Sumário

cancro de células estaminais são células de cancro caracterizado por as propriedades das células-tronco e representam uma pequena população de células de tumor que dirige o desenvolvimento do tumor, progressão, metástase e resistência aos medicamentos. Até à data, os mecanismos moleculares que geram e regulam células-tronco cancerosas não são bem definidos. BORIS (Irmão de Regulador de Locais Imprinted) ou CTCFL (CTCF-like) é uma proteína de ligação ao ADN que é expresso em tecidos normais apenas em células germinativas e é re-activada em tumores. Evidências recentes puseram em evidência a correlação de

BORIS /expressão CTCFL

com má sobrevida global de pacientes com câncer diferentes. Temos demonstrado anteriormente uma associação de células com expressão de genes em células cancerosas stemness embrionárias BORIS-expressar. Aqui, foram estudados o papel do BORIS em células tumorais epiteliais. Usando beacon BORIS-molecular que já foi validado, fomos capazes de mostrar a presença de

BORIS

mRNA em populações tronco cancerosas enriquecida com células (população lado e esferas) do colo do útero, cólon e células tumorais de mama. BORIS estudos silenciamento mostraram uma diminuição da capacidade de formação de esfera em células de mama e de tumores de cólon. Importante, BORIS-silenciamento levou a infra-regulação da

hTERT

, células-tronco (

NANOG

,

OCT4

,

SOX2

e

BMI1

) e marcadores de células-tronco cancerosas (

ABCG2

,

CD44 genes

ALDH1

) Comprar e. Por outro lado, BORIS-indução levou a sobre-regulação dos mesmos genes. Estes fenótipos foram observadas no colo do útero, do cólon e células de tumor de mama invasivos. No entanto, um comportamento completamente diferente, foi observado nas células de tumor da mama não-invasivos (MCF7). Na verdade, essas células adquiriu um fenótipo epitelial mesenquimal após BORIS silenciamento. Nossos resultados demonstram que BORIS está associada com populações enriquecida com células-tronco do câncer de várias células tumorais epiteliais e os diferentes fenótipos dependem da origem das células tumorais

Citation:. Alberti L, Losi L, Leyvraz S, Benhattar J (2015) efeitos diferentes de BORIS /CTCFL sobre stemness Gene Expression, Formação Sphere e célula de sobrevivência em câncer epitelial de Stem Cells. PLoS ONE 10 (7): e0132977. doi: 10.1371 /journal.pone.0132977

editor: Gabriele Saretzki, da Universidade de Newcastle, Reino Unido

Recebido: 02 de abril de 2015; Aceito: 19 de junho de 2015; Publicação: 17 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Alberti et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. o apoio financeiro foi dado pela Swiss National Science Foundation (31003A-113505) e Emma Muschamp Foundation. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Um dos autores (JB) é empregado por um laboratório de patologia molecular (Biopath Lab). Biopath Lab forneceu apoio sob a forma de salários, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Um dos autores (JB) é empregado por um laboratório de patologia molecular (Biopath Lab). Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

evidências enormes apoiar a visão de que o câncer humano poderia ser considerada como uma doença de células-tronco [1- 3]. A teoria células-tronco cancerosas (CSCs) assume que os cancros são vistos como tecidos complexos, onde o crescimento celular aberrante é impulsionado por uma pequena população de células definidas como células iniciadoras de tumores. Estas células são caracterizados por três principais propriedades: capacidade de proliferação descontrolada, a capacidade de auto-renovação e capacidade de se diferenciar em uma descendência não-CSC [3, 4]. Curiosamente, as propriedades destas células malignas são muito semelhantes para as três características que caracterizam as células estaminais normais: o potencial de proliferam extensivamente, a auto-renovação e a capacidade de se desenvolver em múltiplas linhagens. Por conseguinte, as células tumorais com essas propriedades são também chamados de células estaminais de cancro. As primeiras observações de a presença de CSCs foram realizadas na leucemia mielóide aguda humana [5] e, por conseguinte, desenvolvido em diferentes tipos de tumores sólidos humanos, como cancros da mama [6], cérebro [7], do cólon [8, 9], pancreático [10 ] e [11] do ovário tumores. Demonstrou-se que muitos pacientes com cancro, especialmente com tumores sólidos, respondem mal às terapias convencionais, tais como quimioterapia e radioterapia, e depois de uma remissão parcial inicial, os tumores recaída. As razões de tal falha poderia ser explicado pela resistência droga e rádio-de CSCs. Além disso, foi demonstrado que CSCs são mais frequentes nos tumores altamente agressivos e refratários [6-7]. Portanto, torna-se extremamente importante para identificar as populações CSC e seus marcadores para desenvolver terapias CSC-direcionados para vencer a resistência de CSCs às drogas anti-cancro convencionais. Utilizando as abordagens experimentais, os CSCs de muitos tipos de tumores têm sido caracterizadas fenotipicamente e vários marcadores de CSC foram identificados [4, 12]. No entanto, a maioria dos marcadores identificados não são totalmente específicos para os CSCs porque eles também são expressos em células normais, e, por conseguinte, é necessária a utilização de múltiplos marcadores. Muitos esforços na pesquisa do câncer será necessário para otimizar a segmentação CSCs terapias. Existem várias abordagens para enriquecer as populações CSCs, que são usados ​​principalmente para

in vitro

análises e triagem métodos. Uma abordagem baseia-se na selecção de uma subpopulação de células que é capaz de efluxo de corantes. O efluxo destes corantes é uma capacidade de CSCs que expressam os genes que codificam os transportadores de fármacos cassete de ligação a ATP (ABC), tais como ABCG2 [13-15]. O corante mais utilizado é a Hoechst 33342, que é um corante de ligação a ADN. A subpopulação seleccionada por este método é chamado população lateral (SP). A actividade aldeído desidrogenase (ALDH) é uma outra propriedade funcional de células estaminais, utilizadas para isolar população enriquecida CSCs [16, 17]. Um

in vitro

abordagem adicional é baseada na cultura sem soro não aderente [8, 18]. Usando este método, as células de vários tipos de tumores (incluindo o cérebro, mama e cólon), que têm a capacidade de auto-renovação e para manter as propriedades de células-tronco, podem formar colônias esferóides nomeados esferas [19].

BORIS (Irmão de Regulador de Sites Imprinted) é uma proteína de ligação de ADN que partilha com o seu par�ogo CTCF, um domínio de 11 zinc-finger, portanto, também chamado CTCFL (CTCF-like) [20]. BORIS proteína está envolvida na reprogramação epigenética e que pertence a família do cancro testicular antigénio, tal como é expressa em células germinais normais e reactivada em tumores. Relatórios recentes indicam que a expressão BORIS está associada com estágio avançado em diferentes tipos de câncer, como de ovário, próstata, esôfago e câncer hepatocelular [21-24]. Em cancros do ovário, expressão BORIS também pode conferir mau prognóstico [21]. Nosso estudo anterior demonstrou a associação de expressão BORIS com células-tronco e genes marcadores CSC em células de carcinoma embrionário [25]. Todas estas evidências levou-nos a investigar a presença e as funções moleculares de BORIS nos CSCs populações enriquecidas em outros tipos de células tumorais e, especificamente, em células cervicais, cancros do cólon e de tumor da mama. Como ainda não existe um anticorpo validados contra BORIS, utilizou-se o farol BORIS-molecular (BORIS-MB), que foi previamente testado e validado para

in vivo

detecção de

BORIS

mRNA [25 ]. BORIS-MB permitiu-nos visualizar as células BORIS-positivas nas células epiteliais tumorais analisadas. Curiosamente, descobrimos que

BORIS

é altamente expresso em populações CSC-enriquecido isolados de SP e esferas. Além disso, estudos funcionais BORIS revelou que poderia desempenhar um papel importante na auto-renovação de tumores e na aquisição de assinatura epitelial mesenquimal (EMT) na base da origem das células tumorais.

Materiais e Métodos

células e esferas preparação

as linhas de células humanas (HeLa, adenocarcinoma do colo do útero; HT29, adenocarcinoma de cólon; NCCIT, carcinoma embrionário) foram comprados na American Type Culture Collection (ATCC) e do humano linhas de células da mama (MCF7 e MDA-MB-231) foram fornecidos pelo Dr. Stephanie Renaud (Instituto de Biotecnologia, Universidade de Lausanne). As células foram cultivadas a 37 ° C com 5% de CO

2, quer em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco, Invitrogen) para células HeLa e HT29, ou em meio RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen) para NCCIT, MCF7 e células MDA-MB-231, suplementado com 10% de soro bovino fetal inactivado pelo calor. (FBS; Invitrogen) e 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, Invitrogen)

Para a cultura esfera, células (HT29, MCF7 e MDA-MB-231) foram primeiro isolada com solução de tripsina a 0,25% (Invitrogen) e lavadas duas vezes em PBS (Invitrogen). Em seguida, as células foram filtrados duas vezes, utilizando uma célula-peneira de 40 um de tamanho de malha (Falcon) e cultivadas em meio isento de soro contendo DMEM /F-12 (Invitrogen) suplementado com B27 (Invitrogen), 5 ug /ml de heparina (Sigma ), 20 ng /ml de EGF (factor de Crescimento epidérmico, BD Biosciences), 20 ng /ml de FGF (factor de crescimento de fibroblastos, BD Biosciences) e 5 ug /ml de insulina (Sigma). As células foram plaqueadas em placas de ultra-baixo de fixação placas de 6 poços (Corning), na densidade de 1000 células /ml durante 10-15 dias. Esferas foram contadas e coletadas para extração de RNA. Uma alíquota de esferas foi semeada em meio normal com soro para permitir a diferenciação.

A análise da fluorescência usando BORIS-MB

As células foram preparadas como previamente descrito [25]. Resumidamente, as células em suspensão (1 x 10

6 células /ml) foram incubadas a 37 ° C durante 1,5 horas em meio DMEM isento de soro com Cy3 BORIS MB (200 nM) e Hoechst 33342 (5 ug /ml) na presença de um reagente de transfeco Lipofectamina RNAiMAX siRNA (Invitrogen). As células foram lavadas, ressuspensas em PBS-EDTA 5 mM e cytocentrifugated na lâmina de vidro usando uma centrifugadora Cytospin e, em seguida, examinadas sob uma lâmpada fluorescente (Axioplan2 Imaging, Zeiss) ou um confocal (LSM 710 Quasar, Zeiss) microscópio.

Para a coloração de fluorescência ABCG2, prepararam-se as células como descrito mais além. Depois de Cytospin, as células foram fixadas com acetona arrefecida em gelo durante 8 minutos e coraram-se a 4 ° C durante a noite com anticorpo de coelho anti-humano ABCG2 (Sigma) utilizada na diluição de 1:20 em PBS. As lâminas foram lavadas com PBS e incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com anticorpo secundário de burro anti-coelho marcada com Alexa Fluor 488 (Sigma) utilizada na diluição de 1: 500 em PBS. As lâminas foram então examinado sob microscópio fluorescente.

análise de FACS e de triagem de SP

células HeLa (1 x 10

6 células /ml) foram incubadas em meio isento de soro a 37 ° C durante 1,5 horas com Hoechst 33342 (Invitrogen) a uma concentração final de 12,5 ug /ml, quer sozinho ou em combinação com 50