Abstract

Decorina, um proteoglicano rico em leucina pequena multifuncional matriz extracelular, foi demonstrado possuir potente anti-tumoral atividade. No entanto, existe alguma incerteza se as células cancerosas expressam diferentes decorina em adição às células do estroma não-malignas. Neste estudo, esclareceu expressão decorim por células de câncer de bexiga humanos tanto

in vivo

e

in vitro

. Além disso, o efeito da expressão decorina mediada por adenovírus em células cancerosas da bexiga humanos

in vitro

foi examinada. O primeiro demonstrado utilizando a base de dados publicamente disponíveis GeneSapiens decorina que a expressão do gene está presente em ambos os tecidos da bexiga humanas normais e malignas. No entanto, quando aplicada a hibridização in situ com sondas de RNA marcadas com digoxigenina para a decorina em amostras de tecido de carcinoma de bexiga humana derivados de uma grande doente coorte cistectomia radical (n = 199), que inequivocamente demonstrado que as células de carcinoma da bexiga invasivo e não-invasivos completamente falta mRNA decorim. As células cancerosas também foram negativas para imuno decorim. Em vez disso, a expressão decorina foi localizada unicamente às zonas do estroma não malignas originais de tecido da bexiga. De acordo com os resultados acima mencionados, células de cancro da bexiga humano

in vitro

também foram negativos para a expressão de decorina como mostrado por RT-qPCR análises. A falta de expressão decorina por células cancerosas da bexiga foi demonstrado não ser devido à metilação da região promotora proximal do gene de decorina. Quando células cancerosas da bexiga foram transf ectadas com um vector adenoviral de decorina, a sua proliferação foi significativamente diminuída. Em conclusão, mostrámos que as células cancerosas da bexiga humanos são totalmente desprovidos de expressão decorina. Também mostramos que a transdução de genes mediada por adenovírus decorina de linhas celulares de cancro da bexiga humano inibe marcadamente a sua proliferação. Assim, decorim entrega do gene oferece novas ferramentas terapêuticas potenciais malignidades uroteliais

Citation:. Sainio A, Nyman M, Lund R, S Vuorikoski, Boström P, Laato M, et al. (2013) Falta de Decorina Expressão por células cancerosas da bexiga humana oferece novas ferramentas na terapia de urotelial malignidades. PLoS ONE 8 (10): e76190. doi: 10.1371 /journal.pone.0076190

editor: Yves St-Pierre, INRS, Canadá |

Recebido: 13 de junho de 2013; Aceito: 23 de agosto de 2013; Publicação: 11 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Sainio et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Financeiramente este estudo foi apoiado pelo Fundo de Investigação médica (EVO) de Turku University Hospital, Fundações de câncer de South-Western Finland, Fundação de Ida Montin, Oskar Öflunds Stiftelse, A /Varsinais-Suomi Fundo Regional finlandês Fundação Cultural, Biocenter Finlândia, a Academia da Finlândia, e Universidade de Turku. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Hoje entendemos que matriz extracelular (MEC) macromoléculas não só constituem um espaço inerte enchendo microambiente em torno das células, mas agir como uma dinâmica sinais de geração de estrutura para controlar o comportamento de células [1]. Com efeito, a matriz extracelular e seus componentes, incluindo uma pequena decorina proteoglicanos ricos em leucina [2], são agora conhecidos [3] para desempenhar um papel central numa variedade de processos fisiológicos e patológicos através da sua capacidade para regular eventos celulares importantes, tais como a adesão, migração, proliferação e apoptose [4].

Pequenos proteoglicanos ricos em leucina (SLRPs) formam uma família de genes de cinco subclasses composto por 18 membros, incluindo decorim, o membro protótipo da família, e seu parente próximo, biglicano [5] – [6]. Em relação decorim, várias variantes de splicing (A1, A2, B-E) foram identificadas ao nível do ARNm [7]. A decorina é normalmente composto por um núcleo glicoproteína com um peso molecular de cerca de 42 kDa e uma cadeia lateral única sulfato de condroitina /dermatano. Na sua essência glicoproteína há 10 repetições ricas em leucina (LRR), cada repetição que consiste em 24 aminoácidos e que compreende uma α-hélice e um β-turn [2], [8]. Decorińs características estruturais que possa interagir com um número de outras proteínas da MEC, citocinas, factores de crescimento e seus receptores, tais como receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), o receptor (mesenquimal-epitelial) TEM, isto é, o receptor para o factor de crescimento de hepatócitos, receptor do factor de crescimento I semelhante a insulina (IGF-IR) e os membros da família de receptores ErbB [8] – [10]. Através destas interacções decorina tem acções versáteis na saúde e na doença

O papel de decorina na progressão do cancro e do seu potencial terapêutico como um agente anti-metastática supressores de tumor tem sido o foco de diversos estudos [10] – [11]. . Inicialmente, decorina foi ligada a cancro, quando se descobriu que decorina /p53 ratinhos knockout dupla desenvolveram tumores mais rápido do que os controlos [10]. Os resultados indicaram que a ruptura do gene de decorina não conduz ao desenvolvimento espontâneo de tumores, mas a falta de decorina é permissiva para a tumorigénese [10]. Em estudos subsequentes, a expressão de decorina foi encontrado para ser diminuída em vários cancros, tais como cancro do cólon [12], da próstata [13], e cancros do ovário [14]. Além disso, no cancro da mama baixa expressão de decorina tem sido mostrado para ser associada com um menor tempo de progressão e uma sobrevivência mais pobre [15]. Por outro lado, a entrega do gene de decorina ou proteína tem sido demonstrado para levar a atraso de crescimento de cancros diferentes [16] – [18] através de vários mecanismos de acção, tais como através da ligação a receptores de factor de crescimento acima mencionados e modular a sua actividade [11 ]. Recentemente, nós mostramos que diferentes tipos de células de câncer de mama humanos carecem totalmente mRNA decorim [19]. Também mostramos que a adesão, a proliferação e a apoptose de células MCF-7 de cancro da mama humano pode ser influenciada pela transdução de decorina [19].

No cancro da bexiga, o que é o 9

th cancro mais comum diagnóstico em todo o mundo [20], a expressão de decorina foi anteriormente mostrado para ser diminuída [21] – [24]. Como decorina actua como um antagonista natural para o IGF-IR em tumores, a sua expressão diminuída pode contribuir para o aumento da actividade de IGF-IR, conduzindo assim a progressão de cancros IGF-IR-dependentes por meio de motilidade celular aumentada e invasão [23] – [24 ]. É também possível que o efeito antitumoral de decorina em cancro da bexiga é mediado através de mitostatin gene supressor de tumores associados a decorina, cuja actividade é reduzida em cancro avançado da bexiga aliviar o crescimento e disseminação de células neoplásicas [25].

Embora vários estudos examinaram expressão decorim em vários tipos de cancro, incluindo o cancro da bexiga, há alguma incerteza se as células cancerosas diferentes expressá-la ou não. Neste estudo, nós examinamos a expressão de decorim por células de câncer de bexiga humanos tanto

in vivo

e

in vitro

. Nós também examinou o efeito de transdução gene decorim sobre a proliferação de células de câncer de bexiga humanos

in vitro

.

Materiais e Métodos

banco de dados

GeneSapiens

banco de dados GeneSapiens usados ​​para avaliar os resultados previamente publicados sobre a expressão de decorina em tecidos humanos normais e malignas [26]. Esta base de dados (https://www.genesapiens.org/) cobre os padrões de expressão gênica relativa para 17 330 genes em todas as 9783 amostras de tecido humano normal e patológico anotados de publicamente disponíveis experiências microarray Affymetrix. No banco de dados GeneSapiens não há informações em 35 diferentes carcinomas epiteliais

in vivo

. Para este estudo, foi utilizada a expressão decorim de 174 amostras representativas de cancro da bexiga humana e comparados com os dados obtidos a partir de 20 amostras de tecido da bexiga humanos normais.

amostras de tumor

A aprovação ética para o uso da clínica material deste estudo foi dada pelo Comitê de Hospital Distrital do Sudoeste da Finlândia Ética. A Comissão de Ética dispensou a necessidade de consentimento informado por escrito. amostras de tecido de cancro da bexiga foram derivadas de 199 pacientes radical cystectomy operados em 1985-2005 no Hospital da Universidade de Turku, Turku, Finlândia. As características patológicas dos pacientes são apresentados na Tabela 1. Tissue microarrays (TMA) foram construídos através da obtenção de 3 núcleos representativos de blocos dadores A cistectomia radical. Utilizou-se 5 uM secções consecutivas a partir dos blocos de TMA para hematoxilina e eosina (HE), hibridação in situ (ISH) e imuno-histoquímica (IHC). O uso das amostras teve a aprovação do comitê de ética local.

Decorina hibridização in situ

Realizamos decorim ISH em todas as secções TMA sondando as amostras com antisense decorim humana e sentido de cadeia simples ribossondas de ARN, como previamente descrito em detalhe [27].

A imuno-histoquímica

analisa A IHC foi realizada para decorina com um anticorpo policlonal de coelho (H-80, Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA, diluição 1:400) e para biglicano com um anticorpo policlonal de cabra (G-15, Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA, diluição 1:200) em todas as secções de TMA como previamente descrito [27]. Imunocoloração para Ki-67 foi realizada como descrito abaixo na seção para a transdução decorim mediada por adenovírus.

RT-qPCR para decorim

Três linhas urinária de células de câncer de bexiga humana RT-4, 5637, e T24 foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC). Estas linhas de células foram usadas para análise de RT-qPCR para decorina. Todas as linhas celulares foram mantidas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM; Gibco, Paisley, Escócia) contendo soro fetal bovino a 10% (FBS; Biochrom AG, Berlim, Alemanha), penicilina (100 UI /ml) e estreptomicina (100 ug /ml) (Sigma, Saint Louis, Missouri, EUA), e cultivadas a 37 ° C com 5% de CO

2. As células foram tripsinizadas, misturadas, e o ARN foi extraído utilizando NucleoSpin ARN II -Kit (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.

concentrações de ARN da linha celular de cancro extracções foram determinados usando um espectrofotómetro NanoDrop (ThermoScientific, Waltham, MA, EUA) e a integridade do ARN foi confirmado com electroforese em gel de agarose. Um? G de ARN foi ADNase tratado com ADNase RQ1 isenta de RNase (Promega, Madison, WI, EUA) e reversamente transcrito em ADNc utilizando M-MLV de transcriptase inversa e oligo (dT) 15 iniciador (Promega, Madison, WI, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. RT-qPCR foi realizado como anteriormente descrito [19].

estado de metilação do ADN de decorina promotor

O DNA total foi extraído a partir de linhas celulares de cancro da bexiga urinária (RT-4, 5637 e T24) utilizando kit QIAamp® genômica DNA (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha), seguindo o protocolo do fabricante. ADN metilado foi enriquecida com dois ensaios diferentes, o primeiro com MethylCap automatizado e, em seguida, com o ensaio automatizado usando MEDIP epigenética preparação da amostra robô SX-8G IP-Star ® (Diagenode). Resumidamente, o DNA genómico foi fragmentada em primeiro lugar com Covaris S2 sonicador. Os fragmentos de ADN foram metilados enriquecido com metilo Binding Protein ensaio de imunoprecipitação de domínio (MBD) ensaio de afinidade baseada MethylCap ou 5-metilcitosina anticorpo baseado MEDIP como descrito pelo fabricante (Diagenode). A fim de examinar o estado de metilação de decorina promotor do gene, os fragmentos de ADN metiladas foram purificados (estojo de purificação de MinElute PCR, Qiagen) e submetido a PCR quantitativa (SybrGreenER qPCR Supermix Universal, Invitrogen) usando 7900HT rápido sistema de RT-PCR (Applied Biosystems ). Cada amostra foi corrida em quatro repetições e três regiões promotoras que abrangem diferentes isoformas decorina (A1, A2, B-E) foram analisados. Os oligos qPCR utilizados na análise de RT-PCR foram: 5′- CAG DCN_A1_F GTG TGG AAA GGA GGA GG -3 ‘; DCN_A1_R 5’-GTG GCC TCA GGA TTG TGT TC -3 ‘; DCN_A2_F 5’AGT CCT CAC CTG AAC CCT GA -3 ‘; DCN_A2_R 5’-GAA AGC AGC ATC TTG CCT GG -3 ‘; DCN_B-E _F 5’-CTG CAT CCC ACT CAC CCA AA -3 ‘; DCN_B E_R-5’-TTC CTG ATG ACC GCG ACT TC -3 ‘. loci de controle associada com a GAPDH e promotores de genes TSH2B (Diagenode) foram utilizados como controlos negativos e positivos para a metilação do DNA, respectivamente. A recuperação% do DNA metilado foi calculada com a fórmula: entrada% de recuperação = 2? ((Ct input-log de diluição de entrada) – CtMeDIP) * 100

Adenovírus mediada transdução decorim

Para os experimentos de transdução, um vector adenoviral deficiente em replicação recombinante DCN-pxc1c-1 foi. usados ​​como previamente descrito [19]. Este vector abriga o ADNc de decorina humana (DCN) sob o controlo do promotor de citomegalovírus (CMV). Para a preparação do vector, de comprimento completo de ADNc de decorina humano [28] em plasmídeos pGEM foi clonado e inserido no plasmídeo de vaivém pxcJL-1. Os vírus foram preparadas por cotransfecção HEK293 células com o plasmídeo espinha dorsal pBHG10. Como RAdlacZ controlo do vector, o qual contém o gene coli β-galactosidase de E. (lacZ) sob o controlo do promotor IE de CMV foi utilizado. Este vector foi comprado pela Facilidade Vector Virus, Centro de Biotecnologia da Universidade de Turku, Turku, Finlândia. linhas celulares de cancro da bexiga humano RT4 e T24 foram usados ​​para a transdução de acordo com um protocolo como descrito anteriormente [19], com modificações menores. Resumidamente, as células cancerosas foram mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) contendo soro fetal bovino a 10% (FBS), penicilina (100 UI /mL), e estreptomicina (100 ug /ml) e cultivadas a 37 ° C com 5% de CO

2. As células foram plaqueadas sobre uma corrediça câmara de 8 poços (Thermo Scientific, Rochester, NY, EUA), 30 000 células por poço. No dia seguinte, as células foram transduzidas com 10, 100 e 1000 pfu /célula de DCN-pxc1c-1 ou RAdlacZ em DMEM contendo 10% de FBS. 24 horas após a transdução, o meio foi removido e substituído com meio fresco. As células foram então cultivadas até ao dia seguinte, após o que elas foram fixadas com paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Por fim, o índice de proliferação de decorim transduzidas linhas celulares foi determinada com um anticorpo monoclonal de coelho Ki-67 (30-9, Ventana Medical Systems /Roche Diagnostics, Tucson, Arizona, diluição 1:200) [19]. Ki-67 células positivas foram contados em dez diferentes campos de visão (ampliação de 10 ×) em decorim e lacZ transfectadas culturas de células, bem como culturas de controlo não tratadas. Além disso, o número de Ki-67 de células positivas /100 células por campo em dez campos diferentes foi contado para excluir a possibilidade de que o número de células alteradas em diferentes culturas teriam causado uma distorção nos resultados de proliferação. O efeito da transdução de decorina na contagem de células foi também medida usando um hemocitómetro. Resumidamente, as células foram plaqueadas numa placa de 12 poços (Thermo Scientific, Rochester, NY, EUA), 170 000 células por poço. A transfecção foi realizada como descrito acima e as células foram contadas 24 horas após a substituição do meio com um meio fresco. número de células em cada tratamento (Ad-DCN, Ad-LacZ Controle e Controle Negativo) foi contado como três repetições.

A análise estatística

Unpaired Student

t

teste foi empregue na análise estatística. O

p

valores. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

expressão do gene decorim Relativa no cancro da bexiga humano com base nas GeneSapiens em dados silico transcriptômica

A base de dados revelou que GeneSapiens decorina é expresso em níveis marcados em quase todos os diferentes tipos de amostras de tecido de carcinoma epitelial humano

in vivo

(dados não mostrados) [26]. Isto também era verdade para o cancro de bexiga humano, embora na bexiga maligna expressão decorina tecido foi reduzida em comparação com o tecido de bexiga normal (Figura 1).

análise de trama da caixa de expressão do gene em relação a decorina em amostras de tecidos de humano normal e maligno bexiga usando GeneSapiens urinário

in silico

banco de dados (https://www.genesapiens.org/). As linhas contínuas nas imagens Box Plot representam o nível de expressão mediana de decorim nos tecidos da bexiga. Note-se que a expressão de decorina em relação é marcado em ambas as amostras de tecido da bexiga normais e malignas, e que a expressão relativa de decorina é diminuída no cancro da bexiga em comparação com tecido normal da bexiga. bares tampado nas imagens caixa de blot indicam desvios-padrão dos resultados incluídos no banco de dados.

Localização de mRNA decorim e imunorreactividade em amostras malignas do tecido da bexiga humana

A ISH análises com DIG sondas de ARN marcado com para decorina claramente demonstrado que as células de carcinoma da bexiga invasivo foram totalmente desprovidos de decorina ARNm em todas as amostras de tecido de cancro da bexiga (Figura 2). A mesma conclusão também era verdade para as amostras que representam não invasiva in situ do cancro de bexiga humano (Figura 3). Em carcinomas da bexiga in situ e invasivos em, todos ARNm decorina detectada foi encontrado para ser localizada unicamente às zonas de estroma não malignas original (Figura 2 e 3). O IHC análises das amostras verificaram que a imunorreactividade decorina residiu nas mesmas áreas com ARNm decorina (Figura 2 e 3). Em contraste, a análise das amostras de IHQ para outro pequeno proteoglicanos ricos em leucina, a saber, biglicano, decorina revelou que as áreas negativas em tecido de cancro da bexiga invasivo foram positivos para imunorreactividade biglicano (Figura 4). Esta descoberta era verdade para em amostras de tecido de cancro da bexiga in situ, bem como (dados não mostrados).

As análises foram realizadas em toda a população do estudo e imagens representativas são mostrados. Os asteriscos indicam áreas povoadas apenas por células de câncer de bexiga. Os painéis A, D, G são imagens representativas de secções seriadas de uma mesma amostra de tecido, representando o cancro da bexiga invasivo humano. coloração A. HE. D. ISH para decorim. DIG reacção positiva em ISH indicando a localização de mRNA decorina pode ser visto no roxo. G. IHC para decorim. cor marrom indica áreas de células do estroma não malignas positivos decorim. Partes do normal (B, E, H) e maligno (C, F, I) áreas de tecido da bexiga (asteriscos) estão apresentadas abaixo ampliada. Note-se que as células de carcinoma de bexiga humana invasivos são completamente desprovidos de ARNm tanto decorina e imunorreactividade decorina e que a expressão decorina reside exclusivamente nas áreas de tecido do estroma original, não-maligna. Em números A, D e G, barra de escala de 50 mm, e em B, C, E, F, H e I, barra de escala de 20 um.

As análises foram realizadas em todo o estudo população e imagens representativas são mostrados. Os asteriscos indicam áreas povoadas apenas por células de câncer de bexiga. Painéis A, D, G são imagens representativas de cortes seriados de uma mesma amostra de tecido representando no cancro da bexiga humana situ. Setas apontam para as fronteiras de carcinoma in situ e asteriscos indicam áreas habitadas por apenas células de câncer de bexiga. coloração A. HE. D. ISH para decorim. DIG reacção positiva em ISH indicando a localização de mRNA decorina pode ser visto no roxo. G. IHC para decorim. cor marrom indica áreas de células do estroma não malignas positivos decorim. Partes do normal (B, E, H) e maligno (C, F, I) áreas de tecido da bexiga (asteriscos) estão apresentadas abaixo ampliada. Note-se que em células de carcinoma de bexiga humana in situ são completamente desprovidas de ARNm tanto decorina e imunorreactividade decorina e que a expressão decorina reside exclusivamente nas áreas de tecido do estroma original, não-maligna. Em números A, D e G, barra de escala de 50 mm, e em B, C, E, F, H e I, barra de escala de 20 um.

As setas indicam exemplos de células da bexiga malignas . A. imagem Representante do HE coloração do tecido câncer de bexiga invasivo. IHC para decorim (B) e biglicam (C) da mesma amostra que no A. Barra de escala na A-C, 20 mm.

expressão Decorina em linhas celulares de cancro da bexiga humanos

em vitro

O acima

in vivo

resultados demonstraram que as células malignas em ambas as amostras de tecido de cancro da bexiga humana invasivos e não invasivos não expressam decorim. Portanto, usando RT-qPCR nós próxima examinou se linhas celulares representando diferentes graus de câncer de bexiga humana decorim expresso. Os resultados mostraram que nenhuma das linhas celulares de cancro da bexiga, incluindo RT-4 (grau I originalmente cancro urotelial), 5637 (grau II), e T24 (grau III) decorina expressa. Para elucidar, se a falta de expressão decorina era devido à metilação de ADN do promotor do gene decorina, foram utilizados dois ensaios diferentes, MEDIP e MethylCap, seguido de RT-PCR quantitativo para examinar o estado de metilação do promotor do gene decorina diferente isoformas extraído das linhas celulares de cancro. Com base nestes ensaios, não foram capazes de detectar a metilação de ADN no promotor do gene decorina em qualquer uma das linhas celulares de cancro da bexiga examinados (Figura 5). O promotor do gene TSH2B controlo foi metilado e GAPDH não foi metilado conforme o esperado.

Falta de expressão decorina em linhas celulares de cancro de bexiga humana não é devido à metilação de ADN do promotor do gene decorina. estado de metilação de isoformas decorim (DCN A1, A2, B-E) em linhas celulares de cancro da bexiga foi estudado com dois ensaios automatizados diferentes, MethylCap e MEDIP. Na figura são quantitativas resultados de RT-PCR para o ensaio MethylCap mostrando% de enriquecimento de metilação do DNA contra DNA de entrada. Além de decorina promotores de genes, os resultados são apresentados para TSH2B controle positivo e controle negativo GAPDH.

Efeito de transdução mediada por adenovírus decorina sobre a proliferação de linhas celulares de cancro de bexiga humana

in vitro

Ambos os resultados ish e os ensaios de RT-qPCR demonstrou claramente que as células cancerosas da bexiga humana não são capazes de expressar decorim quer

in vivo

ou

in vitro

. Em seguida examinamos o efeito de transdução decorim orientada para a proliferação de células de câncer de bexiga humanos

in vitro

. Utilizou-se linhas celulares de cancro da bexiga T24 humanas e RT4 e um vector adenoviral decorina para esta finalidade. As células foram transduzidas com um título de 10-1000 pfu /célula de vector adenoviral e uma concentração viral de 1000 ufp /célula foi escolhida para outras experiências. Os resultados demonstraram que a transdução do decorina adenoviral mediada diminuiu o índice de proliferação das células cancerosas com significância estatística (Figura 6). Além disso, a contagem de células após a transdução decorina foi significativamente diminuída (dados não apresentados).

decorina transdução de genes diminui o índice de proliferação de células cancerosas da bexiga T24. células cancerosas A. bexiga transduzidas com vector adenoviral decorim (Ad-DCN). B. A transdução das células com o vector LacZ (Ad-LacZ Controlo). C. células cancerosas não transduzidas (controlo negativo). cor marrom indica Ki-67 células positivas (exemplos indicados por setas). A barra de escala em A-C, 50 uM. bares tampadas em cima das colunas em D indicam os desvios-padrão. *** P 0,001, de Student

t

teste

Discussão

Embora o papel decorińs na inibição do crescimento do tumor é reconhecido hoje [18], a origem. expressão decorim em cancros tem-se mantido parcialmente por resolver [12], [13], [23], [29]. Especialmente, tem havido alguma incerteza se as células cancerosas expressam diferentes decorina em adição às células do estroma não-malignas. Recentemente, mostrámos que em várias formas de cancro da mama humano, decorina não é expresso por células do cancro [19]. No que diz respeito tecido da bexiga, a expressão de decorina tem sido mostrado para ser proeminente nas camadas subepiteliais da bexiga de murino [30]. Também tem sido demonstrado com a análise IHC, que imunorreactividade decorina é marcadamente reduzida no estroma do tumor de ambos os tumores de bexiga de grau alto e baixo [23]. Neste estudo, nós examinamos a expressão decorim por células de câncer de bexiga humanos tanto

in vivo

e

in vitro

. Primeiro, avaliamos os dados anteriores sobre a expressão do gene decorim em diferentes tipos de cancro, com especial referência para o cancro da bexiga utilizando o GeneSapiens banco de dados acessível ao público [26]. De modo semelhante aos estudos anteriores [21] – [22], expressão decorina foi encontrado para ser diminuída em amostras de tecidos humanos malignos da bexiga em comparação com os tecidos normais da bexiga. Em seguida, nós localizada mRNA decorim e imuno decorim em nossa própria extensa coorte radical cystectomy paciente de amostras de tecido de cancro da bexiga humanos utilizando ISH com sondas decorim DIG-rotulados e um anticorpo policlonal decorim, respectivamente. Como temos mostrado no cancro da mama humano [19], estas análises demonstraram claramente que também no cancro da bexiga humana todas as áreas e ilhotas povoadas por células malignas foram completamente desprovido de mRNA decorim e imunorreactividade. Em vez disso, a expressão de decorina residia exclusivamente nas áreas de estroma de bexiga originais, não-maligna. Assim, os resultados em relação GeneSapiens expressão decorina em amostras de cancro de bexiga humana reflectem a qualidade do tecido original amostras incluídas no banco de dados, ou seja, em adição às células cancerosas que as amostras contêm várias quantidades de tecido estromal.

O

in vivo

resultados mostraram que as células cancerosas da bexiga humana não expressam decorim. Esta mesma constatação foi demonstrado ser verdade também para linhas celulares de cancro da bexiga humana. Porque a metilação do gene decorina anteriormente tem sido demonstrado que regulam a expressão de decorina em cancro do cólon [29], decidimos analisar se esse mecanismo epigenético está a afectar a expressão de decorina em células cancerosas da bexiga humanos bem. No entanto, nossos resultados indiscutivelmente demonstrado que a metilação do promotor do gene decorim não desempenha um papel no cancro da bexiga humana. Assim, os mecanismos de bloqueio expressão decorim por células de câncer de bexiga humanos continuam a ser elucidado.

Estudos utilizando transdução decorim foram anteriormente realizados, por exemplo, com células de cancro da mama e os resultados demonstraram tanto reduzida do crescimento do tumor primário e a prevenção de metástases [17], [31]. Além disso, a distribuição sistémica do núcleo da proteína decorina para xenoenxertos de carcinoma da mama foi relatada para modular a expressão de várias centenas de genes estromais que criam um microambiente tumoral desfavorável para a progressão tumoral e metástase [32]. Além disso, a supressão da tumorigenicidade utilizando transdução de decorina também foi demonstrada com xenoenxertos de tumor do cólon e carcinoma escamoso [16]. Recentemente, mostrámos que o adenovírus mediada transdução de decorina ao decorina células de cancro da mama negativas (MCF-7) diminuição da proliferação e aumento da apoptose das células [19]. Neste estudo, as linhas celulares de cancro da bexiga humano RT4 (gradus I) e T24 (gradus III) foram transduzidas com um vector adenoviral decorina que resultou numa diminuição na proliferação de células idênticas, idêntica para células MCF-7. Os resultados acima mencionados em conjunto com a falta de expressão observado decorina por células cancerosas fornece uma possibilidade intrigante para examinar o efeito de decorina no comportamento de células de cancro da bexiga como uma ferramenta terapêutica. Isto poderia ser realizado

in vivo

por exemplo com a terapia intravesical, na qual cavidade da bexiga cancerosa é lavado com decorim adenovírus contendo líquido [33] – [34]

Para o melhor de nosso conhecimento, o presente estudo é o primeiro a localizar exatamente mRNA decorim no. nível celular em câncer de bexiga humana

in vivo

. À medida que as amostras rastreadas para a imunorreactividade para o outro, SLRP muito semelhante a decorina, biglicano nomeadamente, verificou-se que as áreas tumorais negativas para decorina foram positivos para imunorreactividade biglicano. Isto indica que, embora decorina e biglicano representam moléculas altamente semelhantes que também partilham funções semelhantes, incluindo a sua capacidade para se ligar a TGF-β [35] a sua expressão nos tecidos não é idêntica. Anteriormente, decorina e expressão diferencial biglicano padrões têm sido encontrados por exemplo no desenvolvimento de tecidos esqueléticos e não-esqueléticos [36], durante o desenvolvimento da córnea [37] e situações patológicas, como a fibrose da obstrução parcial [38]. Além disso, é também biglicano gradualmente comprovada para actuar como uma molécula-chave na regulação do sistema imune [38]. Com base em nossos resultados, expressão biglicam é detectado em células de câncer de bexiga humanos que carecem de expressão decorim. O último papel de expressão biglicam na progressão ou restrição de tumorigénese exigirá mais estudos.

Conclusões

Em conclusão, neste estudo demonstramos que as células cancerosas da bexiga humana não expressam decorim quer

in vivo

ou

in vitro

, e que a expressão decorim no tecido da bexiga humana maligno reside apenas nas áreas de estroma original, não-malignas. Também mostramos que a falta de expressão decorina por células cancerosas da bexiga humanos não é devido à metilação das regiões promotoras do gene proximais de decorina. Além disso, demonstrámos que a transdução de células de cancro da bexiga humano em cultura com um vector adenoviral decorina provoca uma inibição significativa da proliferação das células

in vitro

. Tomados em conjunto, os nossos resultados indicam que a falta de expressão decorim por células de câncer de bexiga oferece uma possibilidade para o uso de terapias baseadas decorim em malignidades uroteliais humanos.

Reconhecimentos

Agradecemos Bogata Fezazi e finlandesa Microarray e Centro de sequenciamento em Turku Centro de Biotecnologia, Turku, Finlândia para suporte técnico. A assistência técnica especializada da Sinikka Kollanus é reconhecido agradecimento. Os autores expressam sua gratidão também para Jaakko Liippo para ajudar com a fotografar.