Sumário

Molecular terapia-alvo tem se mostrado promissora para o tratamento de carcinoma hepatocelular avançado (HCC). Sorafenib, um inibidor multiquinase, recebeu recentemente a aprovação da FDA para o tratamento de HCC avançado. No entanto, embora sorafenib é bem tolerada, a preocupação com a sua segurança tem sido expressa. Celecoxib (Celebrex) é um inibidor selectivo da ciclooxigenase-2 (COX-2), que apresenta efeitos anti-tumor em células de carcinoma hepatocelular humano. O presente estudo examinou a interação entre celecoxib e sorafenib em duas linhas celulares de tumores de fígado humano HepG2 e Huh7. Os nossos dados mostraram que cada inibidor sozinho reduziu o crescimento de células e a combinação de celecoxib com sorafenib sinergicamente inibiu o crescimento celular e aumento da apoptose. Para melhor compreender os mecanismos moleculares subjacentes à actividade antitumoral sinérgico da combinação, que investigou o perfil das linhas celulares de cancro de fígado tratado com de combinação utilizando microarrays análise de expressão. O tratamento de combinação alterou significativamente os níveis de 1,986 e 2,483 transcritos de expressão em células HepG2 e Huh7, respectivamente. Genes funcionalmente envolvidos na morte celular, transdução de sinal e regulação da transcrição foram predominantemente regulada para cima, enquanto os genes implicados no metabolismo, controle do ciclo celular e replicação e reparação do ADN foram principalmente regulada para baixo em cima do tratamento. No entanto, as linhas celulares de carcinoma hepatocelular tratados com combinação exibida especificidade na expressão e actividade de factores cruciais envolvidas no hepatocarcinogenese. A expressão alterada de alguns destes genes foi confirmada por semi-quantitativa e quantitativa de RT-PCR e por Western blotting. Muitos genes novos emergiu nossas análises transcriptomic, e mais análises funcionais podem determinar se estes genes podem servir como alvos moleculares potenciais para estratégias mais eficazes anti-HCC

Citation:. Cervello M, Bachvarov D, Lampiasi N, Cusimano Um, Azzolina A, McCubrey JA, et ai. (2013) nova combinação de Sorafenib e celecoxib Fornece sinérgica antiproliferativa e pró-apoptóticos efeitos em células cancerígenas do fígado. PLoS ONE 8 (6): e65569. doi: 10.1371 /journal.pone.0065569

editor: Manlio Vinciguerra, University College London, Reino Unido

Recebido: 11 de fevereiro de 2013; Aceito: 26 de abril de 2013; Publicação: 12 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Cervello et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas do italiano “Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca (Ministério de Educação, Universidades e Investigação) – MIUR FIRB427 MERIT n.RBNE08YYBM a MC e g.m .; D. B. é a Cabeça da Facilidade Núcleo Genomic no Centro de Investigação Chuq-Cancer, apoiado pelo Cancer FRSQ-RR. Todos os genômicas experiências e análises de dados foram realizadas a esta facilidade; M. C. Também foi apoiado em parte por uma subvenção para o CNR do Ministério da Economia e Finanças italiano para o Projeto FaReBio di Qualità. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o carcinoma hepatocelular (HCC) representa o quinto câncer mais frequente e a terceira causa mais comum de morte por câncer [1], [2]. Embora o diagnóstico clínico e gestão de HCC em estágio inicial tem melhorado significativamente, o HCC prognóstico ainda é extremamente pobre. Além disso, avançado HCC é um tumor altamente agressivo com uma baixa ou nenhuma resposta às terapias comuns. Assim, são urgentemente necessárias novas estratégias de terapia eficaz e bem tolerada.

sorafenib, um inibidor multiquinase que tem como alvo cinases Raf, bem como o VEGFR-2 /-3, PDGFR-β, Flt-3 e c-Kit , recebeu recentemente FDA e EMEA aprovação para o tratamento de pacientes com HCC avançado. No entanto, as taxas de resposta do tumor baixos e os efeitos colaterais associados com este monoterapia indicam a necessidade de investigar outras novas opções terapêuticas para HCC.

terapias direcionadas entraram no campo do tratamento anti-neoplásica e são utilizados isoladamente ou em combinação com fármacos de quimioterapia convencionais. Molecular Therapy-alvo é uma promessa para HCC [3]. No entanto, como na maioria dos cancros, a utilização de um único agente alvo molecular seria improvável atingir a remissão de longa duração ou a cura em CHC, especialmente para a doença de fase tardia. Por conseguinte, irá ser necessária uma terapêutica de combinação, e parece razoável especular que uma combinação de dois ou mais agentes acabará por aumentar o ganho terapêutico.

HCC é normalmente o resultado de lesão e inflamação crónica contínua. Um mediador importante da inflamação é o gene induzível de ciclooxigenase-2 (COX-2). Está agora bem estabelecido que a COX-2 é um alvo molecular importante para terapias anti-cancerosas. COX-2 é cronicamente sobre-expressos em muitos cancros, incluindo carcinoma hepatocelular [4] – [8]. Em HCC, e que outros investigadores demonstraram que inibidores COX-2 podem ter potenciais efeitos terapêuticos [9] – [13]

O racional para a combinação de sorafenib com inibidores COX-2 no carcinoma hepatocelular vem a partir de dados publicados por. outros autores [14], mas também de nossos próprios dados publicados [12]. Nós demonstramos que o tratamento de células de carcinoma hepatocelular humano, com um inibidor de COX-2 está associado com a activação de ERK1 /2, e que a inibição da via de sinalização de MEK /ERK por um inibidor da MEK potência a actividade anti-tumoral do inibidor. Em geral, os nossos resultados sugerem que a via de MEK /ERK não mediar a citotoxicidade induzida pelos inibidores da COX-2, mas pode proteger as células de morte, que apoia indirectamente o papel da via /ERK MEK na sinalização de sobrevivência de células de carcinoma hepatocelular [12].

Portanto, com base nestas descobertas que testaram os efeitos de uma combinação do celecoxib inibidor selectivo de COX-2 com sorafenib. Sinérgica anti-proliferativa e efeitos pró-apoptóticos foram obtidos quando se utilizou a combinação de sorafenib com celecoxib. A fim de compreender melhor os mecanismos detalhados dos efeitos citotóxicos do celecoxib e sorafenib, nós também investigada e comparada a expressão de genes de células globais HCC tratados com celecoxib ou sorafenib, ou os dois fármacos aplicados em combinação.

materiais e Métodos

Reagentes, cultura celular, viabilidade celular, clonogênica e proliferação Ensaios

O celecoxib (CLX) foi um presente da Pfizer Corporação Inc. (Nova York, EUA), sorafenib (SOR) foi adquirido Alexis de bioquímica (Lausen, CH), e ambos os fármacos foram dissolvidos em sulfóxido de dimetilo (DMSO). O carcinoma hepatocelular linhas de células HepG2 humana (uma linha celular hepatocarcinoma humano, ATCC HB-8065) ​​e Huh7 [15] (um presente do Prof. Massimo Levrero, Universidade Sapienza de Roma, Roma, Itália) utilizada neste estudo foram de um baixo número estreita passagem e foram mantidos como previamente descrito [16]. Todas as células foram mantidas em 5% de CO

2 e 37 ° C e rotineiramente rastreados contra contaminação por micoplasma. ensaios de viabilidade celular foram realizadas como descrito anteriormente [17]. O coeficiente de interacção medicamentosa (CDI) foi utilizado para analisar os efeitos de combinações de drogas [18]. CDI é calculada como se segue: CDI = AB /(A x B). De acordo com a absorvância de cada grupo, AB é a razão entre os grupos de combinação ao grupo de controlo; A ou B é a relação entre o grupo de agente único para o grupo de controlo. Assim, CDI valores menores do que, igual a ou maior do que 1 indicam que as drogas são sinérgico, aditivo ou antagonístico, respectivamente. CDI inferior a 0,7 indica que as drogas são significativamente sinérgico. Além disso, a análise estatística foi realizada utilizando o teste T-Student (bicaudal). Os critérios para a significância estatística foi

P

. 0,05

O efeito de diferentes concentrações de inibidor sobre a viabilidade celular também foi avaliada utilizando um ensaio clonogénico. Para esta análise, 1,0-1,5 × 10

3 células foram plaqueadas em placas de seis poços em meio de crescimento, e depois as células de fixação durante a noite foram expostas quer ao CLX e SOR sozinho ou suas combinações ou veículo durante 48 horas. As células foram então lavadas com meio livre de drogas e deixadas crescer durante 14 dias em condições sem droga. As colónias contendo mais do que 50 células foram contadas. a formação de colónias relativa foi determinada pela razão entre o número médio de colónias em células tratadas com o número médio de colónias em células tratadas com o solvente (DMSO). Todas as experiências foram realizadas em duplicata e repetido duas vezes.

A proliferação celular foi determinada pela estimativa da quantidade de bromodesoxiuridina (BrdU) incorporação no ADN através de um imunoensaio colorimétrico (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). Em resumo, 5 x 10

3 células foram cultivadas em placas de 96 poços nas diferentes concentrações de CLX e SOR sozinho ou suas combinações ou veículo durante 24 horas. BrdU foi então adicionada a 10 mM de concentração final. As células foram ainda incubadas durante mais 24 horas e, subsequentemente, fixadas e tratadas com peroxidase anti-BrdU de acordo com as instruções do fabricante. A cor foi desenvolvida por adição do substrato de tetrametilbenzidina e medido a 490 nm. A intensidade da cor e valores de absorvância directamente correlacionada com a quantidade de BrdU incorporada no ADN. Os resultados foram expressos como percentagem de inibição da incorporação de BrdU em relação ao controlo. Os valores foram expressos em média ± SD de três experiências separadas, cada uma realizada em triplicado.

TUNEL Assays

As células foram cultivadas em 8 poços lâminas de câmara durante a noite. Após o tratamento durante 24 horas com várias concentrações de CLX e SOR quer isoladamente ou em combinação, as células foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas em solução de paraformaldeído a 4% durante 25 minutos à temperatura ambiente. As células apoptóticas foram detectadas por ensaio de desoxinucleotidilo terminal de dUTP nick end-rotulagem mediada-transferase (TUNEL) usando o Kit ™ deadend Sistema Colorimétrico de TUNEL de Promega (Madison, WI), seguindo as instruções do fabricante. O número de células apoptóticas foi determinada pela contagem da percentagem de células positivas-cor castanha. Pelo menos 500 células a partir de duas preparações diferentes de células foram contadas para cada condição. As células foram visualizadas com um microscópio Axioskop (Zeiss, Alemanha).

Análises Western Blotting

Para a análise de transferência de Western, os lisados ​​celulares totais foram obtidos usando tampão RIPA (Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA) e transferência de Western foi realizada como descrito anteriormente [19], com anticorpos primários criados contra a survivina e TRIB3 /TRB3 (Abcam Limited, Cambridge, Reino Unido), DDIT3 /CHOP (Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA), β- actina, YAP1 e DKK1 (Sigma-Aldrich Srl, Milão, Itália).

Gene Expression Profiling e análise de dados

análise de expressão gênica foi realizada usando Agilent 44 K Whole Human Genome oligonucleotide microarrays ( contendo genes ~44,000), como previamente descrito [20] – [23]. Todos os experimentos de microarray foram realizadas em duplicata, utilizando corante-swap durante a etiquetagem. O software GeneSpring (Agilent, Palo Alto, CA) foi utilizado para gerar listas de genes selecionados para diferentes métodos estatísticos e de visualização. Rede e via as análises dos dados de microarranjos foram concluídas usando o software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (https://www.Ingenuity.com). Os dados microarray foi depositado no banco de dados GEO com o número de acesso GSE45340.

Semi-quantitativa RT-PCR (sqrt-PCR) Análises

dados de microarranjos foram validados por genes diferencialmente expressos selecionados pelo sqRT- PCR como descrito anteriormente [21], [23]. O gene β-actina foi utilizado como um gene de referência. Foram utilizados os seguintes iniciadores de sentido e anti-sentido, respectivamente, para amplificar BIRC5 humana ( ‘3-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-5’e’ 5′-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3), DDIT3 (CHOP) (5′-ATGGCAGCTGAGTCATTGCC-3 ‘e 5’-TCATGCTTGGTGCAGATTC -3 ‘), FABP1 (5′-CTCTATTGCCACCATGAGTTTC-3′ e 5’-GCTGATTCTCTTGAAGACAAT-3 ‘), HRK (5′-CTGTGTCCTTGGAGAAAGCTG-3′ e 5’-GTGTTTCTACGATCGCTCCAG-3 ‘), LARP6 (5’-GGAACAAGCTGGGATATGTGA- 3 ‘e 5′-GGTGGTCCTCATTCAACTCAA-3′), MT2A (5’-AAGAAAAGCTGCTGCTCCTG-3 ‘e 5′-TGGAAGTCGCGTTCTTTACAT-3′), YAP1 (5’-GGCAAAGACATCTTCTGGTCA-3 ‘e 5′-CATCATATTCTGCTGCACTGG-3′) e β-actina (5’-CACCACACCTTCTACAATGAGC-3 ‘e 5′-AGTACAGCTACGAGCAGTTCTTGTT-3’). As reacções de PCR foram realizadas usando os seguintes parâmetros: 95 ° C durante 5 min, 94 ° C durante 30 seg, 62 ° C para HRK, LARP6, 60 ° C durante BIRC5, β-actina, FABP1, MT2A, YAP1, 58 ° C para DDIT3, e 72 ° C durante 1 min, seguido por um passo de extensão final de 72 ° C durante 8 min. O número de ciclos foi ajustado para permitir a detecção na gama linear. Finalmente, os produtos de PCR foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose, fotografadas e quantificadas por varrimento densitométrico.

RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) Análise

A expressão de genes seleccionados foi quantificada por real quantitativa tempo de PCR (qPCR) utilizando SYBR Green fluorescência (Qiagen, Milão, Itália), em StepOnePlus (Applied Biosystem). QuantiTect Primer ensaios para CCND1 (QT00495285), DDIT3 (CHOP) (QT00082278), DKK1 (QT00009093), FGF19 (QT02452289), FNDC3B (QT01882748), KLB (QT02454977), TRIB3 (QT00088543), LARP6 (QT00221445) foram adquiridas da QIAGEN (Milão, Itália) e amplificado como recomendado. A expressão relativa foi calculada usando a comparativo C

método de t. A expressão do gene de interesse foi calculada como a indução de dobragem em comparação com o controlo (DMSO) e foi corrigido com o nível de expressão quantificada β-actina (QT00095431).

Resultados

Combinação de celecoxib com sorafenib sinergicamente Reduz a viabilidade celular, proliferação celular e Formação de Colónias e induz a apoptose em células de carcinoma hepatocelular

Usando o ensaio MTS que primeiro avaliou os efeitos de sorafenib (SOR) e celecoxib (CLX) sobre a viabilidade de duas células HCC humana linhas, HepG2 e Huh7, que apresentam características diferentes, incluindo diferenciação, comportamento biológico e defeitos genéticos, COX-2 níveis de expressão [21], bem como actividades Raf /MEK /ERK via [23]. Como mostrado na Figura 1, o tratamento com CLX e SOR durante 48 horas eficazmente uma diminuição da viabilidade em ambas as linhas celulares. Após 72 horas de exposição da droga, o IC

50 anos de CLX foram de 76 ± 9,9 e 72,5 ± 0,7 M em células HepG2 e Huh7, respectivamente; a IC

50s de SOR foram de 10,3 ± 1,1 e 10,1 ± 1,8 ^ M nas mesmas células. Uma vez que a COX-2 de expressão do mRNA é indetectável em células HepG2 [10], [21], a actividade de inibição de crescimento de CLX parece ser em grande parte independente da COX-2 nestas células [21]. Além disso, a actividade de inibidor do crescimento mediada por SOR parece ser independente de MEK inactivação /via ERK em células HepG2, visto que conforme relatado anteriormente, a expressão de fosfo-MEK e fosfo-ERK1 /2 é dificilmente detectável nesta célula HCC linha [23].

vitalidade celular foi avaliada pelo ensaio MTS. As células HepG2 e Huh7 foram tratadas durante 48 h com as concentrações indicadas de CLX e SOR quer isoladamente ou em combinação. Os dados são expressos como a percentagem de células de controlo e são as médias ± DP de três experiências separadas, cada uma das quais foi efectuada em triplicado. *

p Art 0,05; **

p Art 0,01 versus sorafenib sozinho, # p 0,05; ## P . 0,01 versus sozinho celecoxib

A seguir, investigou os efeitos citotóxicos da combinação SOR + CLX em ambas as linhas de células de carcinoma hepatocelular usando ensaios STM (Figura 1). A combinação SOR + CLX exibido aumentou significativamente a citotoxicidade em comparação com os agentes individuais. CDI foi usada para determinar o tipo de interacção entre os agentes (Tabela 1). Em ambas as linhas celulares forte sinergia ocorreu quando CLX foi aplicado em combinação com SOR (Tabela 1).

Os efeitos citotóxicos de tratamento de combinação foram também confirmadas usando um ensaio clonogénico (Figura 2). As células foram tratadas durante 2 dias com ou sem compostos, o meio foi aspirado e foram então lavadas com meio isento de inibidor. As células foram deixadas crescer durante 14 dias adicionais. Houve uma diminuição dependente da dose na capacidade de formação de colónias devido a tratamentos SOR + CLX combinados em ambas as linhas celulares. De facto, a combinação SOR + CLX a uma proporção de dosagem fixa resultou num aumento significativo na morte de células tumorais, conforme medido por ensaios de formação de colónias em comparação com os agentes individuais (Figura 2).

de crescimento celular de células HepG2 e Huh7 foi determinada pelo ensaio clonogénico após o tratamento com CLX e SOR quer isoladamente ou em combinação. As células foram plaqueadas dia para o outro e expostas a CLX e SOR isoladamente ou em combinação nas concentrações indicadas, durante 48 h. Após o tratamento, cada poço foi lavado e a experiência continuou durante 14 dias, na ausência de drogas. As colónias sobreviventes foram coradas (painel da esquerda) e contadas (painel da direita). Os dados são expressos como uma percentagem de colónias em células de controlo e são as médias ± DP de duas experiências separadas, cada uma das quais foi realizada em duplicado. *

p Art 0,05; **

p

. 0,01 versus cada agente sozinho

Uma vez que os efeitos anti-crescimento do indivíduo ou tratamentos combinados poderia ser devido ao aumento da morte celular e /ou diminuição da célula proliferação, examinamos separadamente os efeitos da droga sobre a indução de apoptose e síntese de DNA. No que diz respeito à apoptose, o tratamento de células HepG2 e Huh7 com até 50 uM CLX teve efeitos desprezáveis ​​sobre a indução de apoptose, tal como avaliado por ensaio de TUNEL (Figura 3A). O tratamento com SOR 7,5 ou 10 uM aumentou a quantidade de células apoptóticas HepG2 para 3,4 ± 0,85% e 5,5 ± 1,4%, respectivamente. No entanto, a combinação SOR + CLX aumentou significativamente a apoptose em células HepG2 em comparação com o tratamento com qualquer um dos agentes utilizados isoladamente (

P

0,05), enquanto que em células Huh7 foi observado nenhum efeito (Figura 3B). O ensaio BrdU foi usada para estudar os efeitos do tratamento de combinação sobre a proliferação celular. Como mostrado na Figura 3C, a combinação SOR + CLX teve um forte efeito sinérgico sobre a proliferação celular em ambas as linhas de células, exibindo valores CDI menos de 0,5 e 0,6 em todos os fármacos combinações SOR + CLX em células HepG2 e células Huh7, respectivamente.

(A) Detecção de apoptose por ensaio de TUNEL. Fotomicrografias de células HepG2 tratadas durante 24 h com as concentrações indicadas de CLX e SOR quer isoladamente ou em combinação. As células apoptóticas foram visualizadas por coloração TUNEL como descrito na secção Materiais e Métodos. (B) A análise quantitativa de células HepG2 e Huh7 TUNEL positivos. Os dados estão expressos como médias ± DP de duas experiências separadas. *

p Art 0,05, contra cada agente sozinho. (C) A proliferação celular foi avaliada por ensaio de BrdU. As células foram tratadas durante 48 h com as concentrações indicadas de CLX e SOR quer isoladamente ou em combinação. Os dados são expressos como a percentagem das células de controlo e são as médias ± DP de três experiências separadas. *

p Art 0,05; **

p

. 0,01 versus cada agente sozinho

Transcriptoma análise identifica Gene Expression alterações comuns a ambos e única para HepG2 e Huh7 Cells seguinte combinação Tratamento

Para identificar novos mecanismos possíveis da acção combinada de celecoxib e sorafenib, seus efeitos sobre a expressão genética global em ambas as linhas celulares foram investigados e comparados utilizando a tecnologia de microarray de ADN. Agilent 44 K Total Humano Genoma Oligonucleótido Microarrays (contendo ~44,000 genes) foram usadas para identificar as alterações globais de expressão de genes em linhas celulares de carcinoma hepatocelular, a seguir ao tratamento simultâneo com 50 CLX uM e 7,5 uM SOR durante 48 horas. Estas concentrações foram empiricamente estimado como as concentrações máximas de drogas que não provocam uma redução considerável na viabilidade das células (menos de 20-30%) e /ou alterações na morfologia das células durante o período de tratamento (dados não mostrados). Todos os experimentos de microarray foram realizadas em duplicata aplicação de tintura-swaps para evitar viés de rotulagem. Utilizando esta abordagem, um total de 1,986 genes diferencialmente expressas com níveis de expressão ≥2 dobra foram identificados em células HepG2, e 2,483 genes exibida ≥2 vezes a expressão em células Huh7. Entre estes, 975 genes ou 1.382 genes foram regulados positivamente e 1.011 ou 1.111 genes foram regulados negativamente em células HepG2 e Huh7, respectivamente. Deve ser enfatizado que em ambas as linhas celulares de carcinoma hepatocelular o tratamento combinado SOR + CLX produziu uma redução predominante em genes associados com o metabolismo, o controlo do ciclo celular e replicação e reparação do ADN, como numerosos genes envolvidos na replicação e reparação do ADN foram especialmente regulada para baixo em células HepG2 (ver quadro 2A e 2C). Os genes funcionalmente relacionados com a morte celular, a transdução de sinal e a regulação da transcrição foram principalmente sobre-regulada em ambas as células Huh7 (Tabela 2B e 2D) e HepG2. Os genes implicados no crescimento e proliferação celular e o transporte foram proporcionalmente ascendente e descendente modulado em células HepG2, enquanto que foram induzidos principalmente em células Huh7 (Tabela 2). Tabelas S1 e S2 visor listas completas dos genes diferencialmente expressos (≥2 vezes) nas células HepG2 e Huh7 tratados CLX SOR +, respectivamente.

Nossa transcriptomic análises fortemente confirmou a sinérgico observado efeitos do tratamento combinado de células CHC. Nós anteriormente investigados os mecanismos moleculares (incluindo perfil de expressão de genes) de celecoxib [21] e sorafenib [23] citotoxicidade em células HepG2 e Huh7. análise diagrama de Venn com base no anteriormente publicados e as listas de genes acima foram indicativos de um número substancial de genes diferencialmente expressos-que foram exclusivamente modulado em ambas as linhas celulares de carcinoma hepatocelular apenas mediante o tratamento combinado SOR + CLX (Figura 4A). Além disso, a maioria destes genes modulados exclusivamente apresentado especificidade das células HepG2 ou Huh7 evidente após tratamento SOR + CLX (ver Figura 4B). Estes dados estão de acordo com nossas descobertas anteriores sobre os diferentes mecanismos moleculares de ação citotóxica de celecoxib ou sorafenib em células HepG2 e Huh7 [21], [23]. O acima também análises levaram-nos a avaliar se células HepG2 e Huh7-tratados CLX SOR + pode ser distinguido com base no seu perfil de expressão. Na sequência de filtragem na intensidade do sinal 2 vezes, usamos um one-way teste paramétrico ANOVA (Welch

t

-test; variâncias não assumidos iguais) para selecionar genes discriminatórias. Na verdade,

t

teste com um

p

corte -valor de 0,005 selecionados 174 genes para que a expressão diferia em células HepG2 e Huh7. A análise de agrupamento com base na lista de 174 genes foi realizada utilizando o processo padrão do estado das árvores fornecida em GeneSpring, revelando a formação de dois grupos de fragmentação principais que distinguem claramente células HepG2 e Huh7 após tratamento (Figura 4C). Noventa e nove genes da lista de 174 genes foram supra-regulados em células tratadas com HepG2, em comparação com células Huh7. Principais classificações destes genes incluído a proliferação das células, transdução de sinal, o metabolismo e o transporte. Os genes regulados positivamente em células Huh7-tratados em comparação com as células HepG2 (75 genes) são principalmente envolvidos no metabolismo, a transdução de sinal, a regulação da transcrição, a resposta imune e a replicação e reparação do ADN. A lista 174 genes é apresentada na Tabela S3.

(A) analisa diagrama de Venn de genes, expressos diferencialmente (≥2 vezes) em linhas de células HepG2 e Huh7 sobre CLX (50 uM) de tratamento, SOR (7,5 ^ M) de tratamento, e tratamento SOR + CLX combinado. comparação de diagrama (B) Venn de genes comuns e distintas modulada de forma única (≥2 vezes) em células HepG2 e Huh7 única após o tratamento combinado SOR + CLX. (C) de agrupamento hierárquico com base na lista de 174 genes (diferença de 2 vezes na expressão gênica;

p

-valor de corte de 0,05) que discrimina as células HepG2 e Huh7 de acordo com a sua resposta ao tratamento combinado SOR + CLX. Vermelho significa aumento da regulação e significa verde para baixo-regulação.

Caminho e rede de análises geradas através do uso de Análise de software Ingenuity Pathways (IPA) confirmou os principais grupos de genes relacionados com funcionalmente comuns e distintas, que foram encontrados para ser expresso diferencialmente em células tratadas com CLX SOR + HepG2 e Huh7 (Figura 5). Notavelmente, as principais vias funcionais regulada para baixo em ambas as linhas celulares foram aqueles relacionados ao ciclo de cell-, replicação do DNA, recombinação e reparo, o metabolismo lipídico e pequena molécula bioquímica (Figura 5B e 5D), enquanto caminhos associados com o desenvolvimento de células e expressão gênica foram encontrados para ser geralmente induzida (Figura 5A e 5B). Vias relacionadas com a morte celular e crescimento celular e proliferação foram ambos induzida e reprimida nas duas linhas de células, embora, como se espera, em cada linha de células de carcinoma hepatocelular vias de morte celular foram induzidos mais fortemente do que suprimida (Figura 5A-5D). As duas linhas de células de carcinoma hepatocelular também algumas diferenças exibido após tratamento SOR + CLX; Assim, vias associadas com a montagem e organização celular eram predominantemente regulados negativamente em células HepG2 (Figura 5B), enquanto vias funcionalmente relacionados com a vitamina, mineral e o metabolismo de aminoácidos foram principalmente regulada negativamente em células Huh7 (Figura 5D). Por conseguinte, as vias associadas com o movimento celular, morfologia celular, a função da célula e a manutenção do ciclo celular e foram mais fortemente sobre-regulada em células HepG2 (Figura 5A), enquanto que as células Huh7 exibido sobre-regulação específica de vias relacionadas com metabolismo dos carbohidratos, o transporte molecular, pequena molécula bioquímica e replicação do DNA, recombinação e reparação (Figura 5C).

a análise de rede identificou várias redes altamente significativas com uma pontuação ≥3 que foram jusante ou sobre-regulada em células HepG2 e Huh7 mediante tratamento combinado SOR + CLX. Como esperado, para ambas as linhas de células de carcinoma hepatocelular as cinco redes com maior pontuação up-regulados foram associados principalmente com funções ligadas à morte celular e expressão genética, enquanto as redes com maior pontuação para baixo-regulados foram na sua maioria vinculadas ao ciclo celular e metabolismo (Tabela S4 ). Aqui mais uma vez, cada uma das duas linhas de células de carcinoma hepatocelular exibido alguma especificidade na modulação da rede: assim, para as células HepG2, as cinco redes com maior pontuação-regulada foram principalmente associados com a biossíntese de proteínas e transporte molecular (Tabela S4A), enquanto para as células Huh7, o topo pontuação redes up-regulamentados foram adicionalmente ligado ao conjunto de células e organização, a função das células e manutenção e ciclo celular (Tabela S4B). redes funcionais acoplado a replicação de ADN, a recombinação e reparação foram especificamente suprimida em células HepG2 (Tabela S4C), enquanto que as células Huh7 apresentado infra-regulação de redes relacionadas com a função celular e de manutenção, a modificação de ARN pós-transcricional, a montagem celular e organização, o transporte molecular e da resposta imune (Tabela S4D).

redes comuns, gerada pela fusão das quatro redes de maior pontuação que incluíam tanto a jusante e up-regulamentados genes (≤2 vezes), reconheceu alguns nós de genes relacionados com o funcionalmente que foram especificamente modulados nas duas linhas celulares de carcinoma hepatocelular após tratamento SOR + CLX (Figura 6 e 7). Em particular, em células HepG2 um número de nós de genes implicados no controlo do ciclo celular e replicação do ADN, a recombinação e a reparação (incluindo ERBB2, EPO, CCNE1, Cdc25A, CCNB1, BIRC5, NDC80, BUB1, PXN, KPNB1, KITLG, CDCA5, CDCA8 , TCF3, CDH1, CDKN3) foram regulados negativamente, enquanto que os nós gene ligado à morte celular (incluindo ASNS, SOX4, EPAS1, S100P, IRS2, LCN2, IGFBP1, TRIB3, PHLDA2, AURKB) foram principalmente induzida, com a excepção de a nó AURKB gene (Figura 6). nós genes especificamente regulada em células Huh7 incluiu uma série de reguladores do ciclo celular e transcrição (CCND1, CCNE1, TCF3, FANCA, CENPF, FGFR3, ID1, ID2, ID3, MSX1 e membros do complexo NF-kB), bem como genes envolvidos na RNA modificação pós-transcricional (CDKN2A, SREK, SRSF1), enquanto up-regulamentados nós (incluindo SP1, ATF3, SRSF1, BMP4, MSX1, KLF4, JMJD6) foram maioritariamente associados com o controle da morte celular (Figura 7) .

as quatro redes de maior pontuação foram fundidas e são apresentados graficamente como nós (produtos genes /genes) e das bordas (as relações biológicas entre os nós). A intensidade da cor do nó indica o grau de para cima (vermelho) ou para baixo (verde) -regulação. Nodes são exibidos usando várias formas que representam a classe funcional do produto do gene (quadrado = citocina; oval verticais = receptores transmembrana; retângulo = receptores nucleares; diamante = enzima; transporter rhomboid =; hexágono = factor de tradução; oval horizontal = factor de transcrição; círculo = outro). As bordas são exibidos com vários rótulos que descrevem a natureza da relação entre os nós: –

obrigará apenas

, →

age sobre

. O comprimento de uma aresta reflete os elementos de prova que o relacionamento e as bordas suportados por artigos da literatura nó-a-nó são mais curtos. bordas pontilhadas representam a interação indireta.

As quatro redes de maior pontuação foram fundidas e são apresentados graficamente como nós (produtos genes /genes) e das bordas (as relações biológicas entre os nós). As legendas das figuras são como descrito na Figura 6.

Validação das Constatações Microarray com semi-quantitativa RT-PCR (sqrt-PCR) e RT-PCR quantitativa (qRT-PCR)

para validar nossos resultados de microarray, foram selecionados arbitrariamente 13 genes diferencialmente expressos, após o tratamento de combinação. Alguns destes genes foram previamente relatado para ser afectado por sorafenib e pelo celecoxib e estão envolvidos na regulação da apoptose, resposta ao stress ER, resposta a danos no ADN, a proliferação celular e a invasão. Estes genes incluídos BIRC5 (survivin), ciclina D1 (CCND1), Harakiri (HRK), DNA-danos-inducible factor de transcrição 3 (DDIT3, também conhecido como GADD153 ou CHOP), Tribbles relacionadas com a proteína 3 (TRIB3, também conhecido como TRB3 ), metalotioneína 2A (MT2A), La membro da família domínio ribonucleoproteína 6 (LARP6), proteína associada Sim-1 (YAP1), fatty proteína de ligação de ácido 1 (FABP1, também conhecida como proteína de ligação de ácido gordo do tipo fígado, L- FABP), e Dickkopf 1 (DKK1). Além disso, a expressão de alguns outros genes recentemente referida como estando envolvida na hepatocarcinogênese, tais como beta-Klotho (KLB), factor de crescimento de fibroblastos 19 (FGF19), fibronectina de tipo III 3B (FNDC3B) contendo o domínio, também foi analisada. A expressão de genes foi quantificada por sqrt-PCR e em alguns casos por qRT-PCR em controlo e nas células tratadas. SQRT-PCR e qRT-PCR foram realizadas análises em amostras previamente utilizadas para as experiências de microarray, em seguida, repetido utilizando ARN extraído de outras duas experiências diferentes. A Tabela 3 mostra as medições de todos os genes validados de expressão gênica.

Validação das Constatações Microarray com transferência de Western

dados de microarranjos mostraram que o gene que codifica para survivina (BIRC5) significativamente caiu