Abstract

Fundo

O caminho Kennedy gera phosphocoline e fosfoetanolamina através dos seus dois ramos. Cinase de colina (ChoK) é a primeira enzima da ramificação Kennedy de síntese de fosfocolina, o principal componente da membrana plasmática. ChoK família de proteínas é constituída por ChoKα e ChoKβ isoformas, o primeiro com duas variantes diferentes de eventos de splicing. Recentemente ChoKα tem sido implicado no processo cancerígeno, uma vez que é sobre-expresso numa variedade de cancros humanos. No entanto, foi relatado nenhuma evidência para um papel de ChoKβ na carcinogênese.

Metodologia /Principais Achados

Aqui nós comparar o

in vitro

e

In vivo

propriedades de ChoKα1 e ChoKβ no metabolismo lipídico e seu potencial papel na carcinogênese. Ambos ChoKα1 ChoKβ e apresentaram actividades de colina e etanolamina quinase quando ensaiada em extractos celulares, embora com uma afinidade diferente para os seus substratos. No entanto, comportam-se diferentemente quando sobre-expresso em células inteiras. Considerando ChoKβ exibir um papel etanolamina quinase, ChoKα1 apresentar um papel cinase de colina /etanolamina dupla, sugerindo o envolvimento de cada isoforma ChoK em vias bioquímicas distintas sob

In vivo

condições. Além disso, enquanto a superexpressão de ChoKα1 é oncogênico quando sobre-expressos em células HEK293T ou MDCK, ChoKβ superexpressão não é suficiente para induzir

in vitro de transformação celular

nem

in vivo

crescimento do tumor. Além disso, a regulação positiva significativa dos níveis de mRNA ChoKα1 em um painel de linhas de células da mama e cancro do pulmão foi encontrado, mas não foram observadas alterações nos níveis de mRNA ChoKβ. Finalmente, MN58b, uma previamente descrito potente inibidor da ChoK com

in vivo

atividade antitumoral, mostra mais de 20 vezes maior eficiência em relação ChoKα1 que ChoKβ.

Conclusão /Significado

Este estudo representa a primeira evidência do papel metabólico distinto de ChoKα e ChoKβ isoformas, sugerindo diferentes funções e implicações fisiológicas na carcinogênese humana. Estas conclusões constituem um passo em frente na concepção de uma estratégia antitumoral com base na inibição ChoK

Citation:. Gallego-Ortega D, Ramirez de Molina A, Ramos MA, Valdes-Mora F, Barderas MG, Sarmentero-Estrada J, et ai. (2009) Papel diferencial de α humano de cinase de colina e ß Enzimas na Lipid Metabolism: Implicações na Cancer Onset e Tratamento. PLoS ONE 4 (11): e7819. doi: 10.1371 /journal.pone.0007819

editor: Suzannah Rutherford, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de junho de 2009; Aceito: 07 de outubro de 2009; Publicação: 12 de novembro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Gallego-Ortega et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações para JCL de Comunidad de Madrid (GR-SAL-0821-2004), Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2008-03750, RD06 /0020/0016), Fundación Mutua Madrileña, e por uma concessão para ARM da Fundación Mutua Madrileña. DGO era um companheiro da Comunidad de Madrid. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Humano colina alfa da cinase (ChoKα) e beta (ChoKβ) são membros da família da cinase de colina. Nos mamíferos esta família é codificada por dois genes separados,

CHKA

e

CHKB

, resultando em três diferentes proteínas com uma cinase de colina /etanolamina (Chok /EtnK) de domínio: ChoKα1 (NP_001268), ChoKα2 (NP_997634) e ChoKβ1 (NP_005189) [1]. ChoKα1 ChoKα2 difere em apenas um alongamento adicional de 18 aminoácidos, enquanto difere de ChoKβ ChoKα1 ChoKα2 e em aproximadamente 40%. A presença do domínio de ChoK /EtnK confere a capacidade de catalisar a fosforilação de colina (Cho) a fosfocolina (PCHO) [1]. Este constitui o primeiro passo na via de biossíntese de fosfatidilcolina (PC) [2]. PC é o principal fosfolípido em membranas eucarióticas e desempenha um papel crítico na estrutura da membrana e também na sinalização celular [2]. enzimas ChoK poderia estar implicada também na síntese de fosfatidiletanolamina (PE), utilizando-se como substrato para processar etanolamina fosfoetanolamina (PETN) [1], [3] – [5]

Estudos anteriores sugerem que actua como ChoK. uma proteína dimérica [6], [7] e foi proposta a proporção da população diferente dímero de homo- ou hetero ser específico de tecido [8]. Além disso, a combinação entre as isoformas de cinase de colina resulta em um nível diferente de atividade ChoK

in vitro

em condições de sistemas livres de células. Assim, a α /α homodímero é a forma de cinase de colina mais ativo, o β /β homodímero os menos ativos, ea α /β heterodímero tem um fenótipo intermediário [8].

A fosfolipase específico D-driven hidrólise do PC gera metabolitos de colina e de transdução de sinal, tais como PA (ácido fosfatídico), e seus derivados LPA (ácido lisofosfatídico) e do DAG (diacilglicerol), que são importantes na mitogénese e a transformação celular [9] – [11]. A colina fica ainda convertido por ChoK em PCHO, um metabolito estável capaz de induzir a mitogénese em fibroblastos de murino [12]. Além disso, vários oncogenes, tais como

RAS

ou

RHOA

atividade ChoKα aumento resultante nos níveis intracelulares mais elevados de PCHO [13] – [16]. espectroscopia de ressonância magnética (MRS) estudos têm revelado metabolismo fosfolipídio anormal em células cancerosas [17], [18]. Além disso, níveis elevados de PCHO foram encontrados em células tumorais, bem como em amostras de tumor de pacientes com cancro, em comparação com as contrapartes normais da mama, próstata, cérebro e cancro do ovário [19] – [25]. O aumento da fosfoetanolamina foi também relatada em células transformadas ou amostras de tumores utilizando MRS, embora ela contribui para um grau muito menor, em comparação com o aumento de PCHO, ao pico do fosfomonoéster [26]

.

A implicação ChoKα no crescimento celular, a proliferação, a iniciação e progressão do cancro é bem documentada. ChoKα é sobre-expresso em alguns dos cancros mais comuns, tais como cancro da mama, do pulmão, colo-rectal, da próstata [27] – [30] e da bexiga (observações não publicadas). Além disso, ele tem actividade oncogénica, quando sobre-expresso em células de origem humana [15]. Aumento dos níveis de mRNA ChoKα foram recentemente descrito como um marcador de prognóstico independente em pacientes com câncer de pulmão de não pequenas células [30]. Além disso, linhas celulares de cancro da mama humano mostram a regulação positiva de ChoKα mas não ChoKβ, quando comparado com células epiteliais mamarias normais [21]. Nesse sentido, tem sido relatado recentemente que, no modelo do rato tumor da próstata (TRAMP), utilizando IHQ imunodetecção de ChoKβ, uma expressão de baixo nível de ChoKβ foi encontrado em amostras tumorais em comparação com os tecidos de tipo selvagem [31].

a implicação de membros da família Rho GTPase no início e progressão do cancro tem sido extensivamente descritos [32] – [35]. A prova de que ChoK está envolvido na transformação maligna juntamente com Ras e RhoA foi fornecida [14], [15], [36]. Além disso, a actividade de ChoKα é modulada por efectores conhecidos de Ras tanto RhoA e [15], [29].

A inibição farmacológica da ChoKα tem sido proposto como uma nova estratégia anti-tumoral [2]. Um forte suporte para esta estratégia é baseada na utilização de MN58b, um inibidor ChoKα bem caracterizado, que exibe um efeito antiproliferativo potente em várias linhas de células tumorais in vitro, e uma forte redução do crescimento de tumores em xenoenxertos de ratinhos nus [14], [37] – [40]

Nós comparamos as propriedades bioquímicas e biológicas de ChoKα e ChoKβ, e demonstram que para além da sua homologia, este último não é capaz de induzir a transformação celular em células HEK293T ou MDCK.. Além disso, sugerimos comportamento diferencial entre aep isoformas no metabolismo fosfolipídios. Finalmente, as propriedades antitumorais de MN58b pode ser atribuída à sua inibição específica da ChoKα. As implicações destes resultados são discutidas.

Resultados

Caracterização das propriedades enzimáticas de ChoKα1 e ChoKβ isoformas

A atividade de ambas as isoformas de cinase de colina, ChoKα1 e ChoKβ, tem sido descritos anteriormente em diversos tecidos de mamíferos, embora a sua cinase de colina e /ou etanolamina quinase actividades não são totalmente caracterizados [1], [4], [41] – [43]. Assim, primeiro realizou uma análise comparativa do

in vitro

atividade quinase das duas isoformas ChoKα1 e ChoKβ humanos, quanto à sua capacidade para fosforilar colina e etanolamina. células HEK293T foram transfectadas com vectores de expressão apropriados que transportam os genes CHKA ou CHKB humanos ou um vector vazio, e testados para a actividade de ChoK e EtnK. Os níveis de expressão obtidos foram verificados por Western Blot (Figura 1a), e a actividade enzimática relativa de extractos de células estimados. Ambos ChoKα1 e ChoKβ exibido atividades colina e etanolamina quinase sob estas condições experimentais, mas a taxa de conversão foi aparentemente diferentes (Figura 1b).

células HEK293T foram transfectadas com vectores de expressão eucarióticos de gene ChoKα1 e ChoKβ1 humano. pCDNA3b vector vazio foi utilizado como controlo. A) A sobre-expressão de ChoKα1 e ChoKβ1 em células HEK293T detectadas por Western Blot. detecção de GAPDH foi utilizada como controlo do nível de expressão. B, C) in vitro ChoK (B) e EtnK (C) a actividade de cinase de colina e α1 isoformas b1 em extractos livres de células de células HEK293T transfectadas. Percentagem de conversão de

14C-colina ou

14C-etanolamina ao produto fosforilada é representado. O experimento foi realizado em amostras em duplicado, repetido 4 vezes, e os valores médios ± SEM de todos os experimentos estimados.

Analisamos ainda Chok e EtnK atividades cinéticos para isoformas ChoKα1 e ChoKβ usando as enzimas recombinantes. DH5a

Escherichia coli

foram transformadas com o gene que codifica para ChoKα1 humano ou ChoKβ e

em

ensaio de uma enzimática in vitro tanto para atividades EtnK ChoK ou executados. As constantes de Michaelis (KM) para cada isoforma para os diferentes substratos foram obtidos (Tabela 1). ChoKβ mostrou um Km para a colina 2,8 vezes maior do que ChoKα1. Em contraste, o Km de ChoKβ de etanolamina era inferior ChoKα1. Estes resultados sugerem que, em sistemas isentos de células de colina é um melhor substrato para ChoKα1 (2,85 vezes) do que ChoKβ, enquanto etanolamina é um melhor substrato para ChoKβ (5,83 vezes) do que ChoKα1.

isoformas são ChoK diferencialmente regulada por Ras e Rho GTPases

Desde RAS e RhoA GTPases são reguladores a montante de ChoKα1 [15], [28], algumas das proteínas mais estudados da família pequena GTPase incluindo H-Ras e Rho membros -Família RhoA e Cdc42 foram testados como potenciais moduladores a montante de ChoKβ. Para esse fim, um

ensaio da actividade in vitro e

ChoK EtnK foi realizada em células HEK293T transfectadas com os mutantes constitutivas activas de cada GTPase (Fig. 2A) e, ou ChoKα1 e ChoKβ. Como mostrado na Figura 2, nenhuma das GTPases testados foram capazes de aumentar significativamente a actividade de colina-cinase ou de etanolamina de ChoKβ. Em contraste, sob condições semelhantes, Ras e RhoA foram capazes de induzir uma alteração estatisticamente significativa na activação de ambas as actividades e ChoK EtnK de ChoKα1 (Fig. 2b e 2c).

isoformas quinase de colina foram expressas isoladamente ou em combinação com as Ras indicados e GTPases Rho e atividade

in vitro

ChoK determinado. A) Análise de expressão ectópica por Western Blot nos HEK293T transfectadas Os extractos celulares de ChoKα1 (52 kDa), ChoKβ1 (45 kDa), RhoA-QL (22 kDa), Cdc42-QL (25 kDa) e H-rasV12 (23 kDa) . vectores vazios foram utilizados como controlos para os níveis endógenos, e GAPDH como controlo de carga. B) e C)

In vitro, a actividade de cinase de colina

de ChoKα1 ChoKβ1 ou na presença de uma maior expressão de formas activas constitutivos de RhoA, Cdc42 ou H-Ras. D) e E)

In vitro

atividade quinase etanolamina de ChoKα ou ChoKβ na presença de cada um indicado forma activa constitutiva da GTPase. Os resultados são representados como a indução de dobragem de conversão ao metabolito fosforilado correspondente determinado como o total de cpm /ug de extracto celular total, e normalizadas para as células transfectadas com vector vazio como controlo. Os dados mostrados representam os valores médios ± SEM de 3 experiências independentes, cada uma realizada com amostras em duplicado. A significância estatística (p≤0,05) é marcado por um asterisco em comparação com a atividade alcançado quando ChoKα1 ou ChoKβ1, quando necessário, são transf sozinho.

O papel diferencial entre ChoK isoformas na transformação celular e tumorigênese

a implicação de ChoKα1 na transformação de células e carcinogénese humana tem sido extensivamente estudada e tem sido demonstrado para exibir actividade oncogénica [15], [36]. Devido à sua extensa homologia, nós investigamos se ChoKβ poderia induzir a transformação celular, quando sobre-expresso em células não tumorigénicas. Em primeiro lugar, a capacidade das células ChoKβ-transfectadas para promover o crescimento celular independente da ancoragem foi determinada utilizando a linhagem de células HEK293T. Como relatado anteriormente, ChoKα1 induziu um aumento significativo no número de colónias em agar mole [15]. Em contraste, sob condições semelhantes, a sobre-expressão ChoKβ não teve nenhum efeito significativo sobre o número nem a dimensão das colónias quando comparado aos gerados pelo controlo, o vector vazio células HEK293T transfectadas (Fig. 3). Estes resultados foram confirmados usando uma outra linha de células não tumorigénicas de uma espécie diferente, tais como MDCK, obtendo-se resultados semelhantes, apesar de o nível inferior de sobre-expressão de ambas as isoformas de ChoK em comparação com as células HEK293T. O nível de expressão diferencial foi obtido devido à eficiência bastante diferente em cada transfecção de linhas de células (dados não apresentados).

A) e B)

In vitro

actividade de ChoK isento de células extractos de células transfectadas no momento do chapeamento, determinado como a conversão de

colina marcada com 14C a PCHO. C) fotografias de uma experiência representativa do ensaio em agar mole. Um total de 10

5 células foram plaqueadas por 60 mm de prato, e o número de colónias quantificado após 5-8 semanas de incubação. D) e E) computador baseado quantificação automática do número de colônias, os valores médios ± SEM é representado. O ensaio foi realizado 3 vezes independentes com amostras em triplicado a obtenção de resultados semelhantes. A significância estatística (p≤0,05) é marcado por um asterisco.

A capacidade de ChoKβ para induzir o crescimento do tumor também foi investigado. Ambos ChoKα1- e células HEK293T ou MDCK ChoKβ-transfectadas foram inoculadas subcutaneamente em ratinhos atimicos. Como mostrado na Fig. 4, a sobre-expressão de ChoKα1 foi suficiente para induzir o crescimento do tumor em ratinhos imunossuprimidos em ambos os sistemas celulares analisados. Em contraste, as células que sobre-expressam ChoKβ não foram capazes de induzir o crescimento do tumor em condições semelhantes. Tal como indicado acima, a comparação das taxas de crescimento tumoral entre as duas linhas de células está relacionada com a eficiência de transfecção diversificada, muito maior em HEK293T (aproxm. 80-90%) do que MDCK (aproxm. 15-20%). Estes resultados estão de acordo com aqueles obtidos nas experiências soft-agar, e fortemente indicam que a superexpressão da ChoKβ não é suficiente para induzir o crescimento do tumor em condições onde ChoKα1 faz.

Os xenoenxertos foram estabelecidas por s.c injecção de células HEK293T ou MDCK transfectadas em nu atímicos nu /ratinhos nus. A) e B) análise por Western Blot de expressão ectópica de isoformas de cinase de colina em células HEK293T ou MDCK transfectadas, respectivamente, antes da inoculação em camundongos. C) e D) Análise da actividade da cinase de colina em ChoKα1 ou β1 extractos HEK293T ou MDCK transfectadas células livres antes de ratinhos inoculação. E) e F) Volume de tumores gerados por injecção subcutânea de 10

6 células transfectadas. o volume tumoral foi calculado de acordo com a fórmula:

Vol = [D * d

2] /2

, em que D e d são diâmetros maior e menor do tumor, respectivamente. Os dados de HEK293T representa valores médios ± SEM de duas expericias independentes (N

1 = 12; N

2 = 16), a experiência MDCK correspondem a uma experiência equivalente com n = 12.

ChoKβ isoforma mostra a atividade EtnK preferencial

in vivo

a seguir, investigou se havia alguma diferença na atividade enzimática de ambos ChoK isoformas sob

in vivo

condições que poderia explicar a sua actividade biológica diferencial. Assim, a actividade de ChoKα1 e ChoKβ como ChoK e /ou EtnK num sistema de células inteiras foi testada. lípidos intracelulares de HEK293T humanas que sobre-expressam ChoKα1, ChoKβ ou transfectadas com um vector vazio, foi extraída uma analisados. Ambos, a fração lipídica insolúvel contendo os lipídios hidrofóbicos e conteúdo de proteína total foram utilizados como controle de carga obtenção de resultados semelhantes. Como mostrado na Figura 5A, os níveis intracelulares fosfoetanolamina foram aumentados para uma dimensão semelhante ou células em ChoKα1- ChoKβ-transfectadas. No entanto, os níveis intracelulares de células de fosfocolina ChoKβ-transfectadas não foi significativamente diferente ao de células de controlo, enquanto que as células ChoKα1-transfectadas mostraram um aumento dos níveis intracelulares PCHO (Figura 5B). Resultados semelhantes foram obtidos usando células epiteliais de diferentes origens: Células de adenocarcinoma da mama humano SK-BR-3 (figura 5C, D.) ou a de não pequenas células do cancro humano do pulmão (NSCLC) linha de células H1299 (Figura 5E, F.). Além disso, em todas as linhas celulares analisadas, a expressão da proteína foi também determinada por análise de transferência de Western (Fig. 5G).

HEK293T, SK-BR-3 ou H1299 células foram transfectadas com vectores de expressão eucarióticos e de humano ChoKα1 gene ChoKβ1 ou pCDNA3b vazio vector utilizado como controle. A), C) e E) EtnK actividade intracelular da cinase de colina a1 e b1 isoformas em células completas em HEK293T, H1299 e células SK-BR-3, respectivamente. B), D) e F) a actividade intracelular de ChoK isoformas ChoKα e ChoKβ em células completas em HEK293T, H1299 e células SK-BR-3, respectivamente. A quantidade de

14C-PCHO e

14C-PETN foram extraídos e quantificados, tal como descrito em Materiais e Métodos. O experimento foi realizado em amostras em triplicado, repetido 3 vezes, e os valores médios ± SEM de todos os experimentos estimados. A significância estatística (p≤0,05) é marcado por um asterisco. Um típico resultados da experiência-rotulagem de rádio em cerca de 70% dos resíduos radioactivos incorporação composto nas células. G) Representante Western Blot de ChoKα1 ectópica ou expressão ChoKβ1 em cada linha de células. Os valores basais escolhido como 1 vezes nos gráficos para cada linha de células representam: células HEK293T (PCHO: 1153 cpm; PETN: 1231 cpm); células H1299 (PCHO: 22821 cpm; PETN: 13339 cpm)., e SK-BR-3 células (PCHO: 18620 cpm, PETN: 3151 cpm)

Assim, a atividade enzimática diferencial da ChoKα1 e ChoKβ encontrados em HEK293T não é uma linha celular específica. Estes resultados indicam que ChoKα1 mas não ChoKβ, é capaz de induzir um aumento dos níveis intracelulares de PCHO sob

In vivo

condições. No entanto, sob as mesmas condições de ambas as enzimas são capazes de gerar phophorylethanolamine. Assim, embora ChoKβ exibe atividade tanto ChoK e EtnK em

in vitro

condições, mostra a atividade EtnK preferencial

in vivo

.

O aumento dos níveis de mRNA ChoKα mas não ChoKβ em linhas celulares derivadas de tumores

a fim de investigar adicionalmente a importância de cada isoenzima ChoK em tumorig�ese, foram determinados os níveis de ARNm tanto ChoKα ChoKβ e num painel de linhas celulares derivadas de tumores humanos por tecnologia de PCR quantitativa . Um painel de linhas de células da mama e cancro do pulmão foram comparados com a linha primária, senescentes, não-tumoral de células (células humanas mamárias epitelial) HMEC ou os imortalizadas, células MCF10A não-tumorogénicos como linhas de células da mama controlo, e células epiteliais brônquicas primárias ( BEC) como linha celular de controlo do pulmão. Todas as linhas celulares tumorais testadas superexpressarem significativamente mRNA ChoKα comparação com as linhas de células normais, ao passo que não houve alteração dos níveis de mRNA ChoKβ (Fig. 6). Estes resultados indicam que ChoKβ não é especificamente regulada positivamente em células de cancro da mama ou do pulmão, sugerindo que os altos níveis de ChoKβ não são necessários para a promoção de cancro.

Q-PCR foi realizada para determinar o nível de expressão de ARNm em linhas de células mamárias não-tumorogénicos (HMEC, MCF10A), linhas celulares de cancro da mama (MDA-MB435, MDA-MB468, T47D, MCF7), células não-tumorogénicos pulmonares (BEC) e linhas celulares de cancro de pulmão (H510, H82). Os dados foram normalizados com o ARN ribossómico 18S endógenos. Para a comparação entre linhagens de células tumorais e não tumorais, a 2

-ΔΔCt método foi aplicado e log

10 RQ é representado. Note-se que os dados são encaminhados para as células humanas epiteliais mamárias HMEC (níveis) de ARNm em linhas de células da mama e nenhuma diferença significativa no nível de ambas as isoformas de ChoK mRNA foi encontrado com a linha celular MCF10A normal. A referência para as células de câncer de pulmão foi o principal células epiteliais brônquicas (BEC).

MN58b é um inibidor específico da ChoKα isoforma

A implicação ChoKα na carcinogênese humana tem sido usado para a concepção de inibidores específicos desta enzima como uma estratégia anti-cancro romance [2], [14], [37]. MN58b é o composto que leva a apoiar esta nova estratégia, uma vez que tem mostrado uma atividade antitumoral potente em

in vivo

condições contra modelos de tumor de cólon, pulmão, mama e bexiga humanos [15], [37].

A estrutura primária de ChoKβ mamífero exibe uma homologia global de 60% com a de ChoKα1 [1]. O maior grau de homologia situa-se dentro do domínio de colina /etanolamina quinase. Esta homologia poderia torná-lo suscetível a uma inibição semelhante para ambos ChoKα1 e ChoKβ com os mesmos inibidores. Assim, investigou-se a especificidade de MN58b relativamente a esses dois ChoK isoenzimas, a fim de verificar se o seu efeito antitumoral é especificamente relacionado com a inibição da isoforma alfa, que é o único implicado na progressão tumoral, ou o fármaco afecta de forma semelhante ambas as isoformas. Usando as proteínas recombinantes ChoKα1 e ChoKβ humanos, foi realizada uma

in vitro

ChoK ensaio de inibição de actividade, utilizando concentrações crescentes de MN58b, determinando o IC

50 para cada enzima. Como esperado, não obstante a elevada similaridade entre exibida isoformas ChoK, MN58b mostrou uma especificidade muito mais elevada contra ChoKα1 (IC

50 = 5 ^ M) do que contra ChoKβ (IC

50 = 107,5