAPPE (Figura 1) foram fornecidos pelo Dr. Y. H. Kuo (China Medical University). Estes derivados de CA foram dissolvidos em sulfóxido de dimetilo (DMSO) a uma concentração de solução de estoque de 200 mM e armazenado a -20 ° C. Imediatamente antes da experiência, a solução-mãe foi adicionada ao meio de cultura celular, como descrito anteriormente.

Os derivados de CA estão representados na Fig. 1. (A) CAPE e (B) CAPPE diferem no alongamento da cadeia lateral de alquilo do éster do ácido cafeico.

cultura celular

Resumidamente, as células foram cultivadas CRC humanos numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO

2 e cultivadas até à confluência utilizando soro fetal de bovino (FBS), suplementado meio RPMI-1640. As células utilizadas nas experiências diferentes têm o mesmo número de passagens. meio RPMI-1640 foi suplementado com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina inactivado pelo calor e 1,5 g /L de bicarbonato de sódio.

A suplementação com derivados CA

CRC células humanas foram incubadas com diferentes concentrações (0, 5, 10, 20, 50, e 100 uM) dos derivados de CA para 2 h, ou 24 h. Para a absorção eficaz dos derivados de CA por células de cancro do cólon humano, estes compostos foram incorporados em FBS durante 30 min e misturou-se com o meio. Em grupos de controlo, as células foram incubadas com um volume equivalente de DMSO solvente. (Concentração final: 0,05% v /v) na forma de um veículo transportador

A avaliação da proliferação de células

O MTT (brometo de 3- [4,5-dimethhylthiaoly] – brometo de ensaio de 2,5-difeniltetrazólio) foi conduzido para detectar a proliferação de células. células de CRC humanos foram semeadas em placas de 24 poços, cada poço contendo 1 × 10

5 células. Após 24 h, o meio de cultura foi substituído por meio contendo derivados de CA em uma das cinco concentrações (isto é, 0, 5, 10, 20, 50 e 100 uM) na presença ou ausência de composto C. As transfecções de Akt constitutivamente activa ( Myr-Akt1, Addgene plasmídeo 9008) e vector vazio (pcDNA3, Addgene plasmídeo 10792) foram realizados usando o reagente de transfecção Lipofectamine LTX. Cada concentração foi testada em triplicado. No fim do experimento, uma das placas foi retirado e o MTT fresco (concentração final de 0,5 mg /mL em PBS) foi adicionado a cada poço. Após 2 horas de incubação, os meios de cultura foram descartados, 200 mL de isopropanol acídico foram adicionados a cada poço e vibrada para dissolver o depositante. A densidade óptica foi medida a 570 nm com um leitor de microplacas.

A análise quantitativa do ciclo celular por citometria de fluxo

de cancro do cólon humano CRC células foram cultivadas em placas de 6 poços a uma densidade de 1 × 10

6 células por poço. Antes do ensaio, as células foram sincronizadas através da sua cultura em 0,05% de FBS suplementado meio RPMI-1640 durante a noite até CABO ou tratamento CAPPE. Para medir a distribuição do ciclo celular, as células foram tratadas com cabo ou CAPPE (0, 10, 50, 100 uM) durante um adicional de 24 h. As células foram recolhidas após tratamento com uma solução de tripsina e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e suspendeu-se com o tampão de ligação (1 × 10

5 células /mL). células CRC humanos foram coradas com PI e analisados ​​seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, cinco microlitros de PI foram adicionados às células em suspensão e incubou-se à temperatura ambiente, no escuro e analisadas por citometria de fluxo BD FACSCanto (BD Biosciences Inc., Franklin Lakes, NJ). As células marcadas com PI foram analisados ​​utilizando software acessório.

nidação xenoenxerto de células tumorais

Para estabelecer o modelo do rato de xenotransplante, culturas sub de HCT-116 células cancerígenas do cólon foram dadas meio fresco 24 h antes de serem colhidas por um breve tratamento com 0,25% de tripsina e 0,02% de EDTA. A tripsinização foi parada com meio contendo FBS a 10%, e as células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em meio isento de soro RPMI 1640. Apenas uma única célula suspensões com uma viabilidade de 90% foram utilizadas para as injeções

Animals, Dieta e Suplementação CA Derivado

Adulto (3-4 semanas de idade) BALB /C Ann. ratinhos nus -Foxn1 (19-22 g) foram obtidos a partir do animal Centro Nacional Laboratory (Taipei, Taiwan). Os ratos foram mantidos em condições livres de patógenos específicos em instalações aprovadas pelo Centro Nacional de Animais de Laboratório em conformidade com os regulamentos e normas em vigor (protocolo de animais não. 102-142-N). O protocolo de uso de animais listados acima foi analisado e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da China Medical University. O estudo animal foi conduzido de acordo com a diretriz nacional e o protocolo de animais aprovado a fim de manter o bem-estar dos animais e melhorar o sofrimento nos animais experimentais. Durante todo o período experimental, os ratos foram alimentados com uma dieta de laboratório padrão 5010 comprado de LabDiet Inc. (St. Louis, MO, EUA). A dieta padrão contém gordura bruta (13,5% da energia total da dieta), proteína (27,5%) e de hidrato de carbono (59%), e não tinha derivados CA detectáveis, tal como indicado pelo fornecedor. Os ratos que tinham sido anestesiados com inalação de isofluorano foram colocados em posição supina. Os ratinhos foram subcutaneamente (s.c.) injectados com células HCT-116 do cancro do cólon humano (1 × 10

6 /0,1 ml de meio) no flanco direito de cada ratinho nu BALB /C Ann-Foxn1. Uma bolha bem localizada foi considerado para ser um sinal de uma injecção tecnicamente satisfatória.

Após a inoculação, os ratinhos foram divididos em três subgrupos (n = 6 por grupo). derivados de CA foram dadas aos animais experimentais por gavagem uma vez por dia a um volume total de 0,15 mL. A CABO grupos CapPE e cada um recebeu uma dose oral diária de derivados de CA dissolvidos em óleo de milho (4% w /w) a 50 nmol /kg de PV, uma vez por dia. O grupo de controlo do tumor receberam óleo de milho (4% w /w) uma vez por dia único. Os murganhos normais sem tumor-inoculação foram utilizadas como controlo negativo. O volume do tumor foi calculado pela seguinte fórmula: 0,524 L1 (L2)

2, onde L1and L2 representa o eixo longo e curto do tumor, respectivamente. BW foi determinado uma vez por semana. Não houve diferenças significativas de ingestão de alimentos ou de peso corporal foram encontrados neste estudo. No final do período experimental, os animais foram sujeitos a eutanásia por CO

2 inalação; tecidos de tumor foram então excisados, pesados ​​e congelados imediatamente. Estes tecidos tumorais foram seccionados e corados com eosina de Mayer hematoxilin- (H E) para exame por microscopia de luz. Os restantes tecidos do fígado, pulmão, baço, pâncreas e intestino grosso também foram excisados, pesados ​​e congelados para outras experiências. As amostras de sangue foram recolhidas a partir do coração de um tubo Vacutainer de 1 ml na presença ou ausência de heparina e centrifugadas durante 10 min a 1000 g para obter plasma ou soro, respectivamente.

histoquímicas e imuno-histoquímica de tecidos tumorais

tecidos tumorais congelados foram cortados em 5 mm seções e imediatamente fixados com paraformaldeído a 4%. As secções foram coradas com hematoxilina de Meyer-eosina (H E) para a microscopia de luz. Os controlos negativos não exibem qualquer coloração. Três pontos quentes foram examinados de forma cega por seção tumor (campo de alta potência 200 ×) a partir de seis diferentes tumores em cada grupo. Para coloração imuno-histoquímica, secções de tecido congeladas foram tratados com peróxido de hidrogénio a 0,3% para bloquear a actividade endógena de peróxido. A ligação de proteína não específica foi bloqueada com 10% de soro normal de cabra (NGS) durante 1 hora seguido por incubação com anticorpos primários, quer anti-FASN ou anti-PCNA (1:300). As secções de tecido foram lavadas com solução salina 0,1 M de tampão fosfato (PBS) e incubadas com imunoglobulina G biotinyated (1:300 anticorpo secundário) à temperatura ambiente durante 1 h. As secções de tecido foram coradas com Avidina-Biotina complexo (ABC), diaminobenzidina (DAB) e peróxido de hidrogênio. os núcleos das células foram coradas com hematoxilina. A visualização foi realizada a 200 × ampliações. Imagens de secções de tumor foram adquiridos em um microscópio Olympus BX-51 usando um sistema digital de câmera e de imagem Olympus DP-71 (Olympus, Tóquio, Japão).

Preparação de proteína extração

CRC Humano as células HCT-116 foram cultivadas em 10% de meio de cultura FBS na presença de capa ou CAPPE durante 2 h ou 24 h. Os lisados ​​celulares (citoplasmáticos e proteínas nucleares) a partir de células de cancro do cólon foram preparados usando o kit de reagentes extracto de proteína nuclear que contém um inibidor de protease e inibidores de fosfatase de acordo com as instruções do fabricante. Após centrifugação durante 10 minutos a 12000 x g para remover os detritos celulares, os sobrenadantes foram retidos como um extracto citoplasmático. A contaminação cruzada entre as fracções nuclear e citoplasma não foi detectada (dados não mostrados).

detecção no plasma de MMP-9 pelo Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

O nível no plasma de MMP-9 estava medido por ELISA, de acordo com as instruções do fabricante (R D Systems Inc.). Resumidamente, uma amostra diluída 100 ul de plasma (1:08 diluição) de cada grupo foi adicionado a cada poço e analisada. Após a conclusão do processo de ELISA, a placa foi lida a 450/570 nm de comprimento de onda utilizando um leitor de microplacas (Tecan Inc., Mannedorf, Suíça).

A análise dos níveis de ATP celular

CRC Humana as células foram cultivadas durante 24 h em placas de 96 poços, cada poço contendo 1 × 10

4 células na presença de capa ou CAPPE. As medições de ATP celular foram analisadas seguindo o protocolo do fabricante. Em resumo, os lisados ​​celulares foram preparados utilizando tampão de lise celular directamente. lisado celular total (100 uL) foram misturados com solução de substrato e vibrada para dissolver os depósitos de acordo com as instruções do fabricante. A densidade óptica foi medida com um Synergy HT Multi-Modo Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT).

Western análise de transferência

As proteínas celulares (70 ug) foram fracionados em 10% SDS PAGE, transferidos para uma membrana de nitrocelulose, colocados a hibridar com anticorpo monoclonal anti-Akt de fosforilação, e realizada com ensaio baseado em quimioluminescência. a fosforilação da proteína de PDK1, fosforilação de GSK3α, fosforilação de GSK3β, fosforilação de FOXO3, a fosforilação da AMPK, fosforilação de m-TOR, PTEN, N-caderina, PDK1, Akt, GSK3α, GSK3β, FOXO3, TSC1, TSC2, mTOR, LKB1 , 14-3-3, AMPK, FASN, NF-kB (P-65), ciclina D1, Cdk4, PCNA, p21

CIP1 /WAF1, ciclina e e c-myc em lisados ​​celulares foram medidos utilizando a mesma procedimento descrito acima. As manchas foram despojado e sondado com anticorpos Um tanto β-actina ou de lamina como o controle de carregamento.

Reporter ensaio de gene

A transfecção de NF-kB elemento de resposta (NF-kB-RE) plasmídeo foi realizado em CRC humano HCT-116 e células SW-480 de acordo com as instruções do fabricante. CRC humano HCT-116 e células SW-480, em seguida, foram colocadas em placas a uma densidade de 2 × 10

5 células por poço em placas de 12 poços em 2 mL de meio e incubadas durante a noite. As células foram tratadas com quer CABO CAPPE ou em diferentes concentrações durante 24 horas antes da análise da actividade do gene repórter. O ensaio de gene repórter foi realizada usando kit Dual-Luciferase Reporter Assay. intensidades de luciferase foram medidos usando com um Synergy HT Multi-Modo Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT).

A análise estatística

A metodologia quantitativa foi utilizado para determinar se havia alguma diferença significativa na a viabilidade da célula, bem como a expressão da proteína entre os conjuntos experimentais e conjuntos de células de cancro do cólon de controlo. Em resumo, as análises estatísticas das diferenças na viabilidade celular entre os conjuntos de triplicados das condições experimentais foram realizados utilizando software SYSTAT. A confirmação de uma diferença de viabilidade celular tão significativo requer a rejeição da hipótese nula de nenhuma diferença entre os índices médios obtidos a partir dos conjuntos de réplicas de grupos experimentais e controle no

P

= 0,05, utilizando o one-way ANOVA modelo. O teste de Bonferroni post hoc foi utilizado para determinar as diferenças entre os diferentes grupos.

Resultados

derivados

CA inibiu significativamente a proliferação de células CRC humanos

in vitro

foram investigados os efeitos inibitórios de derivados CA sobre a proliferação de células CRC humanos (HCT-116 e SW-480 células)

in vitro

. Como se mostra na Figura 2-3, derivados de Ca (nas concentrações de 5, 10, 20, 50 e 100 uM) inibiu significativamente a proliferação de CRC humano HCT-116 e células SW-480. Nas concentrações de 5, 10, 20, 50 e 100 uM, capa e CAPPE cada suprimiu significativamente a proliferação de células HCT-116 BF humanas, respectivamente. (Efeitos inibidores de Cabo: 4, 31, 47, 54, e 58%; CAPPE: 5, 45, 56, 59 e 64%) (Figura 2A). Os IC50 para CAPE e CAPPE em células CRC HCT-116 humanos são 44,2 mM e 32,7 mm, respectivamente. Nas concentrações de 5, 10, 20, 50 e 100 uM, CAPE e CAPPE suprimiu significativamente a proliferação de células de CRC SW-480 humanos, respectivamente. (Efeitos inibidores de Cabo: 0,5, 8,9, 14, 19 e 32%; CAPPE: 6, 15, 22, 26 e 47%) (Figura 3A). Os IC50 para CAPE e CAPPE em células CRC SW-480 humanos são 132,3 mM e 130,7 mm, respectivamente. Estes resultados demonstram que a capa e CAPPE são, cada um capaz de inibir de forma significativa a proliferação de células de CRC humanos de uma maneira dependente da dose. CAPPE parece para inibir a proliferação de células HCT-116 de CRC humanos de forma mais eficaz do que CABO. Por esta razão, CAPE e CAPPE foram selecionados para um estudo mais aprofundado dos seus potenciais efeitos anti-câncer nas células CRC humanos. O papel das moléculas de sinalização sobre a proliferação celular em células de CRC humanos tratados com derivados de Ca foi investigada. Nestas células, Akt era ou sobre-expressos por transfecção com um plasmídeo de Myr-Akt1 constitutivamente activa, ou atividade AMPK foi inibida pelo composto C. Tal como mostrado na Figura 2A, a sobre-expressão de ambos Akt e supressão da actividade da AMPK resgatado proliferação celular inibida por tratamentos capa ou CapPE em células HCT-116 de CRC humanos. Os efeitos de Akt sobre-expressão ou actividade reduzida AMPK no resgate proliferação celular foram menos significativos, no entanto, em SW-480 células tratadas com o CA-derivado (Figura 3A). Os níveis de expressão de P-Akt e proteínas t-Akt por a sobre-expressão de uma forma constitutivamente activa de Akt humana em CRC HCT-116 e células SW-480 foram mostrados na Figura 2B e Figura 3B, respectivamente. Os níveis de expressão de p-AMPK e proteínas T-AMPK pelo tratamento do composto C em CRC humano HCT-116 e células SW-480 foram mostrados na Figura 2C e 3C, respectivamente. Os resultados sugerem que os derivados de CA agir como agentes quimiopreventivos contra o CRC humano através de uma modulação das vias de sinalização de PI3-K /Akt e AMPK

BF humano (A) células HCT-116 foram cultivadas em meio RPMI-1640 com CABO e CAPPE (em concentrações de 0, 5, 10, 20, 50 e 100 uM) na presença ou ausência de composto C (10 uM) durante 24 h. Transfecções de Akt constitutivamente activo (Myr-Akt1) e vazio vetor (pcDNA3) foram realizadas antes do tratamento de derivados CA. A proliferação celular foi medida pelo ensaio de MTT, tal como descrito em Materiais e Métodos. Os dados são a média ± DP (desvio padrão) de três experiências independentes. Os símbolos diferentes (??? para CAPE e ▵ para CAPPE) representam uma diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle -untreated derivado CA em cada grupo, respectivamente, a P 0,05. Os símbolos diferentes (# para CAPE_Akt, § para CAPE_compound C, ▴ para CAPPE_Akt e ▪ para CAPPE_compound C) representam uma diferença estatisticamente significativa em relação a cada CA correspondente derivative- tratada grupo controle em cada subgrupo de dosagem, respectivamente, a P 0,05. (B-C) proteína citoplasmática foram preparadas para análise Western blot utilizando anticorpos monoclonais contra o anti-fosforilação de Akt (S473), o total-Akt, anti-fosforilação AMPKα (T172) e total-AMPKα.

Humanos CRC (a) células SW-480 foram cultivadas em meio RPMI-1640 com capa e CAPPE (em concentrações de 0, 5, 10, 20, 50 e 100 uM) na presença ou ausência de composto C (10 uM) durante 24 h. Transfecções de Akt constitutivamente activo (Myr-Akt1) e vazio vetor (pcDNA3) foram realizadas antes do tratamento de derivados CA. A proliferação celular foi medida pelo ensaio de MTT, tal como descrito em Materiais e Métodos. Os dados são a média ± DP (desvio padrão) de três experiências independentes. Os símbolos diferentes (??? para CAPE e ▵ para CAPPE) representam uma diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle -untreated derivado CA em cada grupo, respectivamente, a P 0,05. Os símbolos diferentes (# para CAPE_Akt, § para CAPE_compound C, ▴ para CAPPE_Akt e ▪ para CAPPE_compound C) representam uma diferença estatisticamente significativa em relação a cada CA correspondente derivative- tratada grupo controle em cada subgrupo de dosagem, respectivamente, a P 0,05. (B-C) proteína citoplasmática foram preparadas para análise Western blot utilizando anticorpos monoclonais contra o anti-fosforilação de Akt (S473), o total-Akt, anti-fosforilação AMPKα (T172) e total-AMPKα.

CAPE e CAPPE cada induzida G

0 /G

1 célula parada do ciclo nas células CRC

para determinar se CA supressão mediada por derivado da proliferação celular foi devido a uma prisão em um certo estágio do ciclo celular, foram estudados ainda no HCT-116 e células SW-480 os efeitos da CAPE e CAPPE. As células tratadas com CAPE ou CAPPE foram submetidos a análise de fluxo de citometria após seu DNA foi corado com PI. Os histogramas dos dados de citometria de fluxo estão apresentados na Figura 4A. CABO e CAPPE induzida significativamente a paragem do ciclo celular em G

0 /L

uma fase de uma maneira dose-dependente (P 0,05). A uma concentração de 50 mM, CAPE e CAPPE aumentou significativamente parada do ciclo celular de HCT-116 células durante o G

0 /G

1 fase em até 56% e 61%, respectivamente, enquanto que no grupo controle a percentagem de células em G

0 /L

1 fase foi de apenas 34% (Figura 4B). A uma concentração de 50 mM, CAPE e CAPPE aumentou significativamente parada do ciclo celular de SW-480 células durante o G

0 /G

1 fase em até 44% e 57%, respectivamente, enquanto que no grupo controle a percentagem de células em G

0 /L

1 fase foi de apenas 37% (Figura 4C). Estes aumentos na G

0 /G

1 prisão eram em sua maioria à custa dos

2 /M populações de células de fase S e G. CAPPE parece induzir G

0 /G

1 célula parada do ciclo de forma mais eficaz do que o CAPE em células CRC humanos. Assim, é plausível que CAPE e CAPPE inibiu a proliferação celular de células CRC humanos através de uma paragem do ciclo celular no G

0 /G

1 de fase.

células CRC Humano foram sincronizadas em RPMI- 1640 com 0,05% de FBS em pratos de cultura de tecidos durante a noite. Para medir a distribuição do ciclo celular, células foram cultivadas na presença ou ausência de capa e CAPPE (0, 10, 50 e 100 uM) cultivadas em FBS a 10% de meio RPMI-1640 durante mais 24 h. (A) A medição da população de células em diferentes fases do ciclo celular foi realizada utilizando análise de citometria de fluxo, tal como descrito em Materiais e Métodos. Os dados indicam a (B) HCT-116 células (C) porcentagem da população SW-480 células em diferentes fases do ciclo celular sob o tratamento de CAPE ou CAPPE em células CRC humanos. CRC (D) HCT-116 células de origem humana (E) SW-480 As células foram tratadas com quer CABO ou CAPPE (em concentrações de 0, 5, 10, 20, 50 e 100? M) em 10% de FBS RPMI-1640 durante 24 h . As proteínas nucleares foram preparados para análise de transferência de Western utilizando anticorpos monoclonais contra ciclina D1, Cdk4, PCNA, e anticorpos lamina A, tal como descrito em Materiais e Métodos. Os níveis de detecção representam as quantidades de ciclina D1, CDK4 e PCNA nos núcleos de células humanas de CRC. Os resultados (média ± SD) representam o dobras mudança de grupo de controle e são representativos de três experiências diferentes. As bandas imuno são indicados com uma seta. Os médios integrado densidades dessas proteínas ajustados com a lamina controle interno de uma proteína são mostrados na linha de fundo.