Abstract

eventos epigenéticos são contribuintes importantes para a patogênese do câncer, e definindo mecanismos epigenéticos representa uma nova estratégia na terapia anticancro. Agentes demetilantes clássicos, tais como 5-aza-2′-desoxicitidina (decitabina), mantenha o potencial de reprogramação células cancerosas somáticas demonstrando alta eficácia terapêutica em doenças hematológicas malignas. Por outro lado, o tratamento de tumores sólidos epigenética muitas vezes dá origem a efeitos secundários indesejados citotóxicos. sistemas de entrega adequado capaz de enriquecer decitabina no local de acção e de melhorar a sua biodisponibilidade reduziria a incidência da toxicidade sobre os tecidos saudáveis. Neste trabalho nós fornecemos evidências pré-clínicos de uma terapia epigenética seguro, versátil e eficiente alvo para o tratamento hormonal sensíveis (LNCap) e cancros da próstata hormônio refratário (DU145). Uma nova formulação decitabina, com base na utilização de eritrócitos engenharia (Eritro-magneto-Hemaglutinina virossomas, EMHVs) sistema de administração de fármaco (DDS) que suporta esta droga, foi refinado. Dentro das EMHVs, a droga foi protegido do ambiente e fosforilada na sua forma activa. O novo magnética EMHV DDS, dotado de proteína fusogénica, melhorou a estabilidade da droga transportada e exibiu uma elevada eficiência na confinando a sua entrega no local de acção

In vivo

por aplicação de um campo magnético estático externo. Aqui mostramos que decitabina carregado na EMHVs induz uma redução significativa da massa tumoral em modelos de xenoenxerto de cancro da próstata, a uma concentração, que é setecentas vezes mais baixa do que a dose terapêutica, sugerindo uma farmacocinética melhoradas /farmacodinâmica do fármaco. Estes resultados são relevantes para e discutidos à luz do desenvolvimento de terapias autólogas personalizados e abordagem clínica inovadora para o tratamento de tumores sólidos

Citation:. Naldi I, Taranta M, Gherardini L, Pelosi G, Viglione F, Grimaldi S , et ai. (2014) Novel epigenética alvo para terapia de câncer de próstata: Um estudo pré-clínico. PLoS ONE 9 (5): e98101. doi: 10.1371 /journal.pone.0098101

Autor: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de dezembro de 2013; Aceito: 28 de abril de 2014; Publicado em: 22 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Naldi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) financiamento e pelo financiamento da Comunidade Europeia para pOR creo FESR 2007-2013, BANDO UNICO R S-ANNO 2012 da Regione Toscana-Project sigla Título: ACTILA. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Co-autor Caterina Cinti é um membro do conselho editorial PLOS mas isso não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas e critérios editoriais.

Introdução

o câncer de próstata (PC) é um tumor maligno comumente diagnosticado em países desenvolvidos e sua incidência aumenta drasticamente com a idade [1], [ ,,,0],2]. Apesar do sucesso comprovado de terapia hormonal, castração cirúrgica [3], [4] e radioterapia [5] – [7], no entanto depois de ser gerido um subgrupo de pacientes progressão da doença manifesta e tornou-se a resistência a uma maior manipulação hormonal [8] – [10]. Até 20% dos pacientes de PC tratados com prostatectomia radical tem a probabilidade de progredir para câncer invasivo com condições metastáticas recaíram dentro de 5 a 10 anos [11]. A sobrevida média dos pacientes com PC metastático é 12-16 meses a partir do momento do diagnóstico até a morte [12]. Não estão disponíveis tratamentos curativos, nesta fase da doença. Apesar dos esforços de investigação intensiva, os mecanismos moleculares pelos quais as células de câncer de próstata se tornam resistentes à terapia hormonal permanecem pouco caracterizados.

alterações epigenéticas, envolvendo hipermetilação de genes em caminhos críticos, tais como o reparo do DNA, metabolismo e invasão /metástase, foram encontrados no cancro da próstata fornecendo novas informações sobre a patogênese deste tumor [13], [14]. alterações pós-translacionais enfraquecendo a estrutura da cromatina alterar a expressão genética e levar as células a metastático propagação. No entanto, como modificações epigenéticas não exigem mudança na sequência de ADN que são potencialmente reversíveis. ADN metiltransferases (DNMTs) envolvidos no silenciamento epigenético da expressão do gene tornar-se, por conseguinte, um alvo adequado para tratamentos epigenética [15] – [17].

decitabina (5-aza-2′-DC) é um desmetilante clássico agente aprovado pela FDA para o tratamento de pacientes com síndromes mielodisplásicas e leucemia linfoblástica aguda (GAP) [18]. No entanto, o tratamento benéfico de decitabina permanece incerto para pacientes com tumores sólidos como a falta de estabilidade química em solução aquosa e na elevada incidência de neutropenia foram associados com a sua utilização.

Recentemente, o efeito anti-proliferativo da decitabina possui foi testada em diferentes histotipos de tumores, tais como testicular [19], do pulmão [20], [21] da mama, células de cancro colorrectal [22], tumores do sistema nervoso central [23] e o cancro da próstata [24] – [26]. Estes resultados encorajadores indicou que decitabina pode ser eficaz na inibição da progressão do cancro e indução da diferenciação celular. Não obstante estes

in vitro

relatórios, foi enfatizada a necessidade de melhorar a estabilidade do fármaco em solução e entrega eficácia, para minimizar os efeitos colaterais tóxicos e prolongar resultados epigenéticas

in vivo

.

O potencial terapêutico notável de decitabina é, de facto, prejudicado por sua instabilidade sistêmica [27]. O seu baixo índice terapêutico ea dificuldade para calibrar concentração sanguínea estado estacionário ter afetado vários estudos clínicos.

Nos últimos anos, os sistemas de distribuição de drogas (DDSS) foram desenvolvidos para melhorar a prestação específica e localizada de agentes terapêuticos para direcionar tumor tecido, evitando efeitos secundários tóxicos graves em órgãos saudáveis ​​[28], [29]. sistemas de administração de fármacos à base de células, tais como os eritrócitos são ferramentas particularmente atractivos para entrega de várias classes de agentes terapêuticos. Os eritrócitos são portadores seguros e biocompatíveis que podem acomodar moléculas de tamanho diferente, a natureza e estabilidade e que são particularmente úteis para aqueles agentes que apresentem uma penetração limitada ou tecido são rapidamente inactivadas mediante i.v.

in vivo

administração [30] – [32]. Além disso, os eritrócitos também atuam como biorreatores circulando converter pró-drogas em suas formas ativas.

Um novo sistema de entrega de drogas à base de eritrócitos, dotado de ambos os nanopartículas super-paramagnéticas (PN) no interior das hemácias e uma glicoproteína fusog�ico , a hemaglutinina filamentosa (FHA), inseridos nas membranas citoplasmáticas de eritrócitos (Eritro-magneto-hemaglutinina virossomas, EMHVs), foi recentemente patenteado (WO2010 /070620 (A1)).

tem sido demonstrado que estes EMHV melhorou cinética de compostos terapêuticos em células alvo

in vitro

. libertação intracelular de droga eficiente é conseguido em células hospedeiras, devido à presença de glicoproteína fusogénico em membranas EMHV [33], [34].

A natureza magnética do presente sistema de libertação de droga permite EMHV para ser dirigido para os tecidos pretendidos /órgãos

in vivo

mediante a aplicação de um campo magnético externo.

Aqui nós testamos um alvo “terapia epigenética”, baseado no uso de dose baixa 5-aza-2′-dC carregado na EMHVs em dois modelos de cancro da próstata. As células humanas de adenocarcinoma de próstata LNCap, que respondem à terapia hormonal, e DU145, células hormônio refratário, têm sido utilizados [35]

in vitro

e

in vivo

em modelos de tumores xenoenxerto. Mostramos que a atividade anticancerígena farmacológica de 5-aza-2′-DC é altamente aumentada em nosso sistema de entrega EMHVs tanto

in vitro

e

in vivo

sugerindo sua possível aplicação em futuros ensaios clínicos .

Materiais e Métodos

Reagentes

nanopartículas superparamagnéticas (NPS) foram adquiridos de nano-screenMAG, Chemicell, Berlim, Alemanha. Hemaglutinina filamentosa de

Bordetella pertussis

(FHA), 5-aza-2′-deoxicytitidine (5-Aza-2′-dC), grau HPLC acetonitrilo, N ‘, N’-dimethylhexylamine (DMHA), citidina sal 5′-trifosfato dissódico (CTP) e 2′-desoxiuridina (dU) foram adquiridos da Sigma-Aldrich, Milão, Itália. O metanol e acetato de amónio foram adquiridos de Cario Erba, Milão, Itália.

EMHVs Preparação de 5-aza-2′-DC-carregados (A-EMHVs)

eritrócitos humanos foram preparados por gradiente centrifugação a 400 g durante 30 minutos e, em seguida, lavadas duas vezes em 1X PBS (NaCl 1,37, KCl 57 mM, na 54 mM

2HPO

4, KH 45 mM

2 PO?

4 pH 7,4). 2 × 10

9 eritrócitos foram lisadas em 250 ul de tampão de lise 1 (Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, MgCl 1 mM de

2 pH 7,2) durante 60 minutos a 0 ° C. A isotonicidade foi então restaurado pela adição de 130 ul de resselagem tampão (65 ul de 10X PBS pH 7,4 e 65 ul de MgCl 15 mM

2 pH 7,4), suplementado com 2 ug de FHA, 0,1 mg de 100 nm super-paramagnético NPs e 75 ^ g de 5-aza-2′-dC.

a suspensão foi incubada durante 45 minutos a 37 ° C, sob agitação suave para promover a resselagem e obter eritrócitos modificados carregados com 5-Aza-2′ dC (A-EMHVs). A-EMHVs foram então recolhidas por centrifugação a 8000 g durante 15 minutos a 4 ° C. Sucessivamente a suspensão de eritrócitos foi lavado duas vezes com 1X PBS por centrifugação a 8000 g durante 15 minutos a 4 ° C, re-suspenso em 1X PBS e conservados a 4 ° C até ser utilizado.

cultura celular

LNCap e DU145 linhas celulares de cancro da próstata foram obtidas de American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) e mantidas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% de soro Fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, na presença de 100 U /ml de penicilina-estreptomicina, a razão de divisão de 1:03 duas vezes por semana. Estas células de cancro da próstata foram utilizadas tanto para

in vitro

e

in vivo

experimentos.

Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) Análise

células DU145 em uma densidade de 1,5 x 10

5 foram semeadas em placas de microtitulação de 6 cavidades. Na parte de baixo das lamelas de vidro placas de cultura foram colocadas sobre a qual as células foram deixadas a crescer até 60-80% de confluência. Após 24 horas, o meio de cultura foi substituído com meio contendo 1,5 × 10

8 A-EMHVs. Numa amostra, meio fresco foi substituído sem a adição de EMHVs para visualizar a estrutura da célula ingénuos (controlo). Depois de 6, 24 e 48 horas de incubação, lamelas foram recuperados e as células foram lavadas em tampão 1X PBS e fixadas com paraformaldeído a 4%. núcleos celulares foram contra-coradas com DAPI, lavou-se com 1X PBS e toda a lamela está montado sobre uma corrediça utilizando meio anti-desvanecimento. imagens de fluorescência e brilhante em campo foram capturados por CSLM, Leica TCS SP5 sistema de microscópio invertido, equipado com fontes emissoras do UV ao visível. DAPI fluorescência foi detectada utilizando excitação a 405 nm e gravação de emissão a 454 nm, enquanto a fluorescência vermelha dos PN super-paramagnéticas estava animado em 543 nm e sua emissão foi detectado em 613 nm.

Espectrometria

Líquido cromatografia de massa ( a análise por HPLC-MS) de 5-aza-2′-dC carregado na EMHVs

Para quantificar a quantidade total de 5-aza-2′-dC no interior dos eritrócitos modificados, 2 × 10

9 recentemente preparou-se uma-EMHVs foram lisadas em 200 ul de tampão de lise 2 (155 NH mM

4Cl, KHCO 10 mM

3, 0,1 mM de EDTA, pH 7,2) durante 10 minutos à temperatura ambiente e depois centrifugada a 12000 g durante 15 minutos a 4 ° C. O sobrenadante foi transferido para um dispositivo de filtro Microcon centrífuga com MWCO 30000 Da (Amicon YM-10, Millipore, Vimodrone MI, Itália) e em seguida centrifugou-se a 14.000 g durante 2 horas a 4 ° C. As amostras filtradas foram mantidos a -80 ° C até à análise. O sistema de HPLC utilizado foi um Dionex 3000 final série LC (Sunnyvale, CA, EUA), ligado a um espectrómetro de armadilha de iões linear LTQ-Orbitrap massa (Thermo Fisher Scientific, EUA), equipado com uma fonte iónica de electrospray. Os dados foram adquiridos e processados ​​com Excalibur 2,1 software. Os compostos foram separados numa coluna Mediterranea Sea18 de fase reversa (150 mm, D.I. 2,1 milímetros e tamanho de partícula de 5 um) a partir de Teknokroma (Analytical Tecnologia S.r.l., Brugherio Milão, Itália). A coluna foi ajustada a um caudal de 0,25 ml /minuto, a uma temperatura de 36 ° C, e os volumes de amostra de 10 ul foi injectado. A fase móvel consistiu em acetato de amónio 5 mM (solvente A) e acetonitrilo (solvente B). Os primeiros 13 minutos foram um ciclo isocrático com solvente A; entre 13 e 20 minutos, a percentagem de fase B móvel foi aumentada para 35%, mantido durante 2 minutos e, em seguida, a fase móvel inicial foi re-estabelecido dentro de 2 minutos. O espectrómetro de massa foi operado em modo de electrospray positivo e a energia de colisão era de 35 eV. As transições foram monitorados m /z 229 — 113 para 5-aza-2′-dC; m /z 219 — 103 para derivados guanylurea; m /z 247 — 131 para formuladas derivados de 5-aza-2′-DC. Para procurar possíveis formas fosforiladas de 5-aza-2′-DC, 2 × 10

9 preparadas de fresco A-EMHVs foram deixados a 37 ° C durante 24 horas. Sucessivamente, as amostras foram lisadas e filtrada como descrito acima e 400 ng de CTP foram adicionados às amostras como padrões internos. A fase móvel consistiu em 20 DMHA mM, pH 7,0 (solvente A) e metanol-água 80:20 (solvente B). Os primeiros 12 minutos foram um ciclo isocrático com 10% de solvente B; entre 12 e 15 minutos, a percentagem de fase B móvel foi aumentada para 80%, mantido durante 1 minuto e, em seguida, a fase móvel inicial foi re-estabelecido dentro de 2 minutos. O espectrómetro de massa foi operado em modo de electrospray negativo e a energia de colisão era de 15 eV. As transições monitorados foram m /z 482 — 384 para CTP; m /z 467 — 369 para 5-aza-2′-dC trifosfato; m /z 387 — 289 para 5-aza-2′-dC difosfato; m /z 307 — 208 para 5-aza-2′-dC monofosfato correspondente à eliminação de uma molécula neutra de H

3PO

4. Para a curva de calibração, foram utilizados seis soluções-padrão CTP diferentes. A relação de amostra /CTP área do pico foi utilizada para a quantização.

citometria de fluxo (FACS)

células LNCaP e DU145, a uma densidade de 1,5 x 10

5 foram semeadas em 6- bem placas de microtitulação para ensaios de ciclo celular. Após 24 horas, o meio de cultura foi substituído com meio contendo: nenhum fármaco (CTRL); livre 5-Aza-2′-dC em doses de 6,8 ug ou 120 ng; 1,5 × 10

8 A-EMHVs (contendo aproximadamente 120 ng de 5-aza-2′-dC).

Após 24, 48 e 96 horas de incubação, as células tratadas e de controlo foram colhidas e analisadas por FACS. Os núcleos foram coradas com 10 ug /mL de iodeto de propídio (PI) em solução hipotónica (1X PBS contendo 0,1% de citrato de sódio e 0,1% de Triton X-100) durante 30 minutos a 4 ° C no escuro, durante a avaliação de fases do ciclo celular.

apoptóticos foram detectados pelo teste de anexina V (BioVision). As células tratadas e não tratadas foram suspensos em tamp de ligao 1X e incubadas à temperatura ambiente durante 15 minutos com Anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI) foi adicionado para coloração de núcleos de acordo com as instruções do fabricante.

citometria de fluxo foi realizada usando Becton-Dickinson FACScan CentroII e os dados foram analisados ​​por software FlowJo.

Animais

para os experimentos realizados no biotério da Universidade de Marshall, BALB /c atímicos congênitas, homozigotos para

nu

/

nu

alelo, foram criados em casa. A colónia de ratos machos com 8 a 12 semanas de idade, foi desenvolvido a partir de reprodutores obtidos de Charles Rivers Laboratories (Wilmington, MA). Estes animais foram utilizados em experimentos LNCap de xenotransplante.

animais utilizados no experimento realizado no biotério “Toscana Ciências da Vida” foram atímicos Nude-Foxn1

nu

camundongos machos, 6 semanas de idade, comprado de Harlan Laboratories (Udine, Itália). Estes animais foram utilizados em xenoenxertos DU145.

Em ambos os casos, os animais foram alojados em micro-isoladores em gaiolas autoclavadas com tampas de filtro de fibra de poliéster, sob condições livres de germes. Todos os alimentos, água e roupas foram esterilizados e os animais foram mantidos em uma temperatura ambiente de 23 ± 2 ° C em salas de ter um ciclo de 12 horas de luz /escuridão.

Imagem

X-ray

atímicos BALB /c ratinhos nus foram injectados com 1,5 x 10

8 EMHVs suspenso em 150 ul de PBS 1X.

Após a injecção na veia da cauda EMHVs, um grupo de animais foram expostos a um campo magnético externo, colocando dois ímans de terra na região abdominal lateral inferior durante 30 minutos (EMHVs-MF), enquanto que os ratinhos foram mantidos sob anestesia de isofluorano a 2%. ímãs Neodinium (em forma redonda 5.0 mm) com uma força de aproximadamente coerciva de 1.000 KOersted, foram utilizados. Um grupo de ratinhos de controlo foi injectado na veia da cauda com EMHVs como descrito anteriormente, mas nenhum campo magnético externo foi aplicado (EMHVs-NMF). Uma hora após o tratamento, os ratinhos foram sacrificados por CO

2 asfixia e a acumulação de grânulos ferrosos foi avaliado por imagem de raios-X. A análise de imagens foi realizada utilizando um sistema de radiografia Philips DigitalDiagnost direta digital com tecnologia de detecção plana (Philips, Hamburgo, Alemanha) com uma dose de 60 kVp em 5 mAs.

procedimentos xenoenxerto de tumor

Ambos atímicos BALB /c nu e nu-Foxn1

nu

ratos foram anestesiados com 2,5% de isoflurano durante a manipulação

a configuração dos modelos:. células LNCaP ou DU145 foram concentradas até 7 × 10

6 ou 4,5 × 10

6 respectivamente em 1X PBS e injectadas por via subcutânea com 01:01 matriz da membrana basal MatrigelTM (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) no flanco esquerdo de cada murganho (volume total de 200 uL). Uma vez xenotransplantes começou a crescer, seus tamanhos (mm

3) foram medidos duas vezes por semana com paquímetro digital e o volume foi calculado utilizando a fórmula padrão: comprimento x largura

2/2. xenoenxertos de tumor foram deixadas a crescer até cerca de 100 mm

3 e este volume foi seleccionado como a fase inicial para iniciar o tratamento. Os murganhos foram distribuídos aleatoriamente (n = 6), anestesiados e preparados para injecção na veia da cauda com o tratamento seleccionado. Antes de cada injecção, os tumores foram medidos e comparados com os volumes iniciais correspondentes, a fim de normalizar os dados (X = 100 x volume de

1 /volume

0). Randomização: Ratos foram divididos em sete grupos diferentes em ambas as configurações experimentais (LNCap ou DU145 xenotransplantes) e eles foram tratados como segue: 1X PBS (CTRL); 85 ug 5-Aza-2′-dC (2,5 mg /kg) (A1); 120 ng de 5-aza-2′-dC (A2); 1,5 × 10

8 EMHVs descarregadas na ausência de um campo magnético estático (EMHVs-NMF); 1,5 × 10

8 EMHVs descarregadas e campo magnético estático aplicado no tumor (EMHVs-MF); 1,5 × 10

8 EMHVs contendo 120 ng de 5-aza-2′-dC (A-EMHVs-FNM); 1,5 × 10

8 EMHVs contendo 120 ng de 5-aza-2′-DC e um campo magnético estático aplicado no tumor (A-EMHVs-MF)

protocolo de injecção:. Os ratinhos foram administrados por via intravenosa a cada duas semanas com 150 ul tratamento por inoculação, durante 3 semanas. Após cada injecção nesses grupos seleccionados a ser tratado também com o campo magnético estático (EMHVs-MF e A-EMHVs-MF), dois ímans de terra (1000 KOersted) foram aplicados à massa de xenoenxerto durante 30 minutos para assegurar a acumulação intra-tumoral. Os ratinhos foram então deixadas a recuperar e monitorizados para sinais de aflição. No final do ciclo de tratamento, ou quando o volume do tumor atingiu aproximadamente 400 milímetros

3, os ratinhos foram sacrificados por CO

2 asfixia e a massa de tumor da próstata, fígado, rins foram recolhidos e armazenados a -80 ° C até análise adicional.

a análise morfológica e imuno-histoquímica de xenotransplantes tumorais

As amostras congeladas armazenadas a -80 ° C foram equilibrar a -20 ° C durante a noite antes de seccionamento por criostato (Microm HM 500 W) após a incorporação em outubro

criocortes série consecutivos de 5-6 uM espessura foram obtidos a partir da porção média (maior) de cada uma das amostras, colocadas em lâminas de carga positiva, secou-se ao ar durante alguns minutos e em seguida fixadas com acetona fria . Duas e quatro secções foram coradas com hematoxilina de Mayer, para exame histopatológico.

Após lavagem em 1X PBS e incubação em H

2O

2, à temperatura ambiente para bloquear a peroxidase endógena, a secção foram incubadas com diluída soro normal de bloqueio preparado a partir de espécies em que se faz o anticorpo secundário. As lâminas foram incubadas em câmara húmida durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários humanos reactivos para Ki67 (SP6, o clone de anticorpo monoclonal de coelho, Thermoscientific) a uma diluição 1:200 e DNMT3B (52A1018 clone, o anticorpo monoclonal de ratinho, IMGENEX) na diluição de 1 :150. Após 30 min de anticorpo secundário biotinilado e 30 min Vectastain Elite ABC reagente As lâminas foram então incubação com solução de substrato de peroxidase (DAB). As lâminas foram contrastadas com hematoxilina de Mayer durante 1 minuto, e montados em solução aquosa de montagem rápida (Bioptica). O exame microscópico foi realizada de 2x a 40x com microscópio de luz Olympus BX43 interface com uma câmera de vídeo para a aquisição digital e análise de imagens (DP20 Olympus). Os valores de DNMT3B e Ki67 núcleos positivos foram expressos como percentagem de células positivas ou negativas através da contagem de pelo menos 500 células totais com ampliação de 20x originais.

A análise estatística

As fases do ciclo celular são expressos como média ± SD de, pelo menos, n = 3. Três-maneiras ANOVA foram aplicados para comparar o efeito de diferentes tratamentos (CTRL, 6,8 ug 5-Aza-2′-dC; 120 ng de 5-aza-2′-dC; 1,5 × 10

8 a-EMHVs) em diferentes fases do ciclo celular (sub G1, G0-G1, S, foi utilizada G2-M) e ANOVA unidirecional para comparar o efeito de um-EMHVs tratamento em pontos de tempo seleccionados (24 , 48 e 96 horas).

As células em apoptose foram expressos como média ± SEM de, pelo menos, n = 3. a análise estatística foi realizada com One-Way ANOVA independentemente para precoce e tardia apoptose em dados de log transformados para melhorar normalização. comparações de pares foram testados utilizando critério de diferença honestamente significante de Tukey.

O

in vivo

resultados são expressos como média ± SEM de n = 6. One-Way ANOVA foi aplicado para comparar a redução da massa tumoral na avaliação do implante xenoenxerto após o tratamento seleccionado utilizando dados recolhidos a última injecção. Para a taxa de redução da massa tumoral (50%) em camundongos tratamentos após selecionados, análise de Kaplan-Meier foi aplicado, seguido pelo teste log-rank.

declarações de Ética

glóbulos vermelhos humanos foram obtidos a partir de sacos de transfusão coletados de doadores voluntários saudáveis ​​anónimos, que tenham dado o seu consentimento informado por escrito efectuada em conformidade com a legislação do Governo italiano. Não foi necessária a aprovação de um conselho de revisão institucional (comitê de ética), pois nenhuma participação humana direta nem envolvimento de estudos em humanos foram previstos neste trabalho. As amostras foram fornecidas por Azienda Ospedaliera Universitaria Senese.

O estudo pré-clínico foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório das diretrizes internacionais sobre o manejo de animais de laboratório e aplicando 3Rs às experiências (de acordo com o NIH e recomendações da Comissão Europeia)

os protocolos para Experimentação animal, foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Marshall (Huntington, WV, EUA) (número de autorização:. # 458 /2010) e pelos Comitês de Ética das Ciências da Vida e Toscana Istituto Superiore di Sanità (ISS) em nome do Ministro da Saúde italiano (Permit Number: # CNR-270111 exp1 /PROT1). Bem-estar animal foi monitorada de acordo com Langford et al, 2010. [36] “

Resultados

Caracterização de formulação anticancerígena romance em sistema de entrega de drogas à base de eritrócitos

Para melhorar o perfil de 5-aza-2′-dC pró-droga desempenho, no que diz respeito à estabilidade química, farmacocinética e farmacodinâmica, engenharia eritrócitos portadores magnéticos (EMHVs) foram usadas como sistema de administração de fármaco (DDS). as cinéticas de EMHV DDS internalização e sua toxicidade, bem como a eficiência e eficácia deste romance anticancerígenos formulação 5-aza-2′-dC foram testados em primeiro lugar

in vitro

do hormônio sensível (LNCap) e células cancerosas da próstata resistentes (DU145).

a internalização da transportadora EMHVs na célula tumoral

in vitro

.

a cinética da EMHVs internalização em ambas as células de câncer de próstata LNCap e DU145 foi confirmada por análise confocal Laser Scanning Microscopy ( CSLM) por controlo da distribuição das NPs fluorescentes libertados (verde) para o citoplasma de células alvo (Fig. 1). Um exemplo de células naive DU145 é mostrado na Fig. 1A. Internalização já está ocorrendo em 6 horas após o tratamento, quando EMHVs foram encontrados dentro do citoplasma das células DU145. Nesta fase EMHVs ainda conservam sua membrana intacta e seu conteúdo de PN (Fig. 1B). À semelhança do que encontrado no nosso trabalho anterior [33], após a internalização da membrana EMHV funde com a membrana da célula hospedeira libertando o conteúdo fluorescente em todo o espaço citoplasmático (Fig. 1C-E). Nos últimos pontos de tempo (48-96 horas) uma grande disseminação de fluorescência NPS é detectável no citoplasma de células hospedeiras, embora parecem morfologicamente saudáveis ​​e nenhum efeito citotóxico é visível (Fig. 1D-E).

Representante CLSM EMHVs imagens de internalização e de distribuição de nanopartículas libertado (sinal de fluorescência verde, B-e) para o citoplasma da célula hospedeira em vários pontos de tempo são descritos. As células naive (A) são apresentados como controlo. Em (B), após 6 horas de tratamento, uma EMHV intacta está presente no citoplasma (seta). Às 24 horas (C) as partículas parecem ter sido libertada das EMHVs. Nas fotos tiradas em 48 (D) e 96 (E) horas, as nanopartículas parecem ter distribuída homogeneamente por todo o citoplasma. A falta de efeito tóxico de eritrócitos tratamento sistema de entrega de droga foi avaliada por análise de FACS (F), onde o perfil de células de células tratadas (EMHVs) em pontos de tempo seleccionados mostram nenhuma mudança significativa nas distribuições de sub-fase em relação ao controlo (CTRL).

Falta de toxicidade dos portadores EMHV em modelos celulares.

A toxicidade do EMHV DDS contra células hospedeiras foi avaliada através da análise de fases do ciclo celular de células alvo. Quando tratados com EMHVs sem carga durante 48 e 96 horas, sem mudança na distribuição de fases de células DU145 e LNCap foi detectável e as células mantiveram a sua ciclo celular normal para o período de duração do tratamento (Fig. 1F). Esta descoberta sugere que EMHVs sistema de entrega de droga não exerce qualquer efeito tóxico em células de câncer por si só.

Estabilidade química de 5-Aza-2′-dC no sistema biorreator EMHV (A-EMHVs).

5-Aza-2′-dC é um pró-fármaco e que necessita de ser activado por fosforilação de um trifosfato de nucleósido antes de exercer sobre a inibição de metilação de ADN [37].

recentemente, tem sido mostrado que eritrócitos actuar como biorreactores devido aos seus sistemas enzimáticos [34]. Isto torna-os adequados para encapsulação de pró-fármacos que serão posteriormente transformadas na droga activa [38]. Carregando 5-Aza-2′-dC pró-droga para o sistema de biorreactor EMHV foi conseguido de acordo com um protocolo normalizado (ver materiais e métodos). HPLC-MS foi utilizada para quantificar a quantidade total de droga no interior do DDS (A-EMHVs) e para detectar a presença das suas formas fosforiladas activas. O cromatograma de amostras incubadas durante 24 horas a 37 ° C em destaque uma mistura de diferentes formas fosforiladas de 5-Aza2′-dC (Fig. 2). Di- e formas tri-fosfato de 5-fosforilado eluir Aza2′-dC, à TA e RT 16,6 16,5, respectivamente (Fig. 2B e 2C). Figura 2D mostra o pico de thriphosphate citidina (CTP; RT: 16.5), um padrão interno que adicionamos aos nossos amostras como controle. Afigura-se que a forma de tri-fosfato de 5-Aza2′-dC overbears as outras formas fosforiladas que provam a eficiência elevada de EMHVs como biorreactores. Descobrimos que 1,5 × 10

8 A-EMHVs acomoda cerca de 120 ng de fármaco total e que as formas fosforiladas activas de 5-aza-2′-dC representa o 50% do fármaco carregado no total de A-EMHVs.

cromatogramas de (A) para a 5-Aza-2′-dC mono-fosfato; (B) di-fosfato (RT: 16,6); (C) tri-fosfato (RT: 16.5) e (D) interna padrão CTP (RT: 16,5).

A actividade anti proliferativa da A-EMHVs

in vitro

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o efeito anti-proliferativo de a-EMHV na indução da paragem do ciclo celular e apoptose foi testado em ambos os modelos de cancro da próstata: hormona sensível células LNCaP e a linha celular DU145 de androgénio independente cancro da próstata em que abordagens terapêuticas tradicionais são dificultadas pela falta de capacidade de resposta à terapia hormonal e expressão do antigénio PSA na membrana celular.

o efeito de 1,5 × 10

8 tratamento a-EMHVs, contendo aproximadamente 120 ng interno 5-Aza2′-dC, tem sido comparada com a da livre 5-Aza-2′-CC, utilizados na dose de 2,5 uM (total de 6,8 ug) escalonado para baixo a partir da dose terapêutica usados ​​em clínicas. Também comparamos o efeito da mesma quantidade de 5-aza-2′-dC contido dentro da A-EMHVs (120 ng) usada solução de fármaco livre.

Em células LNCaP responsivos hormonais (Fig. 3A) , o tratamento de a-EMHVs induziu um enriquecimento significativo em sub G1 sugerindo uma possível activação de resposta apoptótica (Fig. 3A). Esta mudança já era detectável em 48 horas após o tratamento (3A do painel central Fig.) E atingiu significância estatística às 96 horas (ANOVA p 0,05). Um deslocamento semelhante para distribuição sub G1 foi obtido também usando 6,8 ug de livre 5-Aza-2′-dC (ANOVA P 0,05), no entanto, esta dose é mais de 50 vezes mais elevada do que a 5-Aza-2′-dC carregado na a-EMHVs. Além disso, o efeito de 6,8 ug livre tratamento com 5-Aza-2′-dC parece ter um aparecimento mais tardio comparando a A-EMHVs. Isto é provavelmente devido ao facto de que a 5-Aza-2′-DC, encapsulado no EMHVs é facilmente transformado em formas fosforiladas melhorando a 5-Aza-2′-DC farmacocinética /farmacodinâmica. Nomeadamente baixas doses de livre 5-Aza-2′-dC (120 ng) não exerceu efeito sub deslocamento G1 e o perfil de distribuição do ciclo celular não diferiu dos controlos de até 96 horas.

1,5 × 10

8 tratamento a-EMHVs, contendo 120 ng interno 5-Aza-2′-dC, foi comparado com 6,8 ug livre 5-Aza-2′-dC e 120 ng tratamentos livres 5-Aza-2′-dC a 24 96 (em baixo) horas (parte superior) 48 (meio). células não tratadas foram utilizados como controle (CTRL). Em ambos os LNCap (A) e DU145 (B) As linhas celulares, A-EMHVs tratamento induziu um enriquecimento significativo na distribuição celular G1 sub (barras pretas) já detectável a 48 horas após o tratamento (A e painel do meio B, respectivamente) que durar até a 96 horas (ANOVA * p 0,05). mudança semelhante para distribuição sub G1 foi também obtido usando 6,8 ug de livre 5-Aza-2′-dC (§ANOVA p 0,05), mas apenas detectada às 96 horas. Nenhuma mudança na distribuição do ciclo celular foi detectado gratuitamente 120 ng 5-aza-2′-DC, não diferindo dos controles.

Uma tendência semelhante no sentido de fase sub G1 foi descrito em hormona linha de células DU145 resistente