Abstract

acumulação aberrante de intracelular β-catenina é um bem reconhecido de vários tipos de câncer: PLOS ONE , incluindo próstata, cólon, e cancros do fígado, e é um alvo potencial para o desenvolvimento de terapias anti-cancro. Aqui, utilizou-se baseado em células de molécula pequena de rastreio para identificar CGK062 como um inibidor da sinalização de Wnt /β-catenina. CGK062 promovido proteína quinase C a (PKCα) mediada por fosforilação de β-catenina em Ser33 /Ser37, marcando-o para a degradação proteossoma. Esta redução dos níveis de β-catenina intracelulares e, consequentemente, antagonizou β-catenina transcrição de resposta (CRT). A inibição farmacológica ou depleção de PKCα revogada fosforilação e degradação de β-catenina CGK062-mediada. Além disso, CGK062 reprimiu a expressão dos genes que codificam para ciclina D1, c-myc, e axina-2, genes alvo β-catenina, e, assim, inibiu o crescimento de células cancerosas CRT-positiva. Além disso, o tratamento de ratinhos nus portadores de tumores de xenoenxertos PC3 com CGK062 em doses de 50 mg /kg e 100 mg /kg (i.p.) reduziu significativamente o crescimento do tumor. Nossos resultados sugerem que CGK062 exerce a sua actividade anti-cancerígena, promovendo PKCα mediada por β-catenina fosforilação /degradação. Portanto, CGK062 tem um potencial terapêutico para o tratamento de cancros CRT-positivos

Citation:. Gwak J, Lee JH, Chung YH, Song GY, Oh S (2012) pequeno promoção baseada-Molecule of PKCα-Mediated β-catenina Degradação Suprime a proliferação de células CRT-positivo câncer. PLoS ONE 7 (10): e46697. doi: 10.1371 /journal.pone.0046697

editor: Manfred Jung, Albert-Ludwigs-Universidade, Alemanha |

Recebido: 30 Janeiro, 2012; Aceito: 07 de setembro de 2012; Publicação: 05 de outubro de 2012

Direitos de autor: © Gwak et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa em Ciência básica através da Fundação Nacional Reserch da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2012R1A2A2A01002941). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a via /β-catenina Wnt, que é activado pela interacção de Wnt1, Wnt3a, e Wnt8 com receptores Frizzled (Fz) e a lipoproteína de baixa densidade de receptor relacionados-protein5 /6 cO (Lrp5 /6) receptores, desempenha um papel importante na proliferação celular, diferenciação, e oncogénese [1]. No centro desta via é o nível citosólico de β-catenina, que regula os seus genes-alvo. Na ausência de um sinal de Wnt, β-catenina é fosforilada por caseína-quinase 1 (CK1) e glicogénio sintase quinase-3β (GSK-3β), que formam um complexo com polipose adenomatosa coli (APC) /Axin (complexo de destruição) . Este é, em seguida, reconhecido por F-box β-transducina contendo repetição de proteína (β-TRCP), um componente do complexo de ubiquitina-ligase, o que resulta na degradação da β-catenina [2] – [4]. A activação do receptor pelo seus ligandos Wnt regula negativamente o complexo de destruição e leva a estabilização β-catenina citoplasmática [5].

activação anormal da /β via de Wnt-catenina e a subsequente sobre-regulação de β-catenina transcrição de resposta (CRT) pensa-se que contribuem para o desenvolvimento e progressão de certos tipos de cancro [6]. mutação oncogénica em β-catenina ou outros componentes do complexo de destruição (APC ou Axin) são observados no cancro do cólon, o carcinoma hepatocelular, o cancro da próstata e [6] – [8]. Estas mutações levam à acumulação excessiva de β-catenina em citoplasma e, em seguida, β-catenina é translocado para o núcleo, onde se complexa com factores factor de células /factor de intensificador de linfócitos (TCF /LEF) de transcrição da família T para activar a expressão de Wnt /β-catenina genes sensíveis, tais como

c-myc

,

ciclina D1 Comprar e metaloproteinase-7 (

MMP-7

), que desempenham um papel importante na tumorigênese e metástase [9] – [11]. A acumulação de β-catenina também é observada em outros tipos de cancro, como o cancro do ovário, melanoma, cancro do endométrio, meduloblastoma, e pilomatricoma [6] – [8]. Assim, a activação aberrante da via Wnt /β-catenina é um alvo terapêutico potencial para quimioprevenção e tratamento de vários cancros.

No presente estudo, nós identificada CGK062, que inibe acentuadamente a via /β-catenina Wnt e a proliferação celular de células cancerosas CRT-positiva. CGK062 promovida a degradação intracelular de β-catenina através da fosforilação β-catenina PKCα-mediada.

Resultados

Identificação de CGK062 como um inibidor da via /β-catenina Wnt

para identificar antagonistas de moléculas pequenas da via /β-catenina Wnt, utilizou-se células HEK293 repórter, que abrigava estavelmente repórter TOPFlash e Frizzled-1 (HFZ-1) plasmídeos humanos. Após a incubação destas células repórter Wnt3a-CM e cada composto, foi medida a actividade da luciferase do pirilampo usando um leitor de microplaca e, em seguida, identificados que CGK062 (3- (3,4-di-hidroxi-fenil) -acrílico 2,2-dimetil- 8-oxo-3,4-di-hidro-2H, 8H-pirano [3,2-g] cromen-éster 3-il) como um inibidor da via Wnt /β-catenina (Figura 1A, B e S1). Como mostrado na Figura 1C, o tratamento de células repórter HEK293 com diferentes concentrações de CGK062 resultou num decréscimo dependente da dose na transcrição resposta β-catenina (CRT), que foi induzida por Wnt3a-CM (IC

50 = 12,3 uM) . CGK062 não afectou a actividade nas células de controlo FOPFlash HEK293 e a viabilidade das células em células repórter HEK293 (Figura 1C e S2a). atividades repórter p53 NF-kB e não foram afetados pela CGK062 (Figura S2B e S2C). Estes resultados sugerem que CGK062 potentemente e especificamente inibe a via Wnt /β-catenina.

(A) Rastreio de compostos que inibem a via /β-catenina Wnt. Os compostos que modulam a actividade repórter TOPFlash foram pesquisadas utilizando as células HEK293 repórter. Os controlos foram ensaiados na presença ou ausência de Wnt3a-CM. (B) Estrutura química da CGK062. (C) dependente da dose de inibição de β-catenina transcrição resposta. células HEK293 repórter foram incubadas com concentrações indicadas de CGK062 na presença de Wnt3a-CM. Após 15 h, as actividades de luciferase foram determinadas e classificado como unidade de luz relativa (RLU) normalizada para a titulação de células. Os resultados são a média de três experiências e as barras indicam o desvio padrão. *,

P Art 0,05, e **,

P Art 0,01, em comparação com o grupo de controlo tratado com Wnt3a-CM. (D) proteínas citosólicas foram preparados a partir de células HEK293 repórter tratados com veículo (DMSO) ou concentrações indicadas de CGK062 na presença de Wnt3a-CM durante 15 h e, em seguida, submetida a Western Blotting com anticorpo β-catenina. (E) semi-quantitativo de RT-PCR para β-catenina, e de GAPDH foi realizada com ARN total preparado a partir de células HEK293 repórter quer veículo (DMSO) ou concentrações indicadas de CGK062 na presença de Wnt3a-CM durante 15 h. (F) proteínas citosólicas preparado a partir de células repórter HEK293, que foram incubadas com veículo (DMSO) ou CGK062 (25 uM) na presença ou ausência de Wnt3a-CM, expostos a MG-132 (10 uM) durante 8 h, foram submetidos a transferência de Western com anticorpo anti-β-catenina. Em (D) AMD (F), para confirmar o carregamento igual, o blot foi sondado com anticorpo anti-actina.

Na via /β-catenina Wnt, CRT é largamente dependente do nível de intracelular β-catenina, que é controlada pela proteólise dependente de ubiquitina [12]. Para investigar o efeito de CGK062 no nível intracelular de β-catenina, analisou-se a quantidade de citoplasmática β-catenina por transferência de Western com anticorpo anti-β-catenina em células repórter HEK293-tratados CGK062. O nível de citoplasmática β-catenina, que tinha sido acumulada por Wnt3a-CM, foi drasticamente diminuída por tratamento de CGK062 (Figura 1D), o que é consistente com o resultado do CRT. Para examinar se a redução de proteína β-catenina citoplasmática por este composto era devido à diminuição do nível de ARNm β-catenina em células HEK293 repórter, foi realizada semi-quantitativo de RT-PCR para determinar a quantidade de ARNm β-catenina. Como mostrado na Figura 1E, o nível de ARNm β-catenina não se alterou em resposta a diferentes concentrações de CGK062 em células HEK293 repórter.

Em seguida, para se explorar a infra-regulação da β-catenina por CGK062 é mediada pela do proteassoma, utilizou-se MG-132 para inibir a degradação de proteínas mediado-proteassoma nas células HEK293 repórter. Como mostrado na Figura 1F, CGK062 consistentemente levou a uma diminuição do nível de proteína β-catenina; No entanto, a adição de MG-132 anulou o efeito de CGK062 na redução β-catenina. de cloreto de amónio, um inibidor de lisossoma, não afectou CGK062 mediada por degradação β-catenina (Figura S3). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que CGK062 suprime a via /β-catenina Wnt através de um mecanismo que envolve a degradação intracelular dos β-catenina.

CGK062 mediada por degradação β-catenina requer β-TRCP mas não a GSK-3βactivity

Dado que a fosforilação de β-catenina por GSK-3β e sua subsequente associação com β-TRCP conduz a p-catenina degradação [13], nós examinamos se a actividade de GSK-3β é necessário para a degradação de β -catenina induzida por CGK062. Quando as células repórter HEK293 foram incubadas com LiCl ou 6-bromoindirubin-3′-oxima (BIO), inibidores de GSK-3β, CRT foi estimulada (Figura 2A e 2B), consistente com relatos anteriores [14], [15]. Como mostrado na Figura 2A e 2B, o tratamento com CGK062 resultou na supressão de CRT de uma forma dependente da dose. Além disso, a análise Western blot utilizando anticorpo anti-β-catenina consistentemente mostraram que CGK062 levou a uma diminuição da regulação dos níveis de β-catenina intracelulares, que acumulou com LiCl (Figura 2C), o que sugere que CGK062 mediada por degradação β-catenina é independente de GSK-3β.

repórter células HEK293 (a) foram incubadas com CGK062 na presença de LiCl 20 mM. (B) As células repórter HEK293 foram incubadas com CGK062 na presença de 0,75 uM BIO. Em (A) e (B), após 15 h, as actividades de luciferase foram determinadas e classificado como unidade de luz relativa (RLU) normalizada para a titulação de células. Os resultados são a média de três experiências e as barras indicam o desvio padrão. *,

P Art 0,05, em comparação com o LiCl- ou grupo de controlo tratado com BIO. (C) proteínas citosólicas foram preparados a partir de células HEK293 repórter tratados com veículo (DMSO) ou quantidades crescentes de CGK062 na presença de LiCl 20 mM durante 15 h e, em seguida, submetida a Western Blotting com anticorpo β-catenina. (D) As células HEK293 foram transfectadas com o plasmídeo de expressão Δβ-TRCP e, em seguida, incubadas ou com veículo (DMSO) ou CGK062 (25 uM) na presença de Wnt3a CM durante 15 h. proteínas citosólicas foram sujeitos a Western blotting com β-catenina e anticorpos p-TRCP. Em (C) e (D), as manchas foram sondado com anticorpo anti-actina como um controlo de carga.

, em seguida, determinar se β-TRCP é necessário para a degradação induzida por CGK062 ofβ-catenina. Como se mostra na Figura 2D, a expressão ectópica de uma forma dominante negativa de β-TRCP (Δβ-TRCP), que interage com fosforilada β-catenina, mas é incapaz de formar um FSC

β-TRCP ubiquitina ligase complexo [16] , revogada a degradação induzida por CGK062 de β-catenina. Além disso, não afectou CGK062 CRT que tinha sido activado por sobre-expressão de mutantes β-catenina, S45A e S37A (Figura S4). Estes resultados indicam que β-TRCP e resíduos N-terminais de β-catenina são necessários para a degradação β-catenina CGK062-mediada.

CGK062 induz fosforilação mediada PKCα-β-catenina /degradação

relatórios anteriores demonstraram que a activada PKCα catalisa a fosforilação de β-catenina em Ser33 /37 e a sua subsequente associação com β-TRCP conduz a p-catenina degradação [17], [18]. Para obter mais conhecimentos sobre o mecanismo, primeiro analisou se PKCα é activado por tratamento com CGK062. Desde PKCα activado se move a partir do citoplasma para a membrana do plasma [19], foram isoladas fracções de membrana a partir de células tratadas e CGK062–untreated, e medida a quantidade de PKCα por análise de Western blot. CGK062 tratamento conduziu à acumulação de PKCα na membrana plasmática em células HEK293 (Figura 3A). Observamos também a translocação de membrana induzida CGK062 de PKCα em HEK293 células por análise de imunofluorescência (Figura S5). Consistentemente, CGK062 aumentou a actividade de cinase de PKCα

In vitro

, quando usado péptido sintético que contém sítio de fosforilação PKCα como substrato (Figura 3B). Além disso, o BIM I, um inibidor específico da PKC aboliu o efeito de CGK062 (Figura 3B), o que sugere que é CGK062

bona fide

activador de PKCα.

fracções (A) e de membrana citossólicos foram preparados a partir de células HEK293 tratadas com veículo (DMSO) ou CGK062 (25 e 50 uM) na presença ou ausência de Wnt3a-MC para transferência de Western com anticorpo anti-PKCα. As manchas foram sondado com anti-tubulina ou anticorpos anti-MDR como controlos fracção. (B) péptido indicado foi incubada com PKCα purificada e CGK062 (12,5 e 25? M) ou BIM (0,5 uM). As quantidades de ATP na reacção foram detectados por kit de Cinase-Glo Luminescent ™ Assay (Promega). Os resultados são a média de três experiências e as barras indicam o desvio padrão. *,

P Art 0,05, em comparação com o grupo de controlo do veículo. (C) proteínas citosólicas foram preparados a partir de células HEK293 repórter tratados com CGK062 (25 uM) ou BIM (10 uM) na ausência ou na presença de Wnt3a-MC para transferência de Western com anticorpo anti-β-catenina. (D) As células repórter HEK293 foram transfectadas com o controlo negativo (CN) siRNA (40 nM) ou PKCα siRNA (40 nM), e depois incubadas com CGK062 (25 uM) durante 15 h na ausência ou na presença de Wnt3a-CM. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de Western blot com anticorpos anti-β-catenina e anti-PKCα. Em (C) e (D), as manchas foram sondado com anticorpo anti-actina para confirmar o carregamento igual. (E) de GST-β-catenina (100 ng) foi incubada com PKCα purificada e CGK062 (12,5 e 25? M) ou BIM (0,5 uM). As amostras foram analisadas por transferência de Western com anticorpo anti-fosfo-p33 /37-β-catenina. células repórter (F) HEK293 foram incubadas com CGK062 (25 uM) e BIM (10 uM) durante 15 h na ausência ou na presença de Wnt3a-CM. fracções citosólicas foram preparadas e sujeitas a análise de transferência de Western com anticorpo anti-fosfo-p33 /37-β-catenina ou anticorpos anti-β-catenina. células repórter (L) HEK293 foram transfectadas com o controlo negativo (CN) siRNA (40 nM) ou PKCα siRNA (40 nM), e depois incubadas com CGK062 (25 uM) durante 15 h na ausência ou na presença de Wnt3a-CM. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de Western blot com anticorpos anti-p-catenina e anti-p33 /37-p-catenina. Em (F) e (G), a mesma quantidade de β-catenina foi carregado em cada pista.

Em seguida, examinou se a atividade PKCα é essencial para a degradação β-catenina CGK062 mediada. A inibição da actividade PKCα usando BIM I aboliu a sub-regulação de β-catenina por CGK062 (Figura 3C). Notavelmente, a depleção selectiva de PKCα endógenas utilizando pequenos ARN interferente (siRNA) também anulou a degradação induzida por CGK062 ofβ-catenina (Figura 3D), o que indica que PKCα é responsável pela degradação de β-catenina por CGK062.

em seguida, para testar se CGK062 promove diretamente PKCα mediada por fosforilação β-catenina em Ser33 /37, foi realizada uma em> in vitro ensaio da quinase

usando expressa em bactérias β-catenina e PKCα purificada. PKCα prontamente fosforilada β-catenina na presença de CGK062 e BIM I inibiu esta fosforilação (Figura 3E). Nós também examinou se CGK062 promove PKCα mediada por fosforilação β-catenina em Ser33 /37 e Ser45 em células repórter HEK293. A análise Western blot mostrou que Wnt3a-CM inibiu a fosforilação de β-catenina em Ser33 /37 e Ser45 (Figura 3F, S6 e S7). Além disso, a fosforilação induzida CGK062 de β-catenina em Ser33 /37 e Ser45 (Figura 3F, S6 e S7), e Ser33 /37 fosforilação foi anulada através da adição de BIM I (Figura 3F). Consistentemente, salvado tratamento CGK062 a fosforilação de β-catenina em Ser33 /37, que foi inibida por Wnt3a-CM, e o knockdown de PKCα marcadamente suprimida induzida CGK062 Ser33 /37 fosforilação em células HEK293 (Figura repórter 3G).

CGK062 também promove a degradação β-catenina em células cancerosas CRT-positivos

Estamos próximos testaram se CGK062 ativa PKCα em células cancerosas CRT-positivas, tais como PC3 (cancro da próstata), SNU475 (hepatoma) e SW480 (cancro do cólon). Consistente com os resultados de células HEK293, CGK062 promoveu a translocação de PKCα para a membrana plasmática nestas células de cancro (Figura 4A). Para determinar se CGK062 também inibe a função β-catenina em células de cancro CRT-positivos, o plasmídeo foi transfectado em TOPFlash células cancerosas CRT-positivo, seguido de tratamento com concentrações crescentes de CGK062. Como mostrado na Figura 4B, CGK062 consistentemente reprimido CRT em PC3, SNU475, e células SW480. Em paralelo com esta experiência, foi determinado o efeito de CGK062 sobre o nível citosólico de β-catenina nestas células cancerosas CRT-positivo por análise de Western blot. Consistentemente, tratamento de CGK062 resultou na sub-regulação de nível β-catenina intracelular de uma forma dependente da concentração em PC3, SNU475, e células SW480 (Figura 4C). Nós também descobrimos que CGK062 promoveu a fosforilação de β-catenina em Ser33 /37, e esta fosforilação foi abolido pelo BIM I em células SW480 (Figura S8). Estes resultados indicam que também induz a degradação CGK062 β-catenina em células de cancro CRT-positiva.

fracções (A) e citossólicos foram preparados a partir de membranas PC3, SNU475, e células SW480 tratados com veículo (DMSO) ou para CGK062 western blotting com anticorpo anti-PKCα. As manchas foram sondado com anti-tubulina ou anticorpos anti-MDR como controlos fracção. (B) PC3, SNU475, e células SW480 foram co-transf ectadas com pCMV-TOPFlash e RL plasmídeos e incubadas com CGK062 durante 15 h. actividades de luciferase foram medidas 39 horas após a transfecção e relatados como unidade de luz relativa (RLU) normalizada para

Renilla

actividades da luciferase. Os resultados são a média de três experiências e as barras indicam o desvio padrão. *,

P Art 0,05, e **,

P Art 0,01, em comparação com o grupo de controlo do veículo. (C) proteínas citosólicas foram preparados a partir de PC3, SNU475, e células SW480 tratados com o veículo (DMSO) ou CGK062 durante 15 h e, em seguida, submetidas a transferência de Western com anticorpo β-catenina. As manchas foram sondado com anticorpo anti-actina para confirmar o carregamento igual.

CGK062 reprime a expressão de genes dependente de β-catenina

Para determinar se CGK062 afecta a expressão de β- genes catenina-dependente, a actividade do promotor de

ciclina D1

, que é um gene β-dependente-catenina conhecido, foi avaliada. A construção repórter contendo o

ciclina D1

promotor, que contém uma região sensível β-catenina /TCF-4, foi transfectado em PC3, SNU475, e células SW480 seguido por tratamento com diferentes concentrações de CGK062. Como mostrado na Figura 5A,

ciclina D1

actividade do promotor foi reprimido por CGK062 nestas células cancerosas CRT-positiva. Também avaliamos o nível de proteína de ciclina D1 em células cancerosas CRT-positivos tratados com CGK062. Consistente com nossa resultado para o

ciclina D1

promotor, uma diminuição dependente da dose da ciclina D1 expressão da proteína foi observada em resposta a CGK062 (Figura 5B) em PC3, SNU475, e células SW480. Além disso, a expressão de

c-myc

e

axina-2

, alvos a jusante estabelecidos de β-catenina [9], foram também reduziu significativamente nestas células cancerosas CRT-positivo após incubação com CGK062 (Figura 5B). Sob estas condições, o nível PKCα não se alterou em resposta a diferentes concentrações de CGK062 (Figura S9).

PC3, SNU475, e células SW480 (A) foram co-transfectadas com ciclina D1-RL e pSV40- FL, e, em seguida, incubadas com quantidades indicadas de CGK062 durante 15 h. actividades de luciferase foram medidas 39 horas após a transfecção. a actividade do promotor de ciclina D1 é relatado como unidade de luz relativa (RLU) normalizada para a actividade da luciferase de pirilampo. Os resultados são a média de três experiências e as barras indicam o desvio padrão. *,

P Art 0,05, e **,

P Art 0,01, em comparação com o grupo de controlo do veículo. (B) PC3, SNU475, e células SW480 foram incubadas com o veículo (DMSO) ou CGK062 durante 15 h e, em seguida, os extractos celulares foram preparados por Western blotting com anti-axina, anti-ciclina D1 e anticorpos anti-myc. Para confirmar o carregamento igual, as transferências foram sondado com anticorpo anti-actina.

CGK062 inibe a proliferação de CRT-positivo células cancerosas

in vitro

e

in vivo

estudos recentes têm demonstrado que a destruição da função β-catenina pelo anti-sentido, ARNsi, ou segregadas estratégias antagonistas de Wnt foi mostrado para inibir especificamente o crescimento de células cancerosas CRT-positivos [20] – [22] . Dado que CGK062 promovida a degradação intracelular de β-catenina, a hipótese de que CGK062 também suprime a proliferação de células cancerosas CRT-positiva. Para explorar esta hipótese, foi avaliado o efeito de CGK062 sobre o crescimento de várias células cancerosas CRT-positiva. Como mostrado na Tabela 1 e Figura S10, CGK062 eficientemente inibiu o crescimento de células cancerígenas do cólon CRT-positivo (DLD-1, SW480, HCT15, SNU475, e células PC3) com IC

50 valores de 1,62 uM a 18,60? M. Tomados em conjunto, estes resultados indicaram que CGK062 marcadamente inibe a proliferação celular das células cancerosas CRT-positivo.

Para melhor avaliar a actividade antitumoral do CGK062

in vivo

, ratinhos nus atimicos com estabelecida sc tumores de xenoenxertos PC3 foram tratados diariamente com i.p. administração de CGK062 durante 5 semanas a 50 e 100 mg /kg. Em comparação com o veículo (controlo), o tratamento de murganhos com crescimento de tumores PC3 CGK062 inibiu significativamente (Figura 6A). Uma dose de 100 mg /kg CGK062 induzida perto inibição completa do crescimento do tumor. Mesmo na dose de 50 mg /kg, CGK062 inibiu o crescimento tumoral por ~ 70% relativamente ao grupo de controlo. Todos os ratos toleraram o tratamento sem perda significativa do peso corporal (Figura 6B).

(A e B) CGK062 inibe o crescimento do câncer de próstata de xenotransplante tumoral

in vivo

. xenoenxertos de tumores subcutâneos PC3 foram estabelecidos e os tratamentos foram administrados como descrito em Materiais e Métodos. (A), quer dizer os volumes dos tumores (n = 6) (B), quer dizer variação média do peso do corpo durante o tratamento. *,

P Art 0,05, em comparação com o grupo controle do veículo

Discussão

aberrante-regulação de intracelular β-catenina está envolvido no desenvolvimento. de vários tipos de câncer, incluindo câncer de próstata, o cancro colorectal, e carcinoma hepatocelular [6] – [8]. Neste relatório, foi utilizado um rastreio à base de células para identificar CGK062 como um inibidor potente da via /β-catenina Wnt. CGK062 fornecida vantagem terapêutica considerável no que diz respeito à potência anti-tumoral em vários transcrição resposta β-catenina (CRT) -positivas células cancerosas, tais como células de cancro do cólon (SW480, DLD-1, e HCT15), carcinoma hepatocelular (SNU475), refractário a hormonas células de cancro da próstata PC3 ().

PKCα CGK062-activada a fosforilação catalisada de β-catenina em Ser33 /Ser37, e desse modo reduzido o nível β-catenina intracelular por degradação proteossómica β-TRCP-dependente. Além disso, a inibição farmacológica e PKCα siARN revogada induzida CGK062 β-catenina fosforilação /degradação, indicando que PKCα é responsável pela inibição mediada CGK062 da via /β-catenina Wnt. Os resultados de vários estudos, incluindo algumas previamente realizado em nosso laboratório, sugerem um papel chave para PKCα na regulação da sinalização de Wnt /β-catenina. Wnt5a está envolvida na mobilização de Ca intracelular

2+, a activação subsequente de PKCα, e inibição da via Wnt /β-catenina [23], [24]. Orford

et al.

[25] relatou que os inibidores de PKC causar acúmulo de β-catenina em células de câncer de mama humano. Recentemente, órfãos α receptor nuclear relacionadas com o ácido retinóico (cc ROR) demonstrou atenuar a sinalização de Wnt /β-catenina em cancro do cólon, estimulando a fosforilação PKCα-dependente [26]. Anteriormente, foi demonstrado que PKCα regula negativamente a sinalização de Wnt /β-catenina em células HEK293, que têm a função via Wnt /β-catenina normais [17] e que regula o nível PKCα β-catenina intracelular em células de cancro do cólon [18]. O presente estudo estende essas conclusões anteriores, mostrando que a activação de PKCα por um agonista romance, CGK062, promove a degradação β-catenina em linhas celulares de três cancerosas – PC3 (cancro da próstata), SNU475 (hepatoma) e SW480 (cancro do cólon) – que exibem aberrante a sobre-regulação do nível intracelular β-catenina.

inibidores de molécula pequena que antagonizam CRT foram descobertas por rastreio de alto rendimento. pequenas moléculas que bloqueiam a associação entre TCF4 e atividades β-catenina prejudicar β-catenina-dependentes, tais como a proliferação celular e duplicação do eixo dorsal embrionária em

Xenopus laevis

[27]. Outra molécula pequena, ICG-001, que bloqueia a interacção entre β-catenina e resposta AMP cíclico proteína de ligação ao elemento (CBP), induz apoptose especificamente em células de cancro do cólon [28]. Duas outras pequenas moléculas, IWR-3 e XAV939, são mostrados recentemente para estimular a degradação da β-catenina, estabilizando axina e inibindo assim a proliferação de células cancerosas, DLD-1 do cólon, que transportam uma mutação em APC [29], [30 ]. Em contraste com as moléculas pequenas previamente estudadas, CGK062 reduziu o nível intracelular de β-catenina através PKCα mediada por fosforilação /degradação. Notavelmente, foi capaz de promover a degradação β-catenina em células de hepatoma SNU475, que transportam uma mutação axina, bem como em células de cancro do cólon SW480 com mutação APC, e suprimiu o crescimento de células cancerosas CRT-positiva. CGK062 marcadamente suprimiu o crescimento de tumores PC3 próstata num modelo de xenoenxerto rato, consistente com os resultados do nosso

in vitro

análises.

Em conclusão, nós identificamos CGK062 que promove β- PKCα mediada fosforilação catenina e a sua degradação. CGK062 reprimiu a expressão de seus genes-alvo, incluindo aqueles que codificam ciclina D1, c-myc e axina-2, suprimindo assim o crescimento do tumor

in vitro

e

in vivo

. Tomados em conjunto, CGK062 representa um tratamento promissor candidato de cancros CRT-positivo.

Materiais e Métodos

cultura de células, plasmídeos, transfecção, e luciferase ensaio

HEK293, PC- 3, SNU475, DLD-1, células L HCT15, SW480, e Wnt3a-secretores foram obtidos de American Type Culture Collection (ATCC) e mantida em meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 120 ug /ml de penicilina, e 200 ug /ml de estreptomicina. -Wnt3a meio condicionado (Wnt3a-CM) foi preparado como previamente descrito [31]. O repórter e célula de controlo de linha HEK293 foi estabelecida como previamente descrito [32]. Os pTOPFlash e pFOPFlash plasmídeos repórter foram obtidos a partir de Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, EUA). O negativo β-TRCP (Δβ-TRCP) plasmídeo de expressão dominante foi um presente de M. Davis (Hebrew University-Hadassah Medical School, Israel). plasmídeos pCMV-RL e pSV-fl foram adquiridos a Promega. PKC siARN foi concebido como previamente descrito [17]. A transfecção foi realizada com Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O ensaio de luciferase foi realizada utilizando um kit de ensaio de luciferase duplo (Promega, Madison, WI, EUA).

Rastreio de um inibidor de molécula pequena de Wnt /β-catenina sinalização

O repórter HEK293 As células foram inoculadas em placas de 96 poços a 15.000 células por poço em duplicado e cultivadas durante 24 h. Wnt3a-CM foi adicionada, e, em seguida, os compostos (compostos 800) incluindo cumarinas, flavonóides, naftoquinonas, terpenóides e foram adicionados aos poços a uma concentração final de 30 uM. Após 15 h, as placas foram ensaiadas quanto à actividade de luciferase de pirilampo e a viabilidade celular.

Preparação da fracção de membrana

Células cultivadas em placas de cultura de 100 mm foram lavadas com PBS gelado. As células foram então suspensas em 1 ml de tampão de extracção arrefecido em gelo (Tris 20 mM (pH 7,5), EDTA 0,5 mM, e EGTA 0,5 mM); homogeneizou-se utilizando uma seringa (26 g); e incubou-se em gelo durante 30 min. O homogenato foi centrifugado a 13.400 ×

g

durante 2 min a 4 ° C. O sobrenadante foi centrifugado a 100.000 ×

g

durante 30 min a 4 ° C num rotor 100Ti (Beckman, EUA). O sedimento foi suspenso em tampão de extracção contendo 0,5% (w /v) de Triton X-100.

Western blotting

A fracção citosólica foi preparado como previamente descrito [33]. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE num gel de gradiente 4-12% (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e transferidas para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). As membranas foram bloqueadas com leite magro a 5% e sondado com anti-β-catenina (BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, EUA), anti-fosfo-β-catenina (Ser33 /Ser37 /Thr41) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA), anti-fosfo-β-catenina (Ser45) (Cell Signaling Technology), anti-ciclina D1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), anti-myc (Santa Cruz Biotechnology), anti-PKCα (BD Transduction Laboratories), anti- axina (BD Transduction Laboratories), anti- β-TRCP (Santa Cruz Biotechnology), anti-MDR1 (Santa Cruz Biotechnology) e anticorpos anti-actina (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA) . As membranas foram então incubadas com IgG anti-ratinho-peroxidase de rábano conjugado ou anti-IgG de coelho (Santa Cruz Biotechnology) e visualizadas utilizando o sistema ECL (Santa Cruz Biotechnology).

extracção de ARN e semi-quantitativa de RT -PCR

o ARN total foi isolado com o reagente de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), em conformidade com as instruções do fabricante. a síntese de ADNc, a transcrição reversa e PCR (reacção em cadeia da polimerase) foram realizados como previamente descrito [32]. O ADN amplificado foi separado em géis de agarose a 2% e corado com brometo de etídio.

Imunofluorescência análise

HEK293cells foram cultivadas em lâminas de câmara de vidro e, em seguida, tratada com DMSO ou CGK062 durante 15 h. Após o tratamento, as células foram lavadas com PBS, fixadas com formaldeído a 4%, permeabilizadas em 0,3% de Triton X-100, e bloqueado em 4% de albumina de soro bovino durante 1 h.