Abstract

Estudos recentes têm conferido que o

RAD51C Comprar e

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genes, que codificam para as proteínas essenciais envolvidas na recombinação homóloga, são os genes de susceptibilidade cancro do ovário (OC) que podem explicar os riscos genéticos em pacientes de alto risco. Foi realizada uma análise de mutações em 171 alto risco

BRCA1

e

BRCA2

pacientes OC negativos, para avaliar a frequência das hereditária

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e

RAD51D

variantes na população checa. A análise envolveu sequenciação directa, derretimento de alta resolução e análise de sonda dependente de ligação múltipla. Foram identificados dois (1,2%) e três (1,8%) inativação de mutações germinativas em ambos os respectivos genes, dos quais dois (c.379_380insG, p.P127Rfs * 28 em

RAD51C Comprar e c.879delG, p.C294Vfs * 16 em

RAD51D

) eram novos. Curiosamente, uma história indicativo de câncer família não estava presente em quatro operadoras. Além disso, as idades nos diagnósticos de OC em portadores da mutação identificados foram substancialmente mais baixos do que os relatados em estudos anteriores (quatro portadores eram menores de 45 anos). Além disso, nós também descreveu variantes missense raros, dois em

RAD51C

e uma em

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cujo significado clínico precisa ser verificado. Truncando mutações e variantes missense raros apurados em pacientes OC não foram detectadas em 1226 amostras de controlo. Embora a frequência cumulativa de

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e

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truncando mutações em nossos pacientes foi menor do que a dos

BRCA1 Comprar e

genes BRCA2

, pode explicar OC susceptibilidade em aproximadamente 3% dos doentes de alto risco OC. Portanto, um

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e

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análise deve ser transposta para o teste abrangente multi-gene para pacientes de OC de alto risco, incluindo doentes OC início precoce sem história familiar de câncer.

Citation: Janatova M, Soukupova J, J Stribrna, Kleiblova P, Vocka M, Boudova P, et al. (2015) Análise de Mutantes do

RAD51C

e

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Genes em alto risco de ovário pacientes com câncer e famílias provenientes da República Checa. PLoS ONE 10 (6): e0127711. doi: 10.1371 /journal.pone.0127711

Editor do Academic: Klaus Brusgaard, Hospital Universitário de Odense, Dinamarca |

Recebido: 23 Janeiro, 2015; Aceito: 17 de abril de 2015; Publicação: 09 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Janatova et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Agência Grant interna, Ministério da Saúde, República Checa, NT13343, (https://www.mzcr.cz/Cizinci/) ; PP, Universidade Charles, em Praga, PRVOUK-P27 /LF1 /1, (https://www.cuni.cz/UKEN-1.html); MJ, da Universidade Charles, em Praga, SVV-UK 3362-2014, (https://www.cuni.cz/UKEN-1.html); PB. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário (OC) é a neoplasia maligna ginecológica mais letal, embora represente apenas 3% dos cânceres femininos em todo o mundo. Seu prognóstico desfavorável relacionado com uma elevada percentagem de diagnóstico em estágio final classifica OC ao quarto lugar entre as causas relacionadas ao câncer mais comum de morte na população feminina [1]. Sua incidência na República Checa é de 23 /100.000 indivíduos e valores de mortalidade a 15 /100.000 indivíduos [2].

O fator de risco mais importante é uma história OC família. Supôs-se que a predisposição hereditária responsável por pelo menos 10% dos casos de criminalidade organizada [3]. Portanto, a identificação da mulher que carregava as mutações patogênicas em genes OC-susceptibilidade é uma tarefa importante, que permite a prevenção OC costurado em população de alto risco. A maioria dos OC hereditária (HOC) casos também estão associados com um risco aumentado de cancro da mama (BC) e as mutações patogênicas mais frequentes na mama e /ou ovário hereditários (HBOC) famílias de câncer afetam o

BRCA1

gene e, em menor medida, também in

BRCA2

[4]. Ambos os genes desempenham um papel importante na reparação de quebras de ADN de cadeia dupla (DDSB). Recentemente, genes adicionais foram descritos como associados a HOC, entre eles o

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paralogs

RAD51C

e

RAD51D

.

Os dois genes codificam para proteínas envolvidas na manutenção da estabilidade do genoma e participam na reparação DDSB mediada por recombinação homóloga [5,6]. Estudos iniciais relatou o

RAD51C

gene (MIM: 602774) como outro anemia de Fanconi (FA) gene designado como

Fanco

porque suas mutações germinativas bialélicos foram encontrados em um paciente com FA-como fenótipo correspondente o grupo de complementação S [7]. O trabalho pioneiro de Meindl et al. mostrou que

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é um gene de susceptibilidade OC com uma frequência de mutação de 1,3% em pacientes HBOC [8]. Desde então, outros estudos têm demonstrado o papel do RAD51C

gene no desenvolvimento OC em até 2,5% de HBOC famílias de alto risco [9,10,11,12] incluindo rearranjos genómicos grandes raras [13] .

Um estudo realizado por Loveday et al. relataram que mutações germinativas no gene

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(MIM: 602954) conferem suscetibilidade a OC em 0,9% das famílias HBOC (predominantemente com mais de um caso de OC) e estima o risco relativo (RR) em 6,3 para OC e 1,32 para o BC [14]. Vários outros estudos têm confirmado o seu papel na OC susceptibilidade [15,16,17,18]

Enquanto individualmente raros, junto todos os genes moderada penetrância pode contribuir para uma parte significativa do risco de OC.; No entanto, as suas frequências variar em populações diferentes [19]. O objetivo do nosso estudo foi determinar a frequência de mutações germinativas no

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e

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entre os pacientes Checa OC de alto risco testadas negativamente para o

BRCA1

e

BRCA2

mutações.

Métodos

Os pacientes

Nós analisadas 171 amostras de DNA (obtidos a partir de sangue periférico) do

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e

BRCA2

pacientes OC negativas coletadas em nosso instituto, entre 2000 e 2013. Eles pertenciam a ser um grupo familiar (N = 62) ou um grupo sem história familiar de câncer (N = 109; Tabela 1) [20]. O grupo controle foi composto por amostras de DNA anónimos obtidos a partir de 1.226 pessoas, incluindo 756 indivíduos não-cancerosas e 470 doadores de sangue, como descrito anteriormente [21,22].

Todos os pacientes e controles eram de ascendência europeia Central de origem checa da região de Praga. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Geral Universitário de Praga e todos os participantes deram o seu consentimento informado por escrito com o uso de DNA armazenadas amostras /RNA para fins de pesquisa.

A análise da mutação

Todos os exões codificantes individuais (com limites intrão-exão) separadas por grandes regiões intrónicas

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genes foram amplificados por PCR (os iniciadores listados na Tabela S1) e analisados ​​por uma análise de alta resolução fusão (GRH) sobre Luz Cycler 480 (Roche), utilizando uma mistura de GRH QUENTE FirePol EvaGreen (Solis Biodyne) de acordo com as instruções do fabricante.

variantes em amostras com um perfil aberrante de fusão foram confirmados através de sequenciação directa a partir de reacções de PCR separadas utilizando o Big Dye v3.1 em ABI3130 (Applied Biosystems).

Todos os exons de codificação (incluindo fronteiras intrão-exão) que formam quatro grupos ex�icas do

gene RAD51D

foram amplificados por PCR e analisados ​​por sequenciação directa (iniciadores de PCR e sequenciação estão listados na S1 Tabela).

Todos os exons com as mutações identificadas foram rastreados 1.226 amostras de controlo por um HRM análise e amostras de variantes foram confirmadas por sequenciação.

Detecção de grandes rearranjos genômicos (LGRs)

o Kit P260-A1 foi utilizado para uma análise multiplex dependente de ligadura de amplificação da sonda (MLPA) em

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de acordo com o protocolo do fabricante. Os produtos amplificados foram separados em ABI3130 e analisadas pelo software MRC Coffalyser (MRC Holanda). O kit MLPA para

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análise não estava disponível a partir de qualquer fornecedor no momento da análise.

cDNA análise

A fim de determinar o efeito da intrônica variante c. 1026 + 5_1026 + 7delGTA de acompanhamento e de intron-exon fronteira em

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foi realizada uma análise à base de cDNA. O ARN total isolado a partir de sangue venoso foi transcrito de forma inversa em ADNc utilizando transcriptase reversa SuperScript III (Life Technologies) seguindo o protocolo do fabricante. fragmento de PCR abrangendo a região envolvida foi amplificado (primers estão em S1 Tabela). produto de PCR contendo de tipo selvagem e fragmentos aberrantes foi sequenciado para caracterizar variante splicing aberrante.

In silico

análise

A patogenicidade de variantes missense foi avaliada usando o SIFT , ferramentas de pontuação PolyPhen, Align GVGD e CADD como descrito anteriormente [21,22]. Frequências de variantes identificadas foram apurado em NHLBI exome projeto de sequenciamento (ESP; https://esp.gs.washington.edu/drupal/). Bases de dados e 1000 Genomas (https://www.1000genomes.org/)

resultados

mutações patogênicas que levam a truncagem de produtos de proteína foram identificados em cinco de 171 (3%) pacientes de OC de alto risco, dois (1,2%) no

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e três ( 1,8%) em

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(Tabela 2). Duas alterações patogênicas foram romance. Sem LGR foi encontrado no

RAD51C

gene, mas não poderia excluir a presença de LGRs no gene

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que não foi analisado porque MLPA kit não estava disponível no momento da análise. Nenhuma das alterações identificadas foi encontrado nos controlos não-cancerosas 1.226. A idade no momento do diagnóstico eo histórico familiar de câncer em portadores das mutações são apresentados na Tabela 2.

A Novel c.379_380insG (p.P127Rfs * 28) variante no

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foi encontrado em um paciente OC jovem que morreu 12 meses após o diagnóstico de adenocarcinoma mucinoso. Outra

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truncando variante foi uma alteração emenda local, c.1026 + 5_1026 + 7delGTA, identificada em um paciente que desenvolveu carcinoma endometrial sete anos após o diagnóstico de adenocarcinoma seroso do ovário. O potencial patogênico desta alteração foi demonstrado pela análise de cDNA que revelou aberrante exão 8 de pular, que resultou na frame-shift e rescisão prematura de produto de tradução (p.R322Sfs * 22; Fig 1). Esta variante foi anteriormente relatada uma vez de um controlo e um paciente, respectivamente, por Loveday

et ai. e em um estudo realizado por Golmard

et al

. [10,11].

A electroforese (esquerda) de produtos de PCR amplificados com os iniciadores localizados no exão 5 e sequência 3 ‘UTR (S1 Tabela) mostra dois produtos em um No.1273 paciente em comparação com uma wild- digite o controle de amostra (C). Sequenciamento cromatograma do produto de PCR do paciente mostra a presença de mRNA aberrante emendados com exon 8 skipping

A mutação única truncando descrito recorrentemente em nosso estudo foi c.694C . T (p.R232 *) in

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, encontrada em dois pacientes OC jovens não relacionados com adenocarcinoma seroso e sem história familiar de câncer. O paciente diagnosticado mais cedo morreu de divulgação OC 10 anos após o diagnóstico. Esta variante foi anteriormente descrita em pacientes de HBOC espanholas e americanas [18,16]. Um romance

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mutação, c.879delG (p.C294Vfs * 16), foi encontrado em um paciente OC com uma filha que sofre de BC e duplicidade OC.

Além das variantes truncar, nós encontradas três variantes missense raras (Tabela 2). O c.641G A (p.R214H) mutação no

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foi recentemente identificado em uma fêmea BC de origem Africano [12] e descrito como uma variante de baixo risco com base em sua história familiar que está de acordo com previsões de software. A segunda variante missense rara c.947A G (p.H316R) era novidade; no entanto, estas duas alterações no

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foram previstos como não-patogênico. A única c.629C rara variant- T (p.A210V) -in

RAD51D

foi descrito anteriormente [18] e foi previsto como patogênico (Tabela 2)

Outra sequência detectada variantes. apresentado em um banco de dados dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) ou HGMD (https://portal.biobase-international.com/hgmd/pro/start.php) como polimorfismos estão listados na Tabela S3.

Discussão

Foram identificados germinal truncando mutações no

RAD51C

e

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genes em 1,2% e 1,8% dos analisados ​​alta indivíduos de risco, respectivamente, o que é consistente com estudos anteriores [23,24]. Nosso estudo fornece mais evidências de que ambos os genes conferem uma proporção limitada, mas clinicamente notável de susceptibilidade OC.

Primeiros estudos relataram mutações truncar deletérias no

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e

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genes predominantemente em famílias HBOC com dois ou mais casos de criminalidade organizada [8,14]. No entanto, encontramos a maioria (quatro de cinco mutações claramente deletérias; Tabela 2) em um subgrupo de 109

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e

BRCA2

pacientes OC negativos sem BC ou OC história familiar. Isto está de acordo com estudos posteriores que identificou

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e

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mutações em uma população não selecionada de pacientes OC [25,16]. Estes resultados sugerem que os testes genéticos abrangente do

RAD51C

e

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genes em pacientes OC não deve ser limitada apenas aos pacientes de OC de alto risco com uma história familiar aparente, e uma análise de todos pacientes OC deve ser considerada independentemente da história familiar de câncer e idade de início [26].

a idade média de início OC para mulheres com

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mutações publicado em estudos anteriores tinham 60 anos para

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(revisto em [23]) e 56,6 anos para

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(S4 Tabela). Sopik

et al

. propôs a cirurgia preventiva deve ser adiada até depois da menopausa natural. No entanto, em nosso estudo a idade média do início dos OC em portadores de variantes truncar foram 26,0 anos para

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(25 e 27 anos, respectivamente) e 48,7 anos para

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(37, 43 e 66 anos, respectivamente). Enquanto um pequeno número de portadores da mutação pode influenciar esta observação, supomos que o fato de que quatro de cinco portadores de mutações patogênicas no

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e

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genes eram mulheres na pré-menopausa mais jovens do que 45 anos pode ser de importância clínica. Assim, estudos posteriores dos transportadores em ambos os genes são necessários para calcular as recomendações clínicos para salpingo-ooforectomia bilateral (RR-BSO) e, em seguida, até que, o mais precoce de OC na família devem ser tidas em conta de redução de risco. Recentemente, Baker et ai. relatado RR-BSO em um paciente do sexo feminino BC 39 anos transportando

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mutação de família com múltiplos BC (mas sem OC) casos [24].

Em nosso estudo, apenas um proband, levando o patogênico

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mutação, exibido história familiar de câncer, que incluiu casos de criminalidade organizada e BC. Uma vez que estudos anteriores não relataram aumento do risco de BC para os portadores, estudos posteriores descrito alguns

RAD51C Comprar e

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truncar mutações no BC apenas as famílias [13,27,28,18,24]. Embora estas mutações parecem ser muito raro em pacientes BC, provavelmente, são responsáveis ​​por certa predisposição BC. Os pedigrees de portadores da mutação incluir outros casos de câncer endometrial (, leucemia, da tiróide), cuja associação com as mutações devem ser analisados ​​em detalhe.

Nós também identificou três alterações missense raros em ambos os genes (Tabela 2, S2 Mesa). Apenas o c.629C T, p.A210V rara variante missense no gene

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foi previsto para ser deletéria de forma consistente em todas as ferramentas de previsão de software utilizados. No entanto, a sua patogenicidade não pode ser confirmada sem mais segregação e /ou análises funcionais. Infelizmente, não fomos capazes de realizar uma análise de co-segregação em outros parentes da família.

A penetrância de mutações em genes penetrância moderados não é fácil estimar [29]. Inicialmente, Meindl et al. relatou uma segregação completa de

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mutações em famílias HBOC [8]. Mais estudos estimado o risco relativo (RR) de OC para portadores da mutação no

RAD51C

(RR = 5,9) e

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(RR = 6,3) [10,14]. Pelttari

et al

. descobriu uma razão de chances (OR) para mutações fundador finlandeses em cada gene em uma população não selecionada para ser 6,3 e 7,1, respectivamente [30,15]. Estes dados sugerem que o risco OC exceder o limite para genes penetrância moderadas em

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e

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portadores mutações e ambos os genes têm significado clínico para testes de diagnóstico e medidas preventivas para as operadoras que envolvem tanto OC e gestão BC. Mais estudos e meta-análises de dados publicados em várias populações de todo o mundo são necessários para estimar a penetrância em

RAD51C

e

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portadores da mutação convincente.

A utilidade clínica do identificação de

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e

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portadores da mutação não se limita à previsão de apenas suscetibilidade ao câncer. Ambas as proteínas estão envolvidas na sinalização de danos no ADN e reparação DDSB funcionalmente cooperar com BRCA1 e BRCA2, em processos de recombinação homóloga (RH). Uma falha desta via de reparação que poderia ser esperado em pacientes com câncer levando germinativas mutações patogênicas no

RAD51C

e

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sensibiliza células cancerosas para inibidores de PARP; portanto, pacientes portadores da linha germinativa

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e

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mutações podem beneficiar desta terapia [14].

Em conclusão, descrevemos novas variantes patogênicas em

RAD51C

e

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e mostrou que mutações truncada em ambos os genes podem ser encontrados em 3% dos pacientes OC Checa de alto risco. Os nossos resultados indicam que o início da OC em portadores de mutações poderia ser mais nova do que o esperado. Propomos que a análise de mutações de

RAD51C

e

RAD51D

deve ser transposto para o teste abrangente painel multi-gene em pacientes de OC de alto risco. No entanto, mais estudos em diferentes populações podem ajudar a melhorar as estimativas do impacto clínico de portadores da mutação da linha germinativa e permitir a determinação de um exame adequado, follow-up, ou prevenção estratégias.

Informações de Suporte

S1 Tabela . . PCR sequências iniciadoras

Resumo dos iniciadores de PCR utilizados para a sequenciação, cDNA e HRM analisa

doi:. 10.1371 /journal.pone.0127711.s001

(DOCX)

S2 Table.

In silico

previsão para variantes missense. Análise de previsão

de variantes missense raras identificadas no

RAD51C

e

RAD51D

genes e a frequência destas variantes na sequenciação exome . e 1000 projetos genomas

doi: 10.1371 /journal.pone.0127711.s002

(DOCX)

S3 Tabela.

RAD51C

e

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sequência de variantes

Anteriormente descrita alterações (polimorfismos, variantes intrônicas) encontrados em nosso estudo

doi:.. 10.1371 /journal.pone.0127711.s003

(DOCX)

S4 Table. Características dos pacientes portadores

RAD51D

patogênico mutação

idades de início de 21 pacientes de OC e 15 pacientes portadores BC

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mutações em estudos publicados até agora

doi:.. 10.1371 /journal.pone.0127711.s004

(DOCX)

Reconhecimentos

Dedicado à memória do nosso colega e amigo, Petr Pohlreich, que faleceu quando o manuscrito estava sendo escrito.

Queremos agradecer Marie Epsteinova e Marketa Dostalova pelo seu excelente apoio e pacientes técnica e suas famílias para a participação neste estudo.