Abstract

O mTOR (alvo da rapamicina em mamíferos) via de transdução de sinal integra vários sinais, regulando biogénese ribossoma e a síntese de proteínas, como uma função de energia e aminoácidos disponíveis, e assegurando um adequado acoplamento da proliferação celular com os aumentos no tamanho da célula. Além disso, evidências recentes têm apontado para uma interação entre os mTOR e p53 vias. Foi investigada a variabilidade genética dos 67 genes-chave da via mTOR e nos genes da via da p53 que interagem com mTOR. Foi testada a associação de 1.084 SNPs marcação com o risco de câncer de próstata em um estudo de 815 casos de câncer de próstata e 1.266 controles aninhados dentro da Investigação Prospectiva Europeia sobre Câncer e Nutrição (EPIC). Nós escolhemos o SNPs (n = 11) com a associação mais forte com o risco (p 0,01) e procurou replicar sua associação, em uma série adicional de 838 casos de câncer de próstata e 943 controles de EPIC. Na análise conjunta das primeira e segunda fases dois SNPs do

PRKCI

gene mostrou uma associação com o risco de câncer de próstata (OR

CI alelo = 0,85, 95% ,78-,94, p = 1,3 × 10

-3 para rs546950 e OR

alelo = 0,84, 95% CI 0,76-0,93, p = 5,6 × 10

-4 de rs4955720). Nós confirmamos isso em uma meta-análise usando a replicação definir os dados a partir da segunda fase do nosso estudo, em conjunto com a primeira fase dos marcadores de câncer genéticas de susceptibilidade projeto (MEGC). Em conclusão, encontramos uma associação com o risco de câncer de próstata para dois SNPs pertencente a

PRKCI

, um gene que é frequentemente sobre-expressos em várias neoplasias, incluindo cancro da próstata

Citation:. Campa D, Hüsing A, Stein A, Dostal L, de Boeing H, Pischon T, et al. (2011) variabilidade genética da via mTOR e Prostate Cancer Risk na Investigação Prospectiva Europeia sobre o Câncer (EPIC). PLoS ONE 6 (2): e16914. doi: 10.1371 /journal.pone.0016914

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de outubro de 2010; Aceito: 01 de janeiro de 2011; Publicado: February 23, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Campa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Resultados específicos deste estudo foram obtidos com o apoio financeiro do US Army Medical Research e Comando de material (W81XWH-05-1-0156). https://cdmrp.army.mil/pcrp/default.shtml. O estudo EPIC foi financiado pelo Programa “A Europa Contra o Cancro” da Comissão Europeia (SANCO); Ligue contre le Cancer (França); Société 3M (França); Mutuelle Générale de l’Education Nationale; Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); Aid alemão do cancro; German Cancer Research Center; Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa; Dinamarquês Cancer Society; Fundo de Pesquisa em Saúde (FIS), do Ministério da Saúde espanhol; a governos regionais e as instituições da Espanha participante; Cancer Research UK; Medical Research Council, do Reino Unido; Ministério da Saúde da Grécia e da Solidariedade Social; a Fundação Niarchos Stavros ea Fundação Helénica da Saúde; Associação Italiana de Investigação do Cancro; Italian National Research Council; Ministério Holandês de Saúde Pública, Bem-Estar e Esportes (VWS), Ministério da Saúde holandês, Países Baixos Cancer Registry (NKR), fundos de pesquisa LK, fundos de prevenção Holandês, Holandês ZON (Zorg Onderzoek Nederland), World Cancer Research Fund (WCRF) (The Países Baixos); Estatísticas Holanda; Cancer Society sueco; Conselho Científico da Suécia; Governo Regional de Skane, Suécia; Cancer Society norueguês. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

dentro do tecido da próstata, os efeitos promotores de tumor de hormonas endógenas e factores de crescimento são pensados ​​para ser associada com a estimulação do crescimento celular e a mitose, e a inibição da apoptose. Além de sinalização por IGF-I (mas também a insulina e outros factores de crescimento), o crescimento e proliferação de células são co-determinada pela quantidade de energia e aminoácidos essenciais disponíveis para a célula [1], [2],.

os estudos recentes mostraram que a mTOR (alvo da rapamicina em mamíferos) via de transdução de sinal integra estes vários sinais, regulando biogénese ribossoma e a síntese de proteínas, como uma função de energia e aminoácidos disponíveis, e assegurando um acoplamento adequado de celular proliferação com aumentos no tamanho das células [1], [2]. A via mTOR é regulado através de uma cascata de reacções de fosforilação enzimática através quinase fosfatidil-inositol-trifosfato (PI3K) /proteína quinase B (PKB-AKT1), atípica proteína quinase C (aPKC), AMP-activated protein quinase (AMPK), hamartina /tuberina (codificados, respectivamente, por o complexo esclerose tuberosa-1 (

TSC1) e 2 (

TSC2) genes), ras-homólogo enriquecido no cérebro (Rheb), a proteína reguladora associada com mTOR (ave de rapina), e alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR). activação de mTOR, por sua vez leva à fosforilação de elementos a jusante que controlam directamente biogénese ribossoma e tradução do mRNA ao ribossoma para a síntese proteica [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]. Figura Suplementar S1 mostra um esquema simplificado da via mTOR

Este percurso inclui vários proto-oncogenes estabelecidos (

PI3K, AKT1

) e genes supressores de tumor (

PTEN

. – o que reduz a atividade da mTOR através da inibição da

PI3K /AKT1 – TSC1, TSC2

). Estes genes são frequentemente mutado ou expressas de forma aberrante em tumores humanos, incluindo tumores da próstata [9], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23].

Além disso, evidências recentes têm apontado para uma interessante interação entre as mTOR e p53 vias (revisado por Levine et al., 2006) [24]. Existem dois principais ligações entre estas vias, levando a resposta alterada ao estresse sinais após a activação de p53, através da activação de AMPK, TSC2 e uma fosfatase p53, composto por uma subunidade alfa-4 e a subunidade catalítica de PP2A.

Colocámos a hipótese de que os genes da via mTOR e genes da via de p53 que se relacionam directamente com mTOR pode estar implicado centralmente na carcinogénese da próstata, e que os alelos polimórficos destes genes podem modificar a sua expressão ou a actividade, e assim conferir susceptibilidade alterada cancro da próstata. SNPs nos genes pertencentes à via mTOR já foram estudados em relação ao risco de câncer, com alguns resultados promissores [25], [26], [27].

Neste relatório nós investigamos a variabilidade genética de 67 genes-chave nas vias mencionadas acima. Foi testada a associação de 1.084 SNPs marcação com o risco de câncer de próstata em um estudo de caso-controle aninhada dentro da Investigação Prospectiva Europeia sobre Câncer e Nutrição (EPIC). Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório sobre os polimorfismos destes genes de risco e câncer de próstata.

Resultados

características Resumo das populações estudadas estão apresentados na tabela 1. Na primeira fase deste estudo analisamos 1,084 SNPs em 67 genes envolvidos na via mTOR (conforme resumido na tabela S1 suplementar) em 815 casos de cancro da próstata e 1.266 controles pareados. Nós replicado os melhores hits em uma população independente composto de 838 casos de câncer de próstata e 943 controles pareados.

taxas de Genotipagem de sucesso e de controle de qualidade

Tivemos 1.163 SNPs sobre a nossa gama GoldenGate, dos quais 30 foram incluídos como controlos de qualidade e 1133 eram nas regiões do gene candidato de interesse neste estudo. Trinta e quatro SNPs foram retiradas porque eles tinham uma taxa de chamada inferior a 75%, o que é normalmente indicativo de má qualidade genotipagem. Onze SNPs (1% do total) mostraram forte de saída do equilíbrio de Hardy-Weinberg (p 10

-5) e, assim, não foram ainda analisados. Quatro SNPs eram monomorphic nesta população. Isso deixou um total de 1.084 SNPs (96% dos selecionados inicialmente) nos genes candidatos 67 para serem analisados ​​

A taxa média de chamada dos 1.084 SNPs usados ​​para a análise estatística foi de 99,8% (intervalo de 85,2%. – 100%).

Trinta SNPs foram incluídos, que tinha sido previamente genotipados nas mesmas amostras no âmbito de um estudo diferente. A concordância dos novos genótipos com os antigos genótipos foi de 100%.

Nós inicialmente incluídos 2.099 amostras, e depois de retirar amostras de indivíduos com uma taxa de chamadas inferior a 75% (n = 39), tivemos um conjunto de dados, incluindo 815 casos de câncer de próstata e 1.239 controles. A amostragem densidade de incidência levou para duplicar a seleção de 27 controles para que 1.266 controles foram incluídos nas análises condicionais.

amostras duplicadas aleatório (~ 5%) também foram incluídos e a concordância de seus genótipos foi de 100,0%.

Principais efeitos de SNPs genotipados

Onze SNPs foram significativamente associados com o risco de câncer de próstata, em um limite de p 0,01 (p

tendência 0,01 ou p

2DF 0,01) ( rs520820 em

GADD45A

; rs546950 e rs4955720 no

PRKCI

; rs706711, rs13156223 e rs831123 em

PIK3R1

; rs6797860 no

TP63

; rs11763144 em

PRKAG2

; rs388372 em

RPS6KA2

; rs13337626 em

TSC2

; rs3783501 em

GADD45B

). quadro suplementar S2 mostra os resultados detalhados para todos os 1.084 SNPs.

Replication

Foram genotipados os onze SNPs da primeira fase em um conjunto adicional de 838 casos de câncer de próstata e 943 controles pareados. Na segunda fase rs546950 SNP no

PRKCI

gene mostrou uma associação estatisticamente significativa com o risco de câncer de próstata, no limiar convencional de p . 0,05 (p

2DF = 0,02)

quando analisamos em conjunto os resultados dos dois conjuntos de amostras, tanto

PRKCI

SNPs mostrou uma associação com o risco (OR

alelo = 0,84, 95% CI = 0,76-0,93, p

2DF = 0,0028 , p

tendência = 0,0007 para rs4955720; OR

alelo = 0,86, 95% CI = 0,78-0,95, p

2DF = 0,0014, p

tendência = 0,0020 para rs546950). Resultados para a primeira fase, o conjunto de replicação e para a análise conjunta são mostrados na tabela 2.

Foram calculados M

valores FEP para cada gene candidato separadamente e para todo o estudo (com a adição o gene indivíduo M

valores FEP; detalhes são mostrados na S3 complementar tabela). A ampla da via M

FEP foi 849. Nós, portanto, utilizado um significado p-limite em todo o estudo de 0,05 /849 = 5,9 × 10

-5. Usando este limite, nenhuma associação significativa (p

tendência 5.9.x10

-5 ou p

2DF 5,9 ×

-5 10) foram observadas entre qualquer dos polimorfismos genotipados e câncer geral da próstata risco.

os dois SNPs em

PRKCI

também foram genotipados no contexto dos marcadores de câncer de susceptibilidade genética (MEGC) projeto (https://cgems.cancer.gov/), um dos primeiros estudos de associação do genoma na suscetibilidade ao câncer de próstata. As associações observadas na primeira fase de MEGC (OU

alelo = 0,85 p

tendência = 0,0024 para rs4955720, OU

alelo = 0,94 p

tendência = 0,089 para rs546950) foram semelhantes aos observados em do presente relatório. Em uma meta-análise usando o incondicional OU-estimativa a partir dos dados da segunda fase do nosso estudo em conjunto com os resultados de MEGC, os dois SNPs mostraram resultados muito semelhantes aos obtidos com os dados EPIC sozinho (ou

alelo = 0,91 , 95% CI 0,83-0,99, p = 0,029 para rs546950 e OR

alelo = CI 0,87, 95% 0,79-,95, p = 0,002 para rs4955720). Uma meta-análise realizada considerando os dados conjuntos da primeira e da segunda fase do nosso estudo com os resultados de MEGC mostrou essencialmente os mesmos resultados (OR

alelo = 0,91, 95% CI 0,84-0,98, p = 0,019 para rs546950 e OR

alelo = 0,85, 95% CI 0,78-0,92, p = 0,00016 para rs4955720).

Efeitos de SNPs genotipados em subgrupos de doença agressividade

Foram analisadas associações de SNPs com câncer de próstata risco através do agrupamento dos casos de acordo com a agressividade da doença, mas não observamos estatisticamente significativa (p 0,05) heterogeneidade entre os estratos. Resultados para as onze SNPs que foram genotipados no conjunto de dados completo são mostrados na S4 complementar mesa

Discussão

A via mTOR está envolvida no desenvolvimento do tumor, e análogos de rapamicina -. Um antibiótico natural que interfere especificamente com a ação mTOR (através de uma proteína receptora adicional) – estão mostrando uma grande promessa como agentes terapêuticos potenciais para o tratamento de certos tipos de tumores sólidos [28], [29], [30]. Trabalhamos com a hipótese de que os genes pertencentes à via mTOR pode estar implicado central no desenvolvimento do câncer, incluindo câncer de próstata, e que os alelos polimórficos destes genes podem afetar o risco de câncer de próstata.

Neste estudo, nós absolutamente capturado variação genética comum através de 67 genes na via mTOR e ao nosso conhecimento, esta é a avaliação mais abrangente de variação comum e codificação nos genes da via mTOR em relação ao risco de câncer de próstata. Encontramos uma associação de dois SNPs no

PRKCI

gene, rs546950 e rs4955720, com uma diminuição do risco de câncer de próstata. O primeiro SNP mostrou uma associação na primeira triagem, em um conjunto de replicação e em uma meta-análise da nossa segunda fase com dados do MEGC, enquanto rs4955720 mostrou uma associação única no conjunto de triagem e na meta-análise. Uma vez que os dois SNPs foram selecionados como marcação de SNPs que eles não estão em forte LD, no entanto, não podemos excluir que pudessem refletir o mesmo sinal devido a um LD subjacente moderada (r

2 entre os dois SNPs é 0,53).

Um papel da variação genética no

PRKCI

gene na etiologia do câncer de próstata é dada plausível que a proteína quinase C atípica lambda /iota (aPKCλ /ι), codificada pelo

PRKCI

gene , é um C isozima proteína quinase, a qual desempenha um papel multifuncional na manutenção e crescimento de células epiteliais [31] celular, [32], [33], [34], [35], [36], [37]. Uma das funções fisiológicas do aPKCλ /ι é mediar aumentos induzidos por insulina no transporte da glucose. A insulina regula o transporte de glucose através de fosfatidil-inositol-trifosfato-quinase (PI3K). efectores distais de PI3K incluem proteína quinase B (PKB /Akt) e aPKC isoformas ζ e λ /ι [38].

isozimas PKC também estão envolvidos na proliferação celular, sobrevivência, diferenciação e apoptose. Estudos sobre pulmão, ovário, cólon e cânceres de mama têm demonstrado uma relação entre a progressão expressão e câncer /ι aPKCλ e sugerem que aPKCλ /ι expressão pode prever pobres sobrevivência [21], [22], [23], [39], [40], [41], [42], [43]. Há vários relatórios que mostram expressão aumentada aPKCλ /ι em tecidos de câncer de próstata humanas, mas a relação entre aPKCλ /ι e progressão do câncer de próstata ainda não está claro [44], [45]. Além disso experimentos utilizando a linha de células de câncer de próstata DU145 revelou que aPKCλ /ι está envolvido no crescimento do câncer de próstata, tanto

in vivo

e

in vitro

[46]. A sobre-expressão de aPKCλ /ι pode ser explicado com uma amplificação de o

PRCKI

gene, que tem sido relatada em pulmão e do cancro do ovário [22], [23], [39] ou a amplificação do cromossoma incluindo o 3q

gene PRCKI

que tem sido relatada em linhas celulares de cancro da próstata [47]. Outra possibilidade é que aPKCλ /expressão ι é sobre-regulada por meio da ativação da transcrição do

PRCKI

promotor [48].

Neste relatório, nós descobriram que duas variantes alélicas do

PRKCI

gene foram associados a um nível significativo estudo-wise com uma diminuição do risco de câncer de próstata. rs546950 e rs4955720 não está situado na região codificadora do gene, e não é imediatamente evidente como relacionar a variabilidade genética para a função do gene. Foram pesquisados ​​os bancos de dados públicos para quaisquer funções relatados dos dois SNPs, mas não encontramos evidências que apontam para uma expressão diferencial de genes ou a estabilidade do mRNA. Nenhum relatório até à data tem sido publicada em qualquer SNP em relação ao suceptibility doença. Nós também correu análise in silico sobre as possíveis alterações em locais de ligação trasciption. Estas análises prever uma ligação aos alelos dos dois SNPs de vários factores de transcrição diferencial. Em particular MYOD1 é previsto para se ligar apenas para o alelo menor (A) e de rs546950 POU3F3 para o alelo menor (A) de rs4955720. Ambos os fatores de transcrição têm efeito pró-diferenciação, anti-proliferação [49], [50]. O facto de que ambos se ligam para os alelos menores, de protecção é intrigante, embora MYOD1 e POU3F3 só foram relatadas para exercer a sua função no músculo e no cérebro, respectivamente. rs546950 está situado no primeiro intrão de

PRKCI

, muito perto do início do gene, por conseguinte, esta é consistente com um possível envolvimento na regulação da transcrição do gene. Uma vez que o alelo variante exerce um efeito protector sobre o risco de cancro da próstata que pode supor que diminui ou aumenta a capacidade de factores de transcrição que se ligam e em tal forma que resulta em uma diminuição da expressão do gene, e, consequentemente, diminuir o risco de cancro da próstata.

é mais difícil compreender a associação entre rs4955720 e diminuição do risco de cancro da próstata a partir de um ponto de vista biológico. No entanto, na análise conjunta o valor de p da presente SNP era o mais significativo dos dois. Este SNP está localizado na extremidade 3 ‘do gene, após o fim do último exão, e uma possível função não é imediatamente evidente. Também a possível ligação com fatores de transcrição diferencial parece ser menos relevante neste caso. rs4955720 poderia estar em desequilíbrio de alta ligação (LD) com outro SNP que afecta directamente a transcrição e /ou a função de

PRKCI

. No entanto, todos comum conhecida

PRKCI

SNPs em alta LD com rs4955720 estão localizados em intrões do gene, e não parecem funcionalmente relevantes. Em conclusão, é difícil compreender o mecanismo biológico que poderia explicar a associação dos dois polimorfismo com o risco de câncer de próstata e estudos funcionais adicionais são necessários.

SNPs de alguns dos genes de PI3K que aqui investigados também foram estudados em da mama e cancro da próstata Cohort Consortium (BPC3) (Koutros 2010). Nesse estudo, rs7556371, um SNP de

PIK3C2B

, mostrou-se associada ao aumento do risco de câncer de próstata. Em nosso estudo, genotipados rs4951384, que marca rs7556371 (r

2 = 1), mas não se observou qualquer evidência de associação (quadro suplementar S2). No entanto, tem que ser notado que o aumento do risco encontrado por Koutros et al era muito modesto e poderia, portanto, ser detectada apenas através de um estudo com uma amostra enorme, como BPC3.

Abordagem marcação

O intensiva SNP utilizados, desde um fim à análise exaustiva de possíveis mono-alélicas (efeito principal) associações de risco de câncer de próstata com variantes polimórficas comuns conhecidos para cada um dos loci estudados. Tivemos energia suficiente (0,80 para o modelo codominante na análise conjunta) para detectar OR = 1,40 (ou OR = 0,71 para associações com um risco reduzido) em alfa = 5,9 × 10

-5 (significância p-limite ampla estudar- ) para um SNP com uma freqüência do alelo menor de 0,30.

Apesar de mais de 97% dos indivíduos EPIC são estimados para ser de origem caucasiana, diferenças nas freqüências alélicas em toda a Europa poderia, em teoria causa confusão pela estratificação da população. No entanto, não observamos grandes variações nas freqüências alélicas entre os países para o SNP aqui estudados (dados não mostrados).

Um possível inconveniente deste trabalho é o grande número de testes realizados, embora várias dicas sugerem um verdadeiro associação: 1) observamos associações (p 0,05) em ambas as fases do estudo, 2) após correção para o número de testes (n = 11), realizado na segunda fase da associação entre rs546950 eo risco de câncer de próstata continua a ser significativo, 3 ) a associação é biologicamente plausível e 4) a meta-análise MEGC /EPIC (2.743 casos e 3.088 controles) mostraram resultados muito semelhantes aos obtidos com os dados EPIC sozinho (p = 0,002 para rs4955720 e p = 0,029 para rs546950.

em conclusão, encontramos uma associação com o risco de câncer de próstata para dois SNPs pertencente a

PRKCI

, um gene que é frequentemente sobre-expressos em vários tipos de câncer, incluindo câncer de próstata. Essa replicação mandados de observação em um estudo maior .

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os participantes assinaram um consentimento informado por escrito. O estudo foi aprovado pelos conselhos de ética em pesquisa da Agência Internacional de Investigação do Cancro, e da colaboração de instituições responsáveis ​​pelo recrutamento de sujeitos em cada um dos centros de recrutamento EPIC.

O EPIC coorte

Uma descrição totalmente detalhada da coorte EPIC foi publicado em outro lugar [51]. Resumidamente, EPIC é composto por cerca de 370.000 mulheres e 150.000 homens, com idades entre 35-69, recrutados entre 1992 e 2005 em 10 países da Europa Ocidental

A grande maioria ( 97%). Dos sujeitos recrutados na coorte EPIC são de ( ‘Caucasiano’) origem europeia. Todos os sujeitos do estudo EPIC fornecida medidas antropométricas (peso, altura, circunferência de cintura e quadril) e extensa, informações questionário padronizado sobre o histórico médico, dieta, atividade física, tabagismo e outros fatores de estilo de vida. Cerca de 260.000 mulheres e 140.000 homens forneceram uma amostra de sangue.

Casos de câncer que ocorre após o recrutamento para a coorte e doação de sangue são identificados através de registros de câncer locais e nacionais em 7 dos 10 países, e na França, Alemanha, e na Grécia por uma combinação de contactos com seguros de saúde nacionais e /ou acompanhamento activo através sujeitos do estudo ou seus familiares. Acompanhamento de status vital é conseguido através de linkage com os registros de mortalidade.

Seleção de casos e controles

assuntos de caso foram selecionados entre os homens que desenvolveram câncer de próstata após a coleta de sangue. indivíduos do grupo controle (1-2 controles por caso) foram selecionados aleatoriamente por amostragem densidade de incidência, coincidindo com os casos para o centro de recrutamento, a idade de doação de sangue e duração do acompanhamento. Um total de 815 casos de cancro da próstata invasivo e 1.266 controlos, para um total de 2.081 indivíduos, foram incluídos na primeira fase do presente estudo. Cada controle deve ter sido livre do câncer até a duração do acompanhamento do caso índice.

SNP selecção

Para cada um dos genes candidatos 67 foi selecionada uma região genômica entre 5 kb 5 ‘do início da primeira exon conhecida e 5 Kb 3’ do final do último exão conhecidas. Uma lista de SNPs em todas as regiões do gene 67 foi recolhida a partir de HapMap (Release 22, com base em dbSNP versão 126 e NCBI genoma construir 36), e SNPs de marcação foram seleccionados através da utilização do algoritmo de Marcador [52], tal como implementada na software Haploview. Parâmetros utilizados para a seleção Tagger eram menores freqüência do alelo ≥5% em caucasianos, r mínimos

2 = 0,8 entre cada par de SNPs marcadas e marcar, a marcação de pares (observou-se uma média significa r

2 entre marcação SNPs eo SNPs que tag de 0,95). SNPs que foram preditas a executar mal com a tecnologia de genotipagem Illumina GoldenGate ou foram substituídos por SNPs em alta LD (r

2 = 0,8, calculado a partir de dados HapMap), ou retirado da lista se nenhum proxy estava disponível. Isso nos deu uma lista de 1.133 SNPs. Finalmente, para fins de controle de qualidade, nós adicionamos 30 SNPs que foram genotipados nas mesmas amostras em um projeto relacionado.

A preparação da amostra e genotipagem

O DNA foi extraído de amostras de sangue em um instrumento Autopure (Qiagen, Hilden, Alemanha) com Puregene química (Qiagen, Hilden, Alemanha). A fim de ADN a partir de casos e controlos foi randomizado em placas de PCR, a fim de assegurar que um número igual de casos e controlos podem ser analisadas simultaneamente.

A genotipagem foi realizada utilizando a tecnologia Ilumina GoldenGate (San Diego, CA , EUA), de acordo com o protocolo especificado pelo fabricante.

a filtragem de dados e análise estatística

Qualquer amostra que maior do que 25% dos SNPs tinha falhado toda a SNPs definido como falta e estes assuntos foram excluídos da análise. Nós, então, dados filtrados para remover baixo desempenho SNPs: todos os SNPs que falharam em 25% das amostras ou mais foram definidos para faltando, como foram todos os SNPs que mostraram estatisticamente significativa (p 10

-5) desvios de Hardy-Weinberg (HWE) entre os controles.

Foi analisada a associação entre o risco de câncer de próstata e genótipos para cada SNP por meio de regressão logística condicional. Genótipos foram codificados, quer como contagens de alelos menores (teste de tendência) ou como duas variáveis ​​indicadoras, uma para os heterozigotos e um para homozigotos menores de alelo (dois graus de teste de liberdade).

Nós também realizadas análises em subgrupos de a agressividade da doença (doença agressiva foi definido como extensão extraprostática (estágio C /D) ou alto grau histológico (escore de Gleason ≥8).

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando SAS 9.11.

a fim para ter em conta o grande número de testes realizados neste projecto, foi calculado para cada gene o número de variáveis ​​independentes e eficazes, M

eff, pelo uso da abordagem SNP Spectral decomposição [53]. Obtivemos uma ampla gene M

valor FEP para cada gene e também um M

valor FEP todo o estudo, somando-se o gene M

eff do.

Replication

Nós reproduziu o SNPs mostrando as associações mais fortes com o risco de câncer de próstata (p

tendência 0,01 ou p

2DF 0,01; n = 11) em um conjunto adicional de 838 casos e 943 controles selecionados dentro da coorte EPIC. Toda a genotipagem adicional foi levada a cabo utilizando o ensaio TaqMan. As sondas e iniciadores MGB Taqman foram adquiridos a Applied Biosystems (Foster City, CA) como ensaios de pré-concebido. A mistura de reacção incluía 10 ng de ADN genómico, 10 pmol de cada iniciador, 2 pmol de cada sonda e 2,5 ul de 2x mestre Mix (Applied Biosystems) em um volume final de 5 mL. A termociclagem incluiu 40 ciclos com 30 s a 95 ° C, seguido de 60 s a 60 ° C. placas de PCR foram lidas num instrumento ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems).

Todas as amostras que não dão um resultado confiável na primeira rodada da genotipagem foram devolvidos para até duas rodadas adicionais de genotipagem. Os pontos de dados que ainda não foram preenchidos após este procedimento foram deixados em branco. genótipos de controle de qualidade repetido (5% do total) apresentaram uma concordância de 100,0%.

análise bioinformática

Os locais de ligação potenciais de fatores de transcrição dentro da sequência que engloba os dois estudo-wise SNPs significativamente associada foram realizados com MatInspector Professional (https://genomatix.de/cgi-bin/matinspector_prof/mat_fam.pl) [54].

Informações de Apoio

Figura S1.

dos desenhos animados da via mTOR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0016914.s001

(PNG)

Tabela S1. genes

candidatos e seus SNPs

DOI: 10.1371. /journal.pone.0016914.s002

(DOC)

Tabela S2.

Principais efeitos das 1.084 SNPs genotipados na primeira fase. Colunas nesta tabela mostram: Nome do gene, o número NCBI dbSNP rs, o número de casos e controles para cada um dos três genótipos, odds ratio para os heterozigotos, homozigotos para o alelo raro (referiu-se aos homozigotos para o alelo comum) e por alelo, com intervalo de confiança de 95%, valor-p do teste com duas variáveis ​​indicadoras (2 teste DF), p-valor do teste de tendência

doi:. 10.1371 /journal.pone.0016914.s003

(XLS)

Tabela S3.

M

ef para cada gene no estudo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0016914.s004

(XLS)

Tabela S4.

análises em subgrupos de a agressividade da doença. Colunas nesta tabela mostram: Nome do gene, NCBI dbSNP número rs, possíveis genótipos, o número de casos e controles para cada um dos três genótipos, odds ratio para os heterozigotos e para homozigotos para o alelo raro (referidos os homozigotos para o alelo comum) , com intervalo de confiança de 95%, o parâmetro Q de Cochran, eu

2 estatística, p-valor do teste para heterogeneidade, p-valor do teste de tendência para cada estrato, nome do estrato

doi:. 10.1371 /journal.pone.0016914.s005

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