Abstract

Pinus massoniana

proantocianidinas casca (PMBPs), um componente activo isolado a partir de

casca de Pinus massoniana

, tem sido relatado possuir uma vasta gama de propriedades bioquímicas. Aqui, nós investigamos o efeito anti-tumoral de PMBPs no cancro do ovário. Os resultados indicaram que PMBPs reduziu significativamente o crescimento de células de cancro do ovário e da apoptose dependente da dose, induzida. Os mecanismos subjacentes envolvidos foram elucidadas para incluir a perda de potencial de membrana mitocondrial, diminuição da regulação da proteína anti-apoptótica de Bcl-2 e a activação de caspase 3/9, sugerindo que a apoptose desencadeada PMBPs através da activação da via apoptótica associada à mitocôndria. Além disso, a cicatrização de feridas e transpo� ensaios câmara revelou que PMBPs poderia suprimir a migração e invasão de células de cancro do ovário. PMBPs dramaticamente inibiu a actividade de MMP-9 e expressão, bloquearam a actividade de NFkB e a activação de ERK1 /2 e p38 MAPK. Nossos resultados sugerem que PMBPs tem o potencial de ser desenvolvido como uma droga anti-tumor para o tratamento de cancro do ovário e /ou gestão da doença

Citation:. Liu J, Bai J, Jiang G, Li X, Wang J, Wu D, et al. (2015) efeito anti-tumoral de

Pinus massoniana

Bark Proanthocyanidins no cancro do ovário através da indução de apoptose celular e inibição da migração celular. PLoS ONE 10 (11): e0142157. doi: 10.1371 /journal.pone.0142157

editor: Yi-Hsien Hsieh, do Instituto de Bioquímica e Biotecnologia, TAIWAN

Recebido: 01 de maio de 2015; Aceito: 19 de outubro de 2015; Publicação: 05 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (No.81302282) (URL: https://www.nsfc.gov.cn/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário continua a ser o quinto tipo de câncer mais comum em mulheres e a principal causa de morte em malignidades ginecológicas [1] .O tratamento de primeira linha de câncer de ovário é geralmente a cirurgia tradicional combinada com quimioterapia baseada em platina-paclitaxel [2]. Apesar da boa resposta inicial na maioria dos pacientes com câncer ovariano, a taxa de sobrevida de 5 anos ainda é baixa devido ao relapses- uma ocorrência comum após o tratamento de primeira linha [3]. Tem havido alguns desenvolvimentos no tratamento do câncer de ovário desde a padronização de cisplatina e paclitaxel drogas nos últimos 20 anos [4]. Há uma necessidade urgente de desenvolver novos medicamentos eficazes para o tratamento de cancro do ovário.

Atualmente, alguns fitoquímicos bioativos naturais são usados ​​para impedir a proliferação ou metástase das células cancerosas [5]. Tal fitoquímicos são não tóxicos e desprovidos de efeitos secundários, assim, eles são boas alternativas e /ou complementares a quimioterapia convencional citotóxico [5]. O extrato de casca de pinheiro antes era considerado um produto de resíduos inconveniente na indústria da madeira, mas agora reconhecido como rico em proantocianidinas naturais com potenciais propriedades medicinais [6]. Tem sido demonstrado que as proantocianidinas podem ser empregues para impedir tumoral devido à sua capacidade para modular a actividade de vários alvos envolvidos na carcinogénese [7]. Portanto, a atividade anti-tumoral de pinho extrato da casca tem recebido mais atenção recentemente.

Pinus massoniana

Cordeiro da família Pinaceae é nativo do sul e sudoeste da China. A sua casca tem sido usado na medicina tradicional Chinesa para o tratamento de inflamação, artralgia, reumatismo e cancro [8]. O principal componente da

Pinus massoniana

casca é também proantocianidinas. A sua actividade anti-tumoral foi demonstrada em células de hepatoma humano Hep G2, células Hela de cancro cervical e células de sarcoma murino S180 [9,10,11]. No entanto, os efeitos do

Pinus massoniana

proantocianidinas casca (PMBPs) sobre câncer de ovário e os mecanismos subjacentes ao processo estão ainda a ser delineado

.

Neste estudo, avaliou-se proantocianidinas de

Pinus massoniana

casca pode exercer efeitos anti-tumorais em células de cancro do ovário e investigados os mecanismos detalhados subjacentes a este processo. Nossos dados podem fornecer uma base para o futuro desenvolvimento da PMBPs como uma droga eficaz para o tratamento de cancro do ovário.

Materiais e Métodos

materiais, reagentes e produtos químicos

Os anticorpos contra a caspase -3, caspase-9, Bcl-2 foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Denver, MA). Os anticorpos contra a MMP-9, NFkB, IκBα e β-actina foram obtidos a partir de proteínas Tech Group, Inc. (Chicago, EUA). Os anticorpos contra IκBα fosforilada, ERK1 /2, p38 e JNK foram obtidos a partir de Sangon Biotech, China. O kit de quimioluminescência aumentada (ECL) foi comprado de Amersham Life Science, Inc. (EUA). A anexina V conjugada com kit de detecção de apoptose FITC e JC-1 de membrana mitocondrial kit de detecção de potencial foram comprados a partir de Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd (Nanjing, China). Transwells foram adquiridos a BD Biosciences (San José, EUA). MTT (brometo de 3- (4,5-dimetil-2-il) -2,5-difenil tetrazólio) e DAPI (2- (4-amidinofenil) dicloridrato -6-indolecarbamidine) foram obtidos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). PMBPs pó foi comprado de Shaanxi Sciphar Hi-tech Industry Co., Ltd (Shanxi, China). Continha cerca de 95% de proantocianidinas e estável durante pelo menos dois anos a 4 ° C.

linhas de células e cultura de células

de células de cancro do ovário A2780 linha foi obtida da American Type Culture Collection (ATCC ) e crescidas em meio DMEM suplementado com FBS a 10% (ambos adquiridos a partir de Gibco BRL, Grand Island, NY, EUA). OV2008 foi gentilmente cedido pelo Prof. Shiying Cui (Dalian Medical University, China) e cultivadas em meio RPMI-1640 (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) suplementado com FBS a 10%. A linha celular epitelial de ovário normal IOSE80 foi obtido pela Canadian tecido ovariano Banco e cultivadas em meio 199 (Invitrogen) e MCDB 105 (Sigma) suplementado com 10% de FBS. Quando as células foram 80% confluentes, foram colhidas por tripsinização 0,25%. As células foram tratadas com diferentes concentrações de PMBPs com controlos correspondentes apropriados.

A viabilidade celular ensaio

O efeito de PMBPs sobre a viabilidade das células foram detectados por ensaio MTT. As células (1 x 10

4 /po) foram semeadas em placas de 96 poços e incubou-se durante 24 h. Em seguida, 200 ul de meio contendo 0, 10, 25, 50, 75, 100 e 120 ug /ml PMBPs foram adicionados em cada cavidade. Cada concentração de PMBPs foi sextupled. Após 24 h e 48 h PMBPs tratamento, 20 ul de MTT (5 mg /ml em PBS) foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 4 h. A solução de MTT foi removido e os cristais de formazan foram dissolvidos em 150 ul de DMSO. A absorvância da solução foi medida utilizando um leitor de placas Multiskan Ascent comprimento de onda a 540 nm.

coloração DAPI ensaio

Aproximadamente 4 × 10

4 células /poço de células de cancro do ovário foram plaqueadas em placa de 6 poços e subsequentemente tratado com PMBE a 0, 25, 50 e 100 ug /ml durante 24 h. Células em cada poços foram coradas com DAPI antes da fixação com 3,7% de formaldeído. As células foram então lavadas com PBS e analisadas por microscopia de fluorescência.

apoptose celular por citometria de fluxo

Após tratamento com 0, 10, 25, 35 e 50 ug /ml PMBPs durante 24 h, células de cancro do ovário foram colhidas e lavadas três vezes com PBS, depois incubadas com Anexina V-FITC e PI, durante 10 min no escuro. As células foram detectados por um fluxo FACS /citómetro Calibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA).

Ensaio para a membrana mitocondrial potencial

As alterações do potencial de membrana mitocondrial de células de cancro do ovário foram detectados por citometria de fluxo utilizando JC-1 kit de detecção. Após tratamento com 0, 25, 35, 50 ug /ml PMBPs durante 24 h, as células foram colhidas e incubadas com corante JC-1 durante 15 min a 37 ° C de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram detectados por um fluxo FACS /Calibur citómetro.

cicatrização de feridas ensaio

A2780 e células OV2008 foram semeadas em placas de 6 poços e cultivado para criar uma monocamada confluente. A monocamada de células foi riscada em uma linha reta com uma p200 ul ponta da pipeta. As placas foram lavadas com PBS para remover as células destacadas e, em seguida, incubadas com meio de crescimento completo contendo /ml de solução PMBPs 0, 5, 10 e 25 ug por 24 h. A migração celular foi observado sob um microscópio de contraste de fase a 100 vezes a 0 e 24 h após a indução da lesão. As células migraram para a córnea no cada um dos seis campos aleatórios foram medidos e quantificados utilizando um microscópio assistida por computador.

Transwell ensaio de câmara de

A migração celular e invasão foram quantificadas pelo ensaio de câmara de Transwell. células cancerosas do ovário foram tratados com 0, 5, 10 e 25 ug /ml PMBPs durante 24 h e colhidas. 1 × 10

5 células em DMEM isento de soro foram adicionadas a cada uma das câmaras superior e DMEM com FBS a 10% foi adicionada à câmara inferior, como um quimioatractor. Após 24 h de incubação a 37 ° C, as células que permanecem na superfície superior da membrana foram removidos e as células que migraram para o lado inferior da membrana foram coradas com violeta de cristal a 0,1% durante 10 min. As células migradas no lado inferior da membrana foram contados sob um microscópio com ampliação de 100 x. Seis campos aleatórios de cada membrana Transwell foram contadas e média.

Gelatina zimografia

A atividade de MMP-9 foi detectado por zimografia. As células tumorais foram tratadas com 0, 5, 10, 25 ug /ml PMBPs durante 24 h. Em seguida, o meio de células foi recolhido e centrifugado para remover os detritos celulares. Um volume igual de meio clarificado foi submetido a electroforese através de gel de SDS-PAGE a 10%, contendo gelatina a 0,1% (v /w) a 4 ° C. O gel foi lavado com tampão de lavagem (Tris-HCl a 50, pH 7,5, NaCl 100 mM e 2,5% de Triton X-100) e subsequentemente incubadas em tampão de activação (Tris-HCl a 50, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 10 mM CaCl

2, 0,02% de NaN

3 e 1 uM de ZnCl

2) a 37 ° C durante a noite. Em seguida, o gel foi corado com 0,25% (w /v) de Coomassie Brilliant Blue em 45% (v /v) de metanol e 1% (v /v) de ácido acético e descorados com 10% de isopropanol /10% ácido acético (v /v ) solução. MMP-9 Foram observadas bandas a 92 kDa.

Preparação de ligado de células totais e nucleares

fracção

Para lisado de células totais, as células foram homogeneizadas em tampão de RIPA (Beyotime, Jiangsu, China). Os lisados ​​celulares foram centrifugados a 12000 rpm durante 10 min a 4 ° C e o sobrenadante foi recolhido. fracção nuclear foi extraída por um método modificado (Yeh, 2012). Resumidamente, as células foram tratadas com tampão A (HEPES 10 mM, KC1 10 mM, EDTA 0,1 mM, MgCl2 1,5 mM, 0,2% de NP-40, DTT 1 mM, e mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo 0,5) e peletes nucleares foram recolhidos por centrifugação a 3000 rpm durante 30 s a 4 ° C. A fracção nuclear foi, em seguida, extraiu-se por tampão B (20 mM de HEPES, 25% glicerol, 1,5 mM MgCl

2, EDTA 0,1 mM, NaCl 420 mM, DTT 1 mM e fluoreto de fenilmetilsulfonilo 0,5 mM).

Western blot, ensaio

Os lisados ​​de células totais ou extractos nucleares foram separados por 10% SDS-PAGE e depois transferidos para uma membrana de nitrocelulose por meio de aparelhos semi-seco durante 1 h. A membrana foi bloqueada com leite não gordo a 5% durante 1 h e, em seguida, incubadas com a solução de anticorpo primário específico durante a noite a 4 ° C. Após a incubação com o anticorpo secundário anti-espécies apropriadas para 1 h, as bandas de proteína foram visualizadas por kit ECL.

A análise estatística

Os dados foram analisados ​​estatisticamente pelo teste t de Student e apresentados como média ± SD para três experiências independentes. O software SPSS 15.0 foi utilizado nas análises. O valor de P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Os efeitos da PMBPs sobre a viabilidade das células de cancro do ovário

Os efeitos da PMBPs sobre a viabilidade do ovário. células cancerosas e células normais de ovário foram primeiramente detectados pelo ensaio de MTT. Células do cancro do ovário A2780 e OV2008, bem como células de ovário de IOSE80 normais foram tratadas com diferentes concentrações de PMBPs (0, 10, 25, 50, 75, 100, 120 ug /ml) durante 24 h ou 48 h. células de cancro do ovário a seguir ao tratamento PMBPs mostrou uma redução dramática na viabilidade celular a partir de 25 ug /ml de um modo dependente da dose (

P

0,01), enquanto a mesma concentração não afectou significativamente a viabilidade das células ovarianas normais IOSE80 (Fig 1A). O valor de IC50 de PMBPs foi de 48 ± 2,4 ug /ml para A2780 e 67 ± 2,7 ug /ml para OV2008 após 48 h (Fig 1A).

células cancerosas ovarianas A2780 (A) e OV2008, e normal do ovário IOSE80 células foram tratadas com PMBPs (0, 10, 25, 50, 75, 100, 120 ug /ml) durante 24 h ou 48 h. viabilidade As células “para as várias concentrações de PMBPs foram detectados por ensaio de MTT e expressos em relação à de células não-tratadas. As experiências foram repetidas três vezes. (B) do ovário células cancerosas A2780 e OV2008, e células de ovário normais IOSE80 foram tratados com PMBPs (0, 25, 75, 100 ug /ml) durante 24 h, e as células foram fotografadas com microscopia de contraste invertido (ampliação, 40 ×).

Além disso, as alterações morfológicas de células de câncer de ovário foram examinados sob um microscópio de contraste de fase. A2780 e OV2008 células cultivadas sem PMBPs exibida forma normal característico, com 70% de confluência após 24 h. No entanto, a confluência das células foi dramaticamente reduzido com alterações morfológicas evidentes após tratamento PMBPs. As células começaram a encolher, perderam a sua forma normal, tornou-se rodada e, finalmente, separado da placa de cultura (Figura 1B). Em contraste, não observamos tais alterações morfológicas em células ovarianas normais, IOSE80, após o tratamento PMBPs (Fig 1B). Todos juntos, estes dados indicam que PMBPs inibir seletivamente a viabilidade das células de câncer de ovário, com menos efeito sobre as células não malignas.

PMBPs induzir ovário células cancerosas “apoptose

Para avaliar se os efeitos anti-tumorais de PMBPs em células OV2008 e A2780 foram associadas com a apoptose, as células de cancro do ovário foram corados com DAPI e observados sob um microscópio de fluorescência (Figura 2A). Após o tratamento com diferentes concentrações de PMBPs durante 24 h, a condensação da cromatina nuclear e pontuar fragmentada fluorescência nuclear azul foram observados em células de cancro do ovário de um modo dependente da dose, semelhantes às alterações morfológicas nas células apoptóticas, mas as células de controlo exibida normal e núcleos intactos. Ele sugere que PMBPs podem induzir apoptose de células de cancro do ovário.

(A), células A2780 e células OV2008 foram tratados com PMBPs (0, 25, 50, 100 ug /ml) durante 24 h. As alterações morfológicas dos núcleos foram examinadas por microscopia de fluorescência utilizando coloração DAPI. As setas indicam a condensação nuclear e corpos apoptóticos (ampliação, x 100). células A2780 e OV2008 (B) foram tratadas com PMBPs (0, 10, 25, 35, 50 ug /ml) durante 24 h. A citometria de fluxo foi aplicado para analisar as células A2780 manchadas duplas anexina V-FITC /PI. O quadrante direito baixo (LR) dos histogramas indica as células em apoptose precoce e no quadrante superior direito (UR) indica que as células apoptóticas e necróticas final. (C) O tratamento de células A2780 e células OV2008 com PMBPs resultou em aumento dramático na percentagem de células apoptóticas e necróticas (incluindo apoptose precoce, tardia de apoptose e necrose). As experiências foram repetidas três vezes.

** P .. 0

01

em comparação com o grupo controle

Para quantificar ainda mais a apoptose causada por PMBPs, A2780 e células OV2008 foram marcadas com Anexina V-FITC /PI e analisadas por citometria de fluxo. O quadrante inferior direito (LR) indica a porcentagem de células em apoptose precoce (anexina V

+ e PI

-) e o quadrante superior direito (UR), a percentagem de apoptose tardia e células necróticas (anexina V

+ e PI

+). Os resultados mostraram que PMBPs desencadeada a apoptose de células de cancro do ovário, a partir de 25 ug /mL, de um modo dependente da dose (Fig 2B). A percentagem de apoptóticos e necróticos células totais de células A2780 foi de 1,17% em células de controlo (LR: 0,2% e UR: 0,97%), 2,46% nas células tratadas com /PMBPs ml 10 ug (LR: 2,42% e UR: 0,04% ), 17,63% nas células tratadas com /PMBPs 25 ug ml (LR: 16,12% e UR: 1,51%), 49,24% em células tratadas com /PMBPs ml 35 ug (LR: 41,87% e UR: 7,37%) e 77,23% em células tratadas com 50 /PMBPs ug ml (LR: 71,44% e UR: 5,79%) (Figura 2B). Da mesma forma, aqueles em células OV2008 foram 5,78% em células de controlo (LR: 0,83% e UR: 4,95%), 6,46% nas células tratadas com /PMBPs ml 10 ug (LR: 1,38% e UR: 5,08%), 21,45% em As células tratadas com /PMBPs 25 ug ml (LR: 13,88% e UR: 7,57%), 59,94% nas células tratadas com /PMBPs 35 ug ml (LR: 24,79% e UR: 35,15%) e 55,31% nas células tratadas com 50 ug /ml PMBPs (LR: 10,21% e UR: 45,1%) (Figura 2B). Nossos resultados demonstram que PMBPs poderia induzir significativamente tanto a apoptose precoce e tardia em células de cancro do ovário (

p Art 0,01). (Fig 2C)

PMBPs induzir membrana perda potencial mitocondrial

sabe-se que os danos mitocôndrias durante a apoptose altera o potencial de membrana mitocondrial [12]. Para explorar os efeitos de PMBPs no potencial da membrana mitocondrial, as células tratadas com PMBPs foram detectados por JC-1 de corante. Tal como mostrado na Fig 3, a percentagem média de células A2780-positiva de fluorescência verde era 2.41% sem tratamento, 20,63% a 25 ug /ml, 43,77%, a 35 ug /mL e 66,6% a 50 ug /ml tratamento PMBPs. Do mesmo modo, aqueles em células OV2008 foram de 0%, sem tratamento, 36,28% a 25 ug /ml, 43,81%, a 35 ug /ml e 78,79% a 50 ug /ml (Fig 3A). Houve um aumento dependente da dose significativa em células de fluorescência verde-positiva (Fig 3B) (

p . 0

01

), sugerindo que a perda de potencial de membrana mitocondrial correlacionado com o aumento da dose de PMBPs tratamento. Por conseguinte, a apoptose de células de cancro do ovário por PMBPs está associada com o dano da membrana mitocondrial.

(A) O A2780 e células OV2008 foram tratados com PMBPs (0, 25, 35, 50 ug /ml) durante 24 h e, em seguida, colhidas, coradas com corante JC-1, e finalmente analisadas por citometria de fluxo. de tratamento (B) PMBPs resultou num aumento significativo de células positivas fluorescência verde (GFP) que indicou a perda de potencial de membrana mitocondrial. As experiências foram repetidas três vezes.

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em comparação com o grupo controle

PMBPs upregulate proteínas relacionadas à apoptose e suprimir Bcl-2

Desde PMBPs poderia induzir a apoptose em células de cancro do ovário, examinámos ainda algumas proteínas relacionadas com apoptose por Western blot. O nível de β-Actina serviu como controlo interno. Descobrimos que a expressão da proteína anti-apoptótica de Bcl-2 em células de cancro do ovário, tratadas com PMBPs diminuiu significativamente de uma maneira dependente da dose (

p . 0

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) (Fig 4A , 4B e 4C). Os membros caspases são mediadores cruciais da apoptose [13]. As expressões de caspase-3 e caspase-9 foram avaliadas. -Caspase-9 clivada níveis de expressão clivado-caspase-3 e foram a seguir ao tratamento PMBPs upregulated drasticamente em células de cancro do ovário (

p . 0

01

) (Fig 4A, 4B, 4D e 4E). Estes resultados sugerem que PMBPs activar a via da apoptose dependente da caspase.

(A, B) As células A2780 e OV2008 foram tratados com PMBPs (0, 15, 25, 35, 50 ug /ml) durante 24 h e, em seguida, colhidas. Os lisados ​​celulares foram preparados e submetidos a análise de Western blot. Os níveis de proteína de Bcl-2, clivados por caspase-3 clivada e-caspase-9 foram medidos por Western blot. (C, D, E) Os histogramas mostram a média dos níveis de expressão de Bcl-2, clivados por caspase-3 clivada e-caspase-9 (± DP), respectivamente, a partir de três experiências independentes. Bcl-2, clivados por caspase-3 clivada e os níveis de caspase-9-foram expressos relativamente ao controlo de carga, β-actina. Todas as experiências foram repetidas três vezes

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em comparação com o grupo controle

PMBPs inibir a migração e invasão de câncer de ovário. células

A migração celular e invasão são características de células tumorais. Para investigar se PMBPs prejudicada a migração e a invasão de células de cancro do ovário, foi realizada de feridas com cura ensaio diferente, não apoptótica (5 ug /ml e 10 ug /ml), concentrações de PMBPs durante 24 h. Descobrimos que PMBPs dependente da dose diminuiu o movimento de células A2780 e OV2008 (Fig 5). As taxas de encerramento de feridas de PMBPs células tratadas foram menores do que a de células não-tratadas (

P . 0

01

) (Fig 5B e 5C). Além disso, foi examinada a capacidade de invasão de células utilizando um destes poços 24 Transwell câmara, na presença de diferentes concentrações de PMBPs durante 24 h. PMBPs inibiu significativamente o potencial de migração e invasão das células de cancro do ovário de um modo dependente da dose (

P . 0

01

) (Fig 6). O tratamento com 5-25 ug /ml PMBPs inibiu a migração e a invasão de 27% -66%, respectivamente, em células A2780, e 11% -40% em células OV2008, em comparação com os controlos (Fig 6B e 6C). Ambos cura ensaio ferida e transpoço ensaio de câmara sugerem que PMBPs poderia suprimir a migração e invasão de células de cancro do ovário

As monocamadas de células A2780 e OV2008 foram riscados com uma ponta de pipeta e tratada com PMBPs (0, 5, 10. , 25 ug /ml) durante 24 h. (A) fotos representativas de migração de células ao microscópio a 100 × campo ampliação, antes e após a lesão. (B, C) A migração de células A2780 e OV2008 foi quantificada por medição das áreas de encerramento de feridas antes e após a lesão. As experiências foram repetidas três vezes. **

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01 Restaurant and ***

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em comparação com o grupo controle

A2780 células OV2008 e foram tratados com PMBPs (0, 5, 10, 25 ug /ml) durante 24 h. (A) Imagens representativas de células que migraram e invadiram sobre o lado inferior da membrana Transwell em 100 vezes com um microscópio. (B, C) Número de células de cada campo foi contado e média. células invadidas foram expressos relativamente ao grupo de controlo. As experiências foram repetidas três vezes. **

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01 Restaurant and ***

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em comparação com o grupo controle

a inibição da actividade de MMP-9 e expressão por PMBPs

Devido aos efeitos de PMBPs sobre a migração de células do cancro do ovário e invasão, investigou ainda mais os mecanismos deste processo. Uma vez que a MMP-9 desempenha um papel importante na invasão do cancro, nós próxima detectado MMP-9, a actividade da enzima e da expressão após tratamento PMBPs. MMP-9 actividade em meio condicionado foi analisado por zimografia em gelatina, e MMP-9 de expressão foi analisada por Western blot. dependentemente da dose PMBPs suprimida a actividade de MMP-9 (Figura 7A) e reduzida de MMP-9 nível de expressão da proteína (

P . 0

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) (Figura 7B). Assim, a actividade inibidora de PMBPs na invasão de cancro do ovário pode ser, pelo menos parcialmente, devido à supressão da actividade de MMP-9.

As células foram tratadas com PMBPs (0, 5, 10, 25 ug /ml) durante 24 h. (A) Actividade de MPM-9 no sobrenadante de células a várias concentrações de PMBPs foi examinado por ensaio de zimografia de gelatina. As bandas brancas representam MMP-9 digestão de gelatina mediada. (B) A expressão da proteína de MMP-9 em células A2780 em várias concentrações de PMBPs foi avaliada por Western blot. Histograma mostra o nível médio de MMP-9 (± DP) de três experiências independentes. MMP-9 nível de proteína foi expressa relativamente ao controlo de carga, β-actina, e normalizado para o grupo controlo não-tratado. *

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em comparação com o grupo controle

PMBPs prejudicar a translocação nuclear de NFkB e MAPK ativação da via

Muitos estudos têm demonstrado que a inibição da actividade de NFkB pode suprimir a invasão da célula cancerosa [14,15,16]. Nós, por conseguinte, investigado o efeito sobre a actividade de NFkB PMBPs nas células de cancro do ovário. O tratamento de células A2780 com PMBPs reduziu significativamente a translocação nuclear de NFkB e a fosforilação de IκBα (

P . 0

05

) (Fig 8A e 8C). Estes solicitado que PMBPs pode, pelo menos em parte, suprimir a invasão de células do cancro do ovário por inibição da actividade de NFkB. Vários estudos indicaram que a activação de proteínas cinases mitgen-activatied (MAPKs), incluindo ERK1 /2, p38MAPK, JNK estão envolvidos na migração e invasão do tumor, e que estes MAPKs actuar a montante do NFkB [17,18,19]. Por conseguinte, o estado de activação de ERK1 /2, p38MAPK e JNK foi examinada nas células A2780 tratados com várias concentrações de PMBPs. PMBPs inibiu significativamente a ERK1 /2 e ativação p38MAPK; mas não JNK (

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) (figura 8B e 8D). Assim, a supressão de ERK1 /2 e a activação de p38MAPK por PMBPs pode contribuir para a capacidade de invasão prejudicada das células cancerosas do ovário.

(A, B) As células foram tratadas com PMBPs (0, 5, 10, 25 ug /ml) durante 24 h. Os lisados ​​celulares foram preparados e submetidos a análise de Western blot. O nível de proteína de p65 nuclear, P-IκBα, IκBα, p-ERK, p-p-p38 e JNK foram medidos. (C, D) Os histogramas mostram média (± DP) de nível nuclear p65, p-IκBα, IκBα, p-ERK, p-p38 e p-JNK a partir de três experiências independentes. A p65 nuclear, P-IκBα, IκBα, p-ERK, p-p38 e os níveis de expressão de p-JNK foram expressos em relação ao carregamento β-actina de controlo e normalizados em relação ao grupo não tratado de controlo. *

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Discussão

o câncer de ovário continua a ser a principal causa de morte em cancros ginecológicos, em grande parte por causa de diagnóstico fase tardia e tratamentos eficazes limitados, especialmente na doença recorrente [20]. produtos naturais derivados de plantas são agentes terapêuticos promissores para tratamentos de câncer [21]. Portanto, nós exploramos a utilidade potencial de proantocianidinas de

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casca em células de cancro do ovário na busca de encontrar novos medicamentos eficazes para o tratamento de câncer de ovário. Nossos dados aqui demonstrado que PMBPs reduziu a proliferação, apoptose induzida e suprimiu a migração de células de cancro do ovário.

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extrato da casca foi relatado para inibir o crescimento de vários tipos de câncer. É impedido selectivamente a proliferação de células BEL-7402 e HepG2 de hepatoma humano, mas ligeiramente promoveu o crescimento de células do fígado humanas normais G-02 in vitro [8,9,22]. É também suprimiu o crescimento de células humanas Hela de cancro cervical e a apoptose induzida. Neste estudo, descobrimos que proantocianidinas extraídas do

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casca inibiu significativamente a proliferação de células de cancro do ovário, mas não afetou células ovarianas normais. Também foi observado que as células cancerosas se encolheu e separado placas de cultura após o tratamento PMBPs, o que sugere que PMBPs impedir seletivamente o crescimento de células de câncer de ovário e causar morte celular.

Além disso, investigamos os mecanismos anti-tumorais empregados por PMBPs em células de cancro do ovário. A apoptose desempenha um papel muito importante na eliminação de células de tumor de crescimento hiper [23] ou mutado. Existem vários tipos de produtos naturais que têm sido relatados para evitar o crescimento de células tumorais através de indução da apoptose [24]. Alguns estudos têm revelado que

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casca extracto de induzir apoptose em células de cancro cervical humano HeLa, células HepG2 de hepatoma humano e células S180 de sarcoma de murino de uma maneira dose-dependente [9,10,11]. No presente estudo, os dados de coloração DAPI revelou que as células tratadas com PMBPs demonstraram alterações morfológicas apoptóticas específicos. A citometria de fluxo de dados indicaram ainda que a proporção de células em apoptose aumentou significativamente a seguir ao tratamento PMBPs. Todos estes resultados indicam que PMBPs induz a apoptose em células de cancro do ovário.

A indução de apoptose está relacionada com a supressão das proteínas anti-apoptóticas e a regulação positiva de proteínas pró-apoptóticas [25]. Tem sido relatado que a proteína Bcl-2 é primordial na regulação da via apoptótica associada à mitocôndria [26]. A sub-regulação de BCL-2 resulta na perda de potencial de membrana mitocondrial e a libertação de citocromo

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das mitocôndrias para o citossol para activar caspase-9 [27]. O clivada pela caspase-9 activa adicional da caspase-3, uma das enzimas chave da via apoptótica intrínseca, para induzir apoptose eventos subsequentes [28]. Nisto, os nossos resultados mostraram que PMBPs induziu uma perda significativa de potencial de membrana mitocondrial. Além disso, observou-se a redução de expressão de Bcl-2 acompanhada com níveis elevados de clivada pela caspase-9 clivada e-caspase-3 em células de cancro do ovário, tratadas com PMBPs. Pode-se considerar que PMBPs pode induzir a apoptose através da via apoptótica associada à mitocôndria.

Nós descobrimos que PMBPs efetivamente suprimida a migração câncer de ovário e invasão. Um factor importante que facilita o espalhamento metastático de células cancerosas é enzimas proteolíticas que degradam a matriz extracelular que rodeia, e, portanto, facilitam a migração das células através da membrana basal. As metaloproteinases de matriz (MMPs) são envolvidos na remodelação da matriz [29]. No que diz respeito ao cancro do ovário, a expressão de MMP-9 foi ligada com subtipos invasivos [30]. Nosso trabalho demonstra que PMBPs poderia regular negativamente a MMP-9 expressão e atividade. Portanto, PMBPs pode suprimir MMP-9 atividade de prejudicar as capacidades de migração e invasão de células de cancro do ovário.

A ativação do NFkB é crucial para a migração e invasão de células de cancro do ovário [31,32,33]. Propusemos que PMBPs pode suprimir a actividade NFkB e inibir a invasão de cancro do ovário. A fosforilação de IκBα pode libertar subunidades NFkB, que são transportados do citoplasma para o núcleo das células para regular genes alvo [34]. Neste estudo, observou-se que a fosforilação IκBα e NFkB translocação desde o citoplasma para o núcleo inibida por tratamento PMBPs (Fig 8A e 8C). NFkB serve como fator de transcrição para a regulação MMP-9 [35,36]. Os nossos resultados demonstram que a actividade de NFkB PMBPs suprimir e isto correlaciona-se positivamente com a infra-regulação da expressão de MMP-9.

A cascata de sinalização MAPK, incluindo ERK1 /2, p38 MAPK e JNK, tem sido implicado na migração e invasão de inúmeros tipos de células de cancro [37,38,39]. Neste estudo, especulamos que PMBPs pode antagonizar a vias de sinalização MAPK para suprimir a migração e a invasão de células de cancro do ovário. Os nossos dados indicam que o tratamento PMBPs inibiu a activação de ERK1 /2 e p38 MAPK, de forma dependente da dose, mas teve pouco efeito sobre a via JNK (Fig 8B e 8D).