Abstract

apurínico /endonuclease apirimidínico 1 (APE1), que tem a dupla função de ambos reparação de ADN e a actividade redox, tem sido relatada a ser altamente expresso no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), e isto parece ser uma característica relacionada com a resistência à quimioterapia. Neste estudo, foram identificados auto-anticorpos no soro APE1 (APE1-aABS) em doentes com NSCLC e controlos saudáveis ​​por immunoblotting e investigada a expressão de APE1-aABS por ELISA indirecta a partir do soro de 292 pacientes com NSCLC e 300 controlos saudáveis. Além disso, alterações nível sérico de APE1-aABS de 91 pacientes foram monitorados antes e após a quimioterapia. Os nossos resultados mostraram que o soro APE1-aABS pode ser detectado em ambos os pacientes com NSCLC e controlos saudáveis. Soro APE1-aABS foram significativamente maiores do que os dos controlos saudáveis ​​e estreitamente relacionada com os níveis de antigénio APE1 tanto em tecidos de tumor e no sangue periférico. Além disso, a alteração nos níveis séricos de APE1-aABS em NSCLC está intimamente associada com a resposta à quimioterapia. Estes resultados sugerem que APE1-aABS é um marcador tumoral potencial e preditor de eficácia terapêutica em NSCLC

citação:. Dai N, Cao X-J, Li H-X, Qing Y, Liao L, Lu X-F, et al. (2013) Serum APE1 auto-anticorpos: um tumor potencial novo marcador e preditor de quimioterápico Eficácia em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 8 (3): e58001. doi: 10.1371 /journal.pone.0058001

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão

Recebido: 06 de novembro de 2012; Aceito: 29 de janeiro de 2013; Publicação: 05 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Dai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 30872975 e No. 81.001.000). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Com sua crescente incidência e mortalidade, o câncer de pulmão tornou-se a maior causa de mortes por câncer e um problema clínico desafiador em todo o mundo [1], [2]. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é o principal tipo de câncer de pulmão, que é muitas vezes diagnosticada em um estágio avançado de modo que os pacientes têm poucas perspectivas de tratamento eficaz e curativo, e isso se manifesta com taxas de sobrevida em 5 anos de 15 % [3].

Triagem de biomarcadores precoces NSCLC, o desenvolvimento de indicadores de eficácia terapêutica, e novas drogas são elementos fundamentais para melhorar ambos os prognósticos e sobrevida dos pacientes [4], [5]. No entanto, os presentes biomarcadores e preditores para NSCLC ainda carecem de sensibilidade e especificidade adequadas [6]. O antigénio carcinoembrionário é um dos marcadores de tumores mais amplamente estudados em NSCLC, com uma sensibilidade global de apenas cerca de 40% [7]. Alguns novos candidatos marcador sérico como o fator de crescimento endotelial vascular, factor de células estaminais, citocinas angiogênicas e fator /factor de dispersão de crescimento de hepatócitos pode ser potencialmente importante, mas a maioria deles não foram estabelecidas como indicadores prognósticos clínicos independentes [8]. Portanto, mais estudos são necessários para descobrir novos biomarcadores para ajudar na triagem de NSCLC, o que irá melhorar significativamente o resultado terapêutico desta doença maligna [9].

Circulação anticorpos contra antígenos associados a tumores (TAAs) são uma classe de novos biomarcadores séricos mostrando propriedades muito interessantes, especialmente no diagnóstico precoce de cancros. Os auto-anticorpos estão presentes no soro de pacientes numa fase inicial quando os tumores não podem ser detectadas clinicamente, mesmo antes de TAAs pode ser detectada [10], [11]. A persistência e estabilidade de auto-anticorpos séricos são principais vantagens sobre outros biomarcadores séricos de uso corrente [12]. Elas mostram um tempo de vida mais longo (t

1/2 entre 7 e 30 dias) no soro, em comparação com TAAs, são altamente estáveis ​​no sangue, e não estão sujeitas a proteólise assim como outros polipéptidos de [13], [14]. Além disso, moléculas como bioquimicamente bem conhecidos, os anticorpos podem ser detectados por vários reagentes e técnicas disponíveis tanto simples e barata. Ao longo dos últimos anos, um aumento artigos demonstraram que o controlo das pessoas em risco aumentado de cancro para a presença de auto-anticorpos no soro pode permitir a detecção e /ou prognóstico precoce em diferentes cancros, incluindo NSCLC [15] – [19]. Auto-anticorpos contra p53, NY-ESO-1, survivina e CAGE foram mostrados para ser biomarcadores de diagnóstico para doentes com cancro do pulmão [20] – [22]

apurínicos /endonuclease apirimidinico 1 (APE1), que tem a. dupla qualidade de tanto a atividade de oxidação-redução (redox) reparo de DNA e, é o principal endonuclease AP da via excisão de bases de reparação. Ela desempenha um papel importante na progressão do NSCLC, bem como a manutenção da estabilidade do genoma [23]. expressão elevada e ectópica de APE1 em tecidos tumorais está intimamente ligada ao mau prognóstico e quimioterapia e radio-resistência em NSCLC [24] – [26]. Recentemente, Katsumata et al primeira identificados auto-anticorpos APE1 (APE1-aABS) no soro de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico [27], mas temos pouco conhecimento sobre APE1-aABS em NSCLC. Postulamos que a proteína APE1 anormalmente abundante ou ectópica de tecidos tumorais pode entrar em soro e que APE1-aABS pode ser detectado no sangue periférico destes pacientes com NSCLC.

Neste estudo, nós detectamos APE1-aABS usando tanto imunotransferência e ensaio ELISA, em seguida, investigou a correlação entre APE1-aABS, antigénio sérico APE1 e a expressão da proteína APE1 em tecidos tumorais. Além disso, avaliamos valor diagnóstico APE1-aABS ea correlação com a eficácia terapêutica em pacientes com NSCLC. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que identifique soro APE1-aABS no câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

Os pacientes

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Faculdade de Medicina Daping, Third Military Medical University, China e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes e controles saudáveis. As amostras de soro foram obtidas de 292 pacientes com NSCLC e 300 controles saudáveis ​​de janeiro de 2007 a junho de 2008. As características demográficas e características clínicas dos grupos estudados são ilustradas na Tabela 1. Noventa e um pacientes que receberam dois ciclos de esquema contendo platina foram monitorados antes e após a quimioterapia. A avaliação histopatológica foi realizada separadamente por dois patologistas, e, em seguida, um consenso foi feita em avaliações discordantes. O sistema de estadiamento foi realizada de acordo com a classificação da AJCC 2003. A eficácia terapêutica foi definida pelos critérios de avaliação da resposta em tumores sólidos, os quais classificam a resposta em quatro categorias: resposta completa (RC), resposta parcial (PR), a doença estável (SD) e doença progressiva (DP). Para análise dos dados, CR e PR foram combinados como respondedores que eram sensíveis à quimioterapia, enquanto que SD e PD foram agrupados como não-respondedores. Os pacientes foram excluídos se tivessem desordens imunológicas, evidência de aguda ou recente (lt 2 meses). Infecções, trauma recente grande, cirurgia ou tratamento com agentes imunossupressores

Collection Serum

amostras de sangue periférico foram obtidas a partir de controlos saudáveis ​​e de pacientes após o diagnóstico, mas antes de quaisquer operações. Para os 91 pacientes tratados com NSCLC de dois ciclos de quimioterapia continha-platina, as amostras de soro foram obtidas antes da quimioterapia e um mês após a quimioterapia. As amostras de sangue total foram prontamente centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos e o sobrenadante foi armazenado a -80 ° C até à sua utilização.

Cultura celular

células de adenocarcinoma de pulmão humano (A549) foram adquiridos da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) e cultivadas em meio RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades /mL de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram cultivadas em 5% de CO2 a 37 ° C.

A análise dot blot e Western blot

A proteína de fusão de comprimento completo APE1 [com hexa-histidina (His) etiqueta, construídos e purificado de nosso laboratório] foi pontilhada para uma membrana de NC. A membrana foi bloqueada durante 2 h a 37 ° C com tampão de bloqueio (BSA a 5% em TBST). A membrana foi então incubada a 4 ° C durante a noite com soro de pacientes e controlos saudáveis ​​1:500 diluídos em tampão de bloqueio. Depois de se lavar com TBST, a membrana foi incubada durante 1 h a 37 ° C com IgG anti-humana (diluição 1:10000, Sigma, EUA) de cabra marcado com HRP.

As expressões de soro foram APE1-Abbs analisados ​​por meio de análises de Western blot [27]. A proteína extraída a partir de células A549 e-His APE1 proteína de fusão foi separado por 10% SDS-PAGE e depois transferidos para membrana de NC. A membrana foi bloqueada durante 2 h a 37 ° C com tampão de bloqueio. A membrana foi então incubada a 4 ° C durante a noite com o anticorpo monoclonal anti-humano APE1 (1:5000 diluição) e soro de doentes com cancro do pulmão e controlos saudáveis ​​(1:500 diluição). A membrana foi incubada durante 1 h a 37 ° C com cabra marcado com HRP anti-IgG de ratinho (diluição 1:10000) e IgG de cabra marcado com HRP anti-humano (diluição 1:10000).

enzimática imunoensaio (ELISA)

indireto ELISA foi utilizado para detectar soro APE1-aABS e realizado da seguinte forma: (1) as placas de microtitulação (450~500 ng /cm

2, 8 bem × 12 tiras , Costar Biosciences Inc, EUA) foram revestidos com APE1-His proteína de fusão de 100 ul diluídas com tampão de revestimento (/L de tampão carbonato 0,1 mol, pH 9,6) a 1,0 ug /ml e incubou-se a 4 ° C durante a noite; (2) As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem (0,05% de PBST), 300 ul /poço, em seguida, os locais não específicos nos poços foram bloqueados com 200 ul de tampão de bloqueio (5% BSA em PBS) foram incubadas durante 2 h a 37 ° C; (3) Após três lavagens, com 100 ul /poço de amostras de soro diluídas foram incubadas 1:300 durante 1 h a 37 ° C, o PBS foi utilizado como o controlo de calibração; (4) Os compostos não ligados foram lavados, 100 ul /poço de cabra marcado com HRP de IgG anti-humano (concentração de trabalho recomendado 1:50000 diluição) foram incubadas durante 45 min a 37 ° C; (5) Após a lavagem seis vezes, com 100 uL /​​poço de TMB (Pierce, EUA) de solução de substrato foi incubado durante 10 min a 37 ° C; (6) A reacção enzimática foi parada por 2 mol /L H

2SO

4 (50 uL /​​poço) e, em seguida, a densidade óptica (OD) foi medida por espectrofotometria de microplacas a comprimento de onda de referência (450 nm). Todas as amostras foram testadas duas vezes em duas placas separadas

Melhoria da sanduíche de ELISA foi utilizado para detectar o antigénio no soro e APE1 realizada como se segue: (1). As placas de microtitulação foram revestidas com anticorpo monoclonal APE1 100 ul de murganho anti-humano ( 1:40000 diluição) incubou-se a 4 ° C durante a noite; (2) os poços foram bloqueados durante 2 h a 37 ° C; (3) 100 ul /poço de amostras de soro foram incubadas durante 1 h a 37 ° C, o PBS foi utilizado como o controlo de calibração; (4) 100 ul de anticorpo de coelho anti-humano policlonal APE1 (1:5000 diluição) foram incubadas durante 1 h a 37 ° C; (5) 100 ^ l /poço de IgG anti-coelho de cabra marcado com HRP (1:5000 diluição) foram incubadas durante 45 min a 37 ° C; (6) Após a lavagem seis vezes, com 100 uL /​​poço de solução de substrato TMB foi incubada durante 10 min a 37 ° C e parada por 2 mol /LH

2SO

4, a densidade óptica (OD) foi medida por microplacas espectrofotometria no comprimento de onda de referência (450 nm). Todas as amostras foram testadas duas vezes em dois pratos separados.

APE1 imuno-histoquímica e Scoring

A expressão da proteína APE1 de pacientes com NSCLC foram analisados ​​utilizando imuno-histoquímica. As lâminas foram cortadas em secções de 4 | iM e incubadas com rato anti-humana anticorpo monoclonal APE1 (1:2000 diluição). diagnóstico histológico de cada espécime foi confirmada por um patologista como estudos anteriormente com APE1 [26]. Marcados pela percentagem de células coradas e como intensidade de coloração com estudos anteriores [28], [29], os tecidos foram classificados em quatro categorias: 0, 1, 2 e 3 correspondentes a expressão negativa, fraca, moderada e forte. A pontuação 0 e marcar 1 foram considerados baixos expressão, enquanto a pontuação 2 e marcou 3 foram considerados altos expressão.

Análises Estatísticas

Os dados foram expressos como mediana ou média ± desvio padrão (SD) . As associações entre as características clínicas e auto-anticorpos APE1 ou antígeno foram avaliadas pelo

t

-teste, análise de teste e de uma via independente do qui-quadrado de variância. A associação foi avaliada pela curva receiver operating characteristic (ROC) foi utilizado para avaliar a sensibilidade e especificidade. a força de correlação foi avaliada através do teste de correlação de Spearman. As associações entre os níveis APE1-aABS de pré e pós-quimioterapia foram analisados ​​por emparelhado

t

-teste. Em todos os cálculos,

p Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os procedimentos estatísticos foram realizados usando o software GraphPad Prism, versão 5.0 e software SPSS, versão 13.0 para Windows.

Resultados

Identificação do soro APE1-aABS em controles saudáveis ​​e NSCLC pacientes

Utilizando as amostras de soro por dot blot e parafuso Ocidental análises, verificou-se que em ambos os pacientes com NSCLC e controlos saudáveis, auto-anticorpos no soro reconheceu purificado APE1-His proteína de fusão e proteína APE1 na lise A549 de células inteiras (Fig. 1A e 1B ). Além disso, os sinais do ponto e da banda imunorreactiva de doentes com NSCLC foram mais fortes do que os controles saudáveis. Estes resultados sugeriram que APE1-aABS pode ser detectado no soro de ambos os pacientes com NSCLC e controlos saudáveis.

A, resultados representativos de detecção de soros APE1-aABS por ensaio dot blot. Lanes 1~5: soro de indivíduos saudáveis. Lanes 6~10: soro de pacientes com NSCLC. B, soro APE1-aABS de pacientes saudáveis ​​e com NSCLC foram detectados por análise de Western blot. Pista M, marcadores de peso molecular de proteínas; APE1, proteína de fusão APE1 com Sua tag; A549, proteína celular total extraído a partir de células A549; Anti-His, a proteína de fusão APE1 detectado pelo seu anticorpo.

A distribuição de APE1-aABS em soro de controles saudáveis ​​e NSCLC pacientes

De acordo com as características demográficas e características clínicas de pacientes com NSCLC e controlos saudáveis ​​(descrito na Tabela 1), não houve diferença estatística na distribuição da idade, sexo e estado de tabagismo entre os dois grupos. método de ELISA indirecto foi construído (descrito na Fig. S1) e utilizados para detectar a prevalência de anticorpos séricos contra APE1. Entre 292 pacientes com NSCLC, a média com SD da concentração APE1-aABS foi de 0,79 ± 0,40 (OD

450), que foi significativamente maior que 0,47 ± 0,22 (OD

450) em controles saudáveis ​​(

p

= 0,000,

t

-teste) (Fig. 2). Os níveis de APE1-aABS mostraram uma distribuição normal.

Entre 292 pacientes com NSCLC, a média com SD da concentração APE1-aABS foi de 0,79 ± 0,40 (OD

450), que foi significativamente maior que 0,47 ± 0,22 (OD

450) em voluntários saudáveis ​​(

p

= 0,000,

t

-teste).

Nós também investigou a relação entre APE1- aABS e as características clínicas. Entre 300 controles saudáveis, a média com SD da concentração APE1-aABS de fumantes saudáveis ​​foi de 0,47 ± 0,01 (OD

450), que houve diferença significativa com os não-fumantes de controles saudáveis ​​(0,48 ± 0,003, OD

450) (

p

= 0,679,

t

-teste). Estes resultados sugerem que os níveis séricos APE1-aABS parecia não responder a condição de fumante. Além disso, os resultados mostraram que o soro APE1-aABS de doentes com NSCLC não se correlacionam com os parâmetros clínicos tais como género, diferentes fases TNM e tipos histopatológicas, incluindo o estado de fumar, como apresentado na Tabela 2 (

P

0,05) . Embora os pacientes no estágio IV tiveram uma maior taxa de APE1-aABS positivo (71/172, 41,28%) do que na fase III (27/81, 33,33%), a diferença não foi estatisticamente significativa ((

p

0,05)

o valor diagnóstico da APE1-aABS em NSCLC

Nós exploramos ainda mais o valor de diagnóstico potencial de APE1-aABS em NSCLC com base no princípio de valor de corte [.. ,,,0],30], o nível de corte de APE1-aABS foi calculada como média + 2DP (0,47 + 2 x 0,22 = 0,91) de 300 amostras de soro de indivíduos saudáveis. Assim, 113 (38,70%) pacientes com NSCLC, contra 8 (2,67%) saudável controles, foram definidos como APE1-aABS positiva, o que indica que a diferença entre os dois grupos foi significativa (

p

= 0,000,

qui-quadrado

teste).

o desempenho de todas as amostras de soro foi resumido com uma curva ROC. o desempenho preditivo do nível APE1-aABS foi determinada pela plotagem da sensibilidade (verdadeiro positivo) contra uma especificidade valores (falsos positivos). Para cada possível corte de ponto, a sensibilidade resultante e especificidade foram indicados como um ponto sobre o gráfico. A área debaixo da curva (AUC) foi de 0,745 (Fig. 3), sugerindo que a APE1-aABS foi significativa como um biomarcador potencial de diagnóstico.

As concentrações séricas de níveis APE1-aABS entre 292 e 300 pacientes com NSCLC saudável controlos foram determinadas por ELISA. Os potenciais de diagnóstico de APE1-aABS foram avaliados por curvas ROC. O valor AUC foi 0,745.

Análise de Correlação entre APE1-aABS, Serum APE1 Antigen e APE1 expressão da proteína no NSCLC tecidos

Considerando que, para a resposta APE1-aABS a ocorrer, o APE1 antígeno precisa ser detectado para mostrar seu relacionamento. Um total de 42 tecidos NSCLC foram investigadas a expressão da proteína APE1 usando imuno-histoquímica. APE1 se observou coloração três localizações subcelulares nos tecidos tumorais: o núcleo (8/42, 19,05%), o citoplasma (3/42, 7,14%) e tanto no núcleo e no citoplasma (31/42, 73,81%) como mostrado na Fig . 4 e Tabela S1. Os níveis séricos APE1-aABS do grupo expressão núcleo houve diferença estatística com o grupo expressão ectópica (incluindo expresssion citoplasma e núcleo co-expressão /citoplasma) (

p

= 0,610, mostrada na Tabela S1). Seis casos NSCLC (15%) mostraram forte expressão APE1, 20 casos (50%) e 12 casos (30%) mostraram expressão moderada e fraca, respectivamente. A expressão elevada APE1 (escore 2 e 3) e baixa expressão (pontuação 0 e 1) nos tecidos NSCLC foram demonstrou não haver diferença significativa entre a idade, sexo, tabagismo, tipo histológico e estágios TMN (

p Art 0,05,

teste do qui-quadrado

, mostrada na Tabela S2), que eram o mesmo que o anteriormente comentários [24], [31]. Curiosamente, uma correlação positiva entre o soro APE1-aABS e expressão da proteína APE1 em tecidos NSCLC foi encontrado, o que foi estatisticamente significativo (

P

0,001, Spearman) e com o coeficiente de correlação 0,50, como se mostra na Tabela S1.

Representante APE1 imunocoramento tecidos NSCLC. APE1 coloração foi observado três locais subcelulares em tecidos tumorais: o núcleo, citoplasma e tanto no núcleo e citoplasma. As amostras foram pontuadas como se segue: 0, ausência ou na percentagem de células positivas para menos do que 25%; 1, a percentagem de células positivas entre 25% e 50%; 2, a percentagem de células positivas entre 50% e 75%; 3, a percentagem de células positivas mais than75%.

Além disso, analisamos o antígeno APE1 soro em 137 pacientes com NSCLC que tinham sido testados para APE1-aABS usando melhorou ensaio ELISA sanduíche. A média com SD da concentração de antígeno no soro APE1 foi de 0,73 ± 0,41 (OD

450), e não houve diferença significativa entre o antigénio APE1 soro e características clínicas (

p Art 0,05, mostrada na Tabela S3 ). Como esperado, encontramos antígeno APE1 e APE1-aABS no sangue periférico também foram correlacionados positivamente, com o coeficiente de correlação de ser 0,50 e estatisticamente significativa (p 0,001, Spearman). Estes achados sugerem que as expressões de auto-anticorpos APE1 estavam intimamente relacionada com os níveis de antígeno APE1.

Aumento de soro APE1-aABS entre pré e pós-quimioterapia está associada a terapêutica Eficácia

Para determinar a correlação entre o nível de APE1-aABS soro e resposta terapêutica, os níveis APE1-aABS entre pré- e pós-quimioterapia foram analisados ​​em 91 pacientes com NSCLC que receberam 2 ciclos de regime à base de platina. Geralmente, níveis séricos de APE1-aABS aumentaram significativamente após quimioterapia (

P

= 0,008) (Fig. 5A). Entre 91 pacientes, 11 (12,09%) pacientes obtiveram PD, 38 (41,76%) pacientes obtiveram SD, 30 (32,97%) pacientes atingidos PR, e 12 (13,19%) pacientes alcançaram CR. soro pré-quimioterapia APE1-aABS de pacientes que eram sensíveis à quimioterapia foram significativamente menores do que a dos não-respondedores (

P

= 0,000) (Fig. 5B). Séricos APE1-aABS de respondedores após a quimioterapia foram significativamente aumentados (

p

= 0,000), enquanto APE1-aABS de não-respondedores não se alterou significativamente (

p

= 0,393), como mostrado na FIG. 5 e Tabela 3.

O nível sérico de APE1-aABS foi muito maior nos pobres grupo de resposta quimioterápico do que no bom grupo de resposta (

p

= 0,000). Houve uma diferença significativa no grupo com boa resposta à base de platina quimioterapêutico antes e após a quimioterapia (

P

0,001), enquanto que não houve diferença no grupo com fraca resposta quimioterapêutico à base de platina antes e depois quimioterapia (

p

= 0,393). * Antes da quimioterapia versus depois quimioterapia (

p Art 0,001).

p

valor foram obtidos depois de comparar os níveis APE1-aABS de quimioterapia pré e pós, conforme determinado pela emparelhado

t

-teste.

Discussão

estudos experimentais têm demonstrado que os autoanticorpos são potenciais biomarcadores para o diagnóstico precoce do câncer e os preditores de resposta ao tratamento. No entanto, porque a auto-anticorpos são parte da resposta imunitária normal, auto-anticorpos candidatos para a detecção precoce do cancro e no prognóstico de cancros devem ser contra antigénios relacionados com oncogénicos. A este respeito, os auto-anticorpos para as proteínas de reparação de ADN são candidatos promissores. proteínas de reparação do ADN desempenham papéis críticos não só para manter a estabilidade genómica, mas também na progressão de cancro do pulmão, [33] [32]. Ambos os antígenos e anticorpos para antigénios envolvidos nas vias de reparo de DNA, tais como p53 [34] – [36] e Ku ​​[37] – [39], foram apontados como fatores envolvidos na tumorigênese e como biomarcadores em câncer de pulmão, câncer de mama, e leucemia.

Como uma das proteínas de reparação de ADN, APE1 também desempenha um papel importante na sobrevivência celular, e a sua elevada expressão está correlacionada com as características tumorais [40], [41]. Tendo as duplas funções de reparação do ADN e a actividade redox, é não só responsável pela reparação de locais de ADN de AP provocados por oxidação e dano de alquilação, de modo a manter a integridade genómica [42], mas também funciona como um factor de redox que regula a actividade de ligação a ADN de factores de transcrio tais como p53, NF-kB e AP-1 que desempenham um papel crucial na supressão da carcinogénese e progressão tumoral [43], [44]. Usando RT-PCR e coloração imuno-histoquímica, estudos anteriores mostraram que as mudanças nos níveis e /ou padrões de expressão APE1 em tecidos NSCLC e no sangue periférico ocorreu no período inicial de desenvolvimento de neoplasias e foram intimamente relacionada com o desenvolvimento do tumor, progresso e prognóstico desfavorável [31 ], [45], [46]. Estes estudos sugerem que o antigénio APE1 poderia ser um candidato para o rastreio do cancro, o diagnóstico auxiliar cedo, e avaliação prognóstica e preditiva em muitos tecidos de câncer incluindo NSCLC [47], [48]. O presente estudo validou um ensaio para a detecção de auto-anticorpos APE1 tanto no sangue periférico de doentes com NSCLC, bem como controlos saudáveis. Utilizando imunotransf erência e análise ensaio ELISA, que mostrou que APE1 é um antigénio auto-imune específica que estimula organismos para gerar anticorpos anti-APE1. associações estatisticamente significativas entre APE1-aABS e NSCLC são demonstradas pela primeira vez.

O mecanismo de como a proteína APE1 desencadeia a resposta imune ainda não é completamente claro. Nós presumimos o possível mecanismo é: a maioria dos tecidos tumorais têm APE1 sobre-expressão e translocação. A multiplicação de células tumorais é excessivamente rápida. Com a apoptose celular e necrose espontânea contínua, um grande número de proteínas celulares são libertados para o sangue e não pode ser removido oportuna. O sistema imune detecta as proteínas celulares que são sobre-expressos em carcinogénese, translocalização citoplasmática, estabilização desregulada, e mutação ou degradação alterada e, subsequentemente, produz auto-anticorpos em resposta à presença destes antigénios aberrantes [49]. Assim, procurou-se verificar se vários APE1 localização expressão pode contribuir para a geração APE1-aABS, mas o resultado mostrou que os níveis de soro APE1-aABS entre o grupo de expressão núcleo e o grupo expressão ectópica houve diferença (

p

= 0,610). Este resultado deve ser investigada em um tamanho de amostra maior no futuro. Considerando-se que a carga tumoral pode induzir a um alto nível de APE1-aABS, também vamos investigar as APE1-aABS antes e após a cirurgia em nossos novos estudos para comprovar esta hipótese.

Em nosso estudo, a presença de APE1- aABS mostrou a possibilidade de utilização como um biomarcador para NSCLC. A descoberta de expressão APE1-aABS no soro de 38,70% (113/292) dos doentes com NSCLC foi estatisticamente significativamente mais elevada do que a de controlos saudáveis ​​(2,67%, 8/300) (

P

= 0,000). O valor da área sob a curva ROC de APE1-aABS era 0,745, significativa para um modelo preditivo, porque na detecção ELISA, um valor de AUC de 0.7~0.9 (70% -90%) indica associação moderada entre previsão e resultado verdadeiro [ ,,,0],50]. Além disso, o APE1-aABS revelou correlacionar-se bem com os níveis de antigénio APE1 tanto em tecidos e no sangue periférico NSCLC no presente estudo. Notou-se que a correlação entre a expressão do mRNA APE1 em tecidos NSCLC, tecidos normais e sangue tinha sido demonstrado ser significativamente correlacionados, o que sugere que a medição dos níveis de mRNA de APE1 em amostras de sangue periférico poderia, em vez de amostras de tecido para determinar os fatores prognósticos e preditivos em NSCLC [31]. Dessa forma, pode permitir testar simplesmente com APE1-aABS em amostras de sangue periférico em vez de amostras de tecido para determinar o diagnóstico e fatores prognósticos em pacientes com NSCLC.

No entanto, embora promissores, estes novos achados exigem uma investigação mais aprofundada e cuidadosa interpretação a fim de chegar a conclusões decisivas porque a diferença de níveis séricos APE1-aABS entre NSCLC e controles saudáveis ​​não foi muito alta. As variações de APE1-aABS na população do estudo são extremamente elevados, embora os níveis de soro APE1-aABS mostraram uma distribuição normal. As razões para estes não são claros, mas pode estar relacionada com a selecção do paciente, as diferenças na detecção de epitopo, ou as limitações da matriz e da natureza das respostas de auto-anticorpos em cancro. Vale ressaltar que APE1-aABS em vários cancros, incluindo mais extensas amostras de câncer de pulmão, precisam ser verificadas, a fim de estabelecer o significado clínico dos anticorpos anti-APE1. Novos estudos sobre se APE1-aABS têm eficácia diagnóstica ou podem ser proveitosamente combinadas com outros marcadores tumorais serão resumidos em nosso próximo estudo.

Histologia é um indicador de diagnóstico básico em pacientes com NSCLC [51]. Como um fenótipo, pode ser mais reprodutível e consistente em relação à informação sobre hábitos de fumar, especialmente neste tipo de estudo retrospectivo [23]. Mitsudomi

et al

informou que os auto-anticorpos p53 foram significativamente mais prevalente em pacientes com carcinoma de células escamosas (27%) do que naqueles com adenocarcinoma (15%) (

p

= 0,05), enquanto não também houve diferença estatisticamente significativa na incidência de auto-anticorpos p53 entre o grupo precoce da doença (fase I e II) (14%) e no grupo doença avançada (estágio IIIa~IV, 30%) (

p = 0

0,0079) [52]. autoanticorpos Villin1 CK18 e são considerados como sendo marcadores úteis em adenocarcinoma pulmonar [53]. Por isso, investigamos a relação entre os níveis de APE1-aABS e histotipo câncer de pulmão. Nós descobrimos que o nível de soro APE1-aABS não se correlacionou com os tipos histopatológicos (carcinoma de células escamosas ou adenocarcinoma) e diferentes fases TNM ou parâmetros clínicos, como status sexo e tabagismo. Estes dados foram semelhantes aos estudos anteriores de proteína APE1 em tecidos de cancro do pulmão [31], [54].

alta expressão de proteína APE1 foi reportado que associe estreitamente com a resistência à cisplatina em cancro do ovário [29], cabeça e pescoço de células escamosas [31], e NSCLC [26]. Os dados deste manuscrito confirmar ainda mais essa relação entre APE1 e chemoresistance à base de platina. Antes de quimioterapia, foi observado que os níveis APE1-aABS dos grupos CR + PR que eram sensíveis ao tratamento à base de platina foram significativamente menores do que a dos grupos SD + PD que eram resistentes à quimioterapia (

P =

0,000). Além disso, os níveis de APE1-aABS foram significativamente aumentados após a quimioterapia, especialmente no grupo de resposta positivo (

P

= 0,000). Até à data, o mecanismo de APE1 envolvida na resistência à quimioterapia à base de platina permanece obscura. Chattopadhyay

et ai mostraram que acetilado APE1 poderia interagir com a proteína de forma estável Y-box-binding 1 e aumentar a sua ligação ao elemento de Y-box que conduz à activação do gene de resistência a múltiplos fármacos MDR1 [55]. Wu

et ai relataram que citoplasmática APE1 poderia aumentar a malignidade do tumor de pulmão através da activação de NF-kB, o que sugere que a combinação de cisplatina com inibidores redox específicas poderiam melhorar a resposta quimioterapêutico [56]. Presumimos que os reagentes de platina pode matar células de cancro do pulmão, induzir a necrose celular, libertação de proteína APE1 da carga tumoral para o meio extracelular e a circulação, e posteriormente desencadear a resposta imune a desenvolver-APE1 aABS. Teoricamente, os pacientes resistentes quimioterapia terá células tumorais menos a morte após o tratamento, solte menos antígeno APE1 para o sangue e induzir a um aumento menor de soro APE1-aABS. Pelo contrário, os pacientes que são sensíveis à quimioterapia à base de platina deve conter mais APE1-aABS no sangue periférico após o tratamento. Além disso, antes da quimioterapia, os pacientes têm mais APE1-aABS no sangue periférico, indicando que mais proteína APE1 está presente em tecidos tumorais em comparação com o tecido normal, conduzindo assim a resistência ao tratamento à base de platina. Nossos dados apenas verificar esses pontos. Portanto, acreditamos que as APE1-aABS pode ser usado para prever a resposta à quimioterapia em NSCLC antes e após o tratamento à base de platina.

Em conclusão, identificou-se que os auto-anticorpos contra a proteína APE1 estava presente no soro tanto de câncer de pulmão pacientes e controles saudáveis.