Abstract

Os tratamentos tradicionais câncer de pulmão envolvem terapias químicas ou de radiação após tumor cirúrgica remoção; No entanto, estes procedimentos frequentemente matam células normais bem. Estudos recentes indicam que quimioterapias, quando combinado com medicamentos tradicionais chineses, podem oferecer uma nova maneira de tratar o câncer.

In vitro

testes que medem a indução de autofagia e /ou apoptose foram usadas para examinar a citotoxicidade de SBPE, comumente usado para a inflamação pulmonar na linha celular A549. Os resultados indicaram que os níveis de p62 e intercelulares Atg12 foram aumentadas, LC3-I foi clivado em LC3-II, e autofagia foi induzida com apenas SBPE. Após 24 horas, foi induzido o mecanismo apoptótico. Se a cisplatina foi adicionado depois que as células atingiram o estado autofagia, observou-se efeitos sinérgicos dos dois poderia alcançar a morte suficiente de células de câncer de pulmão. Por conseguinte, a dose de cisplatina utilizada para induzir apoptose pode ser reduzida a metade, e a quantidade de tempo necessário para atingir a concentração inibitória de 50% foi também que metade do original. Além de induzir a autofagia dentro de um período reduzido de tempo, a terapia SBPE e combinação de quimioterapia droga foi capaz de alcançar o objectivo de eliminação de células de câncer de baixa dosagem rápida. Além disso, SBPE foi aplicado com gemcitabina ou paclitaxel, e descobriu que o tratamento combinado de fato conseguir melhores efeitos de células de câncer de pulmão matando. No entanto, SBPE pode também ser menos tóxico para as células normais

citação:. Tseng C-Y, Lin C-H, Wu L-Y, Wang J-S, Chung H-C, Chang J-F, et al. (2016) Combinacional Anti-Cancer Therapy potencial em Non-Small Cell Lung Cancer com Extrato de Medicina Tradicional Chinesa Sun-Bai-Pi e cisplatina. PLoS ONE 11 (5): e0155469. doi: 10.1371 /journal.pone.0155469

editor: Ying-Jan Wang, da Universidade Nacional Cheng Kung, TAIWAN

Recebido: 29 de fevereiro de 2016; Aceito: 30 de abril de 2016; Publicado: 12 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Tseng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:.. Este trabalho foi apoiado pela subvenção do Ministério da Ciência e Tecnologia (NSC-102-2320-B-033-001-MY3) em Taiwan

CONFLITO dE iNTERESSES:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Em Taiwan, cerca de 10.000 novos casos de câncer de pulmão ocorrem a cada ano, e 7000 pessoas morrem de pulmão cancro anualmente [1], o qual é maior do que aquelas com colorrectal, colo do útero, mama, próstata, e cancros do estômago combinado. Estes números continuam a crescer rapidamente a cada ano. Existem várias causas de câncer de pulmão, e os primeiros sintomas nem sempre são óbvias. pacientes com câncer de pulmão não são muitas vezes conscientes dos primeiros sintomas e perder oportunidades para o diagnóstico e tratamento precoce [2]. Segundo o Departamento de Saúde estatísticas, fumo passivo, vapores de alcatrão quente, radiações, o amianto, o fumo fábrica, fuligem, partículas finas suspensas, e tempestades de poeira são as principais causas de câncer de pulmão [3-14]. Os cancros do pulmão são classificados como carcinomas de células pequenas ou não pequenas de acordo com o facto de terem ou não-epiteliais, respectivamente [15] derivado do epitélio. carcinomas de pequenas células são altamente maligno e pode facilmente metástase, especialmente se o tamanho de célula é extremamente pequenos [16]. Assim, o tratamento químico é o curso de tratamento preferido para o carcinoma de células pequenas [17-19]. casos lateral pode ser dividido em carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma (incluindo carcinoma broncoalveolar, também referido como o carcinoma alveolar), carcinoma de células grandes, carcinoma de células escamosas glandular, tumores carcinóides, adenocarcinoma bronquial (incluindo o carcinoma cístico das adenóides ou carcinoma epitelial mucinoso), etc. [15, 20, 21]. Os tratamentos para estes tipos de cancros envolvem principalmente a excisão cirúrgica completado por radiação e quimioterapia [22, 23].

Para o tratamento de cancro do pulmão de não pequenas células convencional após a excisão cirúrgica, quimioterapia mata as células normais, juntamente com os cancerosas . Quanto mais tempo a administração de quimioterapia continua, a resistência mais forte que é desenvolvido por células cancerosas [24, 25]. Embora este método de tratamento pode proporcionar o resultado desejado, ele também aumenta o risco de doenças concomitantes [25]. Doses mais elevadas de drogas de quimioterapia são necessários durante a fase terminal de cancro, a fim de obter os mesmos efeitos de doses mais baixas administradas durante os estádios da doença anteriores [20]. Os efeitos colaterais dos métodos tradicionais de tratamento torná-los mais difícil e menos adequado para pacientes com estágios mais avançados de câncer ou de saúde mais pobre [26-29]. Com base nos efeitos colaterais e danos causados ​​por estas terapias, estudos recentes focada nas células tumorais e prestado mais atenção à imunoterapia celular, terapia genética, terapia com drogas-alvo, etc [30-34]. Alguns estudos tentaram aplicar ervas medicinais chinesas para o tratamento do câncer [35-38]. Estes estudos indicaram que numerosas ervas medicinais chinesas, tais como yew chinesa, Thalictrum fortuna, Plumbagina ou Ganoderma lucidum [39-42], foram encontradas para reduzir a inflamação anormal [43-45] e rapidamente induzir a apoptose de células tumorais [46-48] .

Sun-Bai-Pi (SBP) é a casca da raiz de Morus alba L. de acordo com a Enciclopédia de medicina tradicional chinesa “Compêndio da Materia Medica”, PAS é um medicamento chave usada para remover o vapor de água os pulmões e para tratar cuspindo sangue, sede aquecida, edema, plenitude do abdome, inchaço, problemas do tracto urinário, dor de cabeça asthenic, a deficiência de energia interna, tosse, inflamação, diabetes, câncer, hepatite e doenças cardíacas [49]. Estudos anteriores indicaram que os principais ingredientes de Sun-Bai Pi Extract (SBPE) incluiu Morusin, Prenylflavonoid e benzofurano [50-53]. Estes são antioxidantes que podem reduzir a actividade de NF-kB em células de cancro, causa citotoxicidade, e inibem a metástase do cancro, mas o seu mecanismo de acção permanece pouco clara [54-57]. Portanto, além de investigar os mecanismos de morte de células cancerígenas induzida por SBPE, também precisamos de estabelecer uma terapia do cancro sinérgico adequado que combina ervas medicinais chinesas e quimioterápicos. Neste estudo, descobrimos que, em adição à indução de apoptose a longo prazo, SBPE também induziu autofagia em células de cancro do pulmão A549. Quando o medicamento de quimioterapia, cisplatina, foi adicionado às células A549 autofágicos, os resultados indicaram que SBPE melhorou a matar células de cancro da eficiência de drogas de quimioterapia, mesmo em doses reduzidas.

Materiais e Métodos

Chemical

SBP coletadas de Di Lian Sheng Pharmaceuticals (DLSP, Taiwan), que foi extraído por água quente por 30 min seguido por centrifugação, diálise de reserva e depleção de proteína. O sedimento foi descartado, o sobrenadante foi recolhido e armazenado a 4 ° C. Cisplatina, gemcitabina, paclitaxel foram adquiridos da Sigma-Aldrich.

cultura celular

O câncer de pulmão humano células A549 alveolares e fibroblastos de pulmão normal de células WI 38VA13 Subline 2RA foram obtidos a partir Coleção Bioresource e Centro de Pesquisa (BCRC, Taiwan). As células foram cultivadas em meio de Ham F-12K (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) com soro de bovino fetal a 10% (FBS, Gibco) a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2. Para as experiências, as células foram tratadas com SBPE por vários pontos de tempo, ou tratados com SBPE durante 6 h, seguida por exposição a drogas quimioterápicas adicionais para os pontos de tempo adicionais.

ensaios de citotoxicidade MTS

A viabilidade foi detectada utilizando um ensaio MTS comercial adquirido de Promega (Madison, WI), que mede a actividade da desidrogenase mitocondrial succinato através de conversão de MTS e phenazinemethosulfate em formazano. Após o tratamento, uma mistura de 10 uL de reagente kit solúvel em água mais 190 uL de meio fresco foi adicionado a cada poço para uma 1 h de incubação a 37 ° C no escuro. Sobrenadante (100 ul /poço) foram recolhidos, ea absorção do formazano gerado foi medida a 490 nm com um microreader.

Autophagy imunofluorescência

Após a fixação e permeabilização, a reactividade não específica foi bloqueada por adição de soro de cabra normal a 2% com 0,02% de NaN

3. As células A549 foram então incubadas com anticorpo primário anti-LC3 (Abcam) e anticorpos monoclonais anti-LAMP-1 (Abcam) a uma diluição de 1: 200 durante 24 h, 4 ° C. anticorpo secundário marcado com Alexa Fluor 488 (Invitrogen) ou Alexa Fluor 594 (Invitrogen) foi usado e lâminas foram cobertas com Prolong Gold (Invitrogen) meios de montagem anti-fade antes do uso. Todas as imagens foram observadas em um microscópio Olympus IX51.

Medição da actividade de caspase 3

atividade Caspase foi avaliada com o uso do kit de ensaio 3/7 Caspase-Glo (Promega). Após o tratamento SBPE, as placas de cultura foram removidas da incubadora e deixadas equilibrar até à temperatura ambiente durante aproximadamente 30 min, em seguida, a caspase-Glo 3/7 reagente de ensaio (200 ul /poço) foi aplicado de acordo com as instruções do fabricante. Unidade de luminescência relativa (RLU) emitida pelo produto foi medido utilizando um microreader.

Western blot

proteínas (40 ^ g /poço /amostra) electrophorectically separadas em geles de SDS foram transferidas para membranas de nitrocelulose. reactividade não específica das membranas foi bloqueada, e primário anti-p62 (Abcam), anti-Atg-12 (a sinalização celular), anti-p53 (Abcam), anti-LC3 (Abcam), anti Bcl-2 (sinalização celular) , anti-Bax (sinalização celular), anti-Bad (sinalização celular), anti-α-tubulina (Abcam) foram sondados com diluições adequadas. secundário de cabra anti-IgG de rato ou anti-IgG de coelho conjugado com HRP foram usadas, e as manchas foram visualizadas por quimioluminescência aumentada (Promega ™ ECL Western Blotting Substrate) e analisados ​​no sistema Odyssey Infrared imagiologia (LI-COR Biosciences) (Lincoln, NE).

análise do ciclo celular

Após os tratamentos, as células foram recolhidas e fixadas em gelo frio de 75% de etanol durante a noite a -20 ° C. As células foram, subsequentemente, centrifugadas a 300 x g durante 5 min e incubadas com um iodeto de propídio (PI) solução de trabalho (100 ug /ml de PI e 100 ug /ml de ARNase) durante 30 min a 37 ° C. distribuição do ciclo celular foi analisada utilizando um citómetro de fluxo FACScan e analisados ​​com o uso de software ModFit (Becton Dickinson, CA).

Estatísticas

Para a análise estatística, cada experimento foi realizado em triplicado e repetidas três vezes . Os resultados foram expressos em média ± SD de três experimentos independentes, e as diferenças entre os grupos foram analisados ​​utilizando t de Student testes com software estatístico GraphPad. *, ** E *** indica P 0,05, P 0,01 e P 0,001 diferença significativa, respectivamente, em comparação com o controlo negativo. # E ## mostram p 0,05 e p . 0,01, respectivamente, em comparação com as amostras com ou sem SBPE-tratamento

Resultados

A viabilidade celular

Foi utilizado o MTS teste para detectar o SBPE efeitos teve sobre a viabilidade das células WI 38VA13 Subline 2RA, células de fibroblastos de pulmão normais e células de cancro do pulmão A549. Como mostrado na Fig 1a, verificou-se que 24 horas após a administração SBPE, a vitalidade das células A549 foi reduzido como a dosagem SBPE aumentada. A viabilidade das células após a administração de 5 mg /ml foi de 85%, o IC50 foi alcançada após a administração de 9 mg /mL, e a viabilidade celular após a administração de 10 mg /ml foi de 23%. Pelo contrário, SBPE mostrou nenhuma toxicidade significativa para as células normais WI38 com a menor dose testada, mas a morte celular significativa ocorreu dentro de 24 horas após o tratamento com SBPE a 5 e 10 mg /mL. Se SBPE doses de 5 mg /mL e 10 mg /mL foram utilizados em diferentes pontos de tempo, verificou-se que SBPE causou morte celular significativa dentro de 24 horas.

(a) ensaios de viabilidade celular realizada por administração de diferentes concentrações de SBPE para WI38 e células A549. (B) administrados 5 mg /mL e 10 mg /mL de SBPE para A549 e incubou-se as células para vários pontos de tempo. Em seguida, utilizou-se o reagente MTS para testar suas viabilidades.

SBPE induzida Cancer Cell Autophagy Efeito

Para avaliar o mecanismo, assumimos que, antes da morte celular, induz SBPE as células cancerosas a se tornar autofágica. Como mostrado na Fig 2a e 2b, as observações de microscopia de fluorescência indicaram que, independentemente da dosagem SBPE. Quando as duas cores fluorescentes foram sobrepostas e quantificado, o conteúdo autolysosome aumentada gradualmente ao longo do tempo. Portanto, o rácio de autolysosome formação de células administradas com SBPE 10 mg /mL aumentou significativamente como uma função da dose SBPE (Fig 2b). Após a amplificação razão, o autophagosome e lisossoma sobreposto, indicando que SBPE pode realmente simular células A549 para se tornar autofágica (Fig 2c). O diagrama mostrado na Fig estatística 2d indicou que no espaço de 8 horas de tratamento SBPE (10 mg /mL), 70% de células A549 gerado autofagia lisossomal, e que a taxa de aumento de 90% em 12 horas. Western blot (Fig 2e) indicou que a proteína p62 aumentou significativamente quatro vezes maior do que o grupo controle (Fig 2f) mais de 8 horas, e LC3-I foi clivada em LC3-II durante este período. Estes resultados significam que o tratamento SBPE induziu as células cancerosas a se tornar autofágica, que atingiu o pico no prazo de oito horas. Além disso, com o uso de inibidor de autofagia, a cloroquina (CQ) mais SBPE (10 mg /mL), encontramos a viabilidade celular foi significativamente restaurado às 6 he 24 h após o tratamento (S1 Fig).

SBPE 5 mg /ml (a) e 10 mg /ml (b) foram, respectivamente, adicionados às células e incubou-se durante 2, 4, 6, 12 e 24 horas. A imunocoloração foi usado para rotular o LC3 proteína autofagia (verde), LAMP-1 (vermelho) e as células cancerosas DAPI (azul). Ampliação foi 400X. (C) ampliado as células foram incubadas durante seis horas a 630X para observar a distribuição autofagia. (D) sobreposição da fluorescência verde (LC3) e a fluorescência vermelha (LAMP-1), e calculado o número de células com os lisossomas autofágicos. O eixo vertical representa o número total de células por unidade de área, dividido pelo número de células com os lisossomas autofágicos. (E) As transferências de Western foram usadas para observar os efeitos SBPE tiveram sobre a regulação das proteínas relacionadas autofagia de células A549, e descobriu que o SBPE induzida autofagia celular, que aumentou ao longo do tempo e atingiu um pico de oito horas. Todos os géis foram executados sob as mesmas condições experimentais. analisa (f) Estatístico de proteínas performances.

SBPE induzida apoptose

SBPE foi citotóxica e a taxa de indução de autofagia fortalecido como o tempo de dosagem e administração aumentou. No entanto, ainda se desconhece se a administração de SBPE mais de 12 horas pode induzir as células tumorais a tornar-se apoptótica. Portanto, a proteína marcador apoptótica Caspase3 /7 foi detectado para determinar se o mesmo é gerado ao longo do tempo. Figura 3a indica que a capacidade de desempenho de Caspase3 /7, dentro de células A549 foi amplificar como o tempo de administração SBPE aumentada. No entanto, a amplificação começou às 12 horas e atingiram a capacidade de desempenho de pico em 24 horas. Com base nos resultados precedentes, em SBPE pode efectivamente iniciar o mecanismo de apoptose depois de 12 horas e pode promover a autofagia de células tumorais dentro de oito horas. As transferências de Western (Fig 3B) indicou que as manifestações do p53 proteínas pró-apoptóticas, Bax, e Bad aumentou ao longo do tempo, enquanto que a proteína anti-apoptótica de Bcl-2 diminuiu significativamente. De acordo com a Fig 3d, depois as células de cancro do pulmão A549 foram tratadas com SBPE (10 mg /mL) durante diferentes períodos de tempo, um citómetro de fluxo foi utilizada para observar o estado de distribuição das células durante o ciclo celular. Os resultados indicaram que, como o tempo de exposição aumentado, o número de células restantes na fase G1 tendeu a aumentar, e a razão entre as células em fase S aumentou à medida que o tempo progredia, mas diminuindo depois de atingir o pico em 12 horas.

(a) Após a administração de SBPE 10 mg /mL; o reagente Caspase3 /7 foi utilizada para detectar os seus desempenhos. (B) Os efeitos que SBPE tem sobre os factores de controlo de proteínas relacionadas com a apoptose de células A549 e anti-apoptose. Todos os géis foram executados sob as mesmas condições experimentais. (C) Carta de Estatística para o desempenho de proteínas. analisa (d) FACS para a distribuição do ciclo celular, e da utilização do software ModFit LT analisar a distribuição do ciclo celular.

Cisplatina e SBPE terapia combinada pode reduzir Cancer Cell Viabilidade

De acordo com Fig 4, entre 24 e 48 horas após a cisplatina foi administrada a A549 células de cancro do pulmão, os seus efeitos citotóxicos reforçada como a concentração de cisplatina aumentou. No entanto, os efeitos só pode chegar a CI50 de 48 horas após a 25 pM de cisplatina foi administrada, e o tratamento só poderia causar a morte celular de 33% no ponto de 24 horas. Por isso, adotamos o método de terapia de combinação em que SBPE foi administrado por seis horas ea cisplatina foi administrada por 24 horas. O objetivo era usar o tratamento com cisplatina para matar as células cancerosas após a autofagia celular foi estimulada na esperança de que este método de combinação pode reforçar significativamente o efeito citotóxico, reduzindo a dose de cisplatina. Como mostrado na Fig 4a, através da administração de 10 pM e 25 pM de cisplatina durante 48 horas depois as células foram pré-tratadas com SBPE (5 mg /ml) durante seis horas, a viabilidade celular de cancro pode ser reduzida por 52% e 37%, respectivamente . Em comparação com os resultados, verificou-se que as células pré-tratadas com SBPE necessário apenas cisplatina 10 uM às 48 horas para alcançar o valor CI50, o qual é o mesmo desempenho que pode ser conseguido pela cisplatina 25 uM por si só no mesmo ponto de tempo. Se a concentração de cisplatina é aumentada para 25 uM, a célula tumoral matando efeitos são melhoradas. Como mostrado na Fig 4b, se SBPE 10 mg /mL foi adicionado antes do tratamento com cisplatina durante 24 horas, verificou-se que as viabilidades celulares de cancro após 5 uM, 10 uM e 25 tratamentos pM de cisplatina pode ser reduzida para 58%, 50%, e 36%, respectivamente. Cisplatina 25 uM sozinho só pode atingir a concentração IC50 às 48 horas na ausência de SBPE. Os efeitos citotóxicos da cisplatina 10 uM pode conseguir IC50 após o tratamento durante 48 horas. As evidências indicam que o SBPE pré-tratada pode de facto fortalecer significativamente os efeitos citotóxicos de células de cancro de cisplatina, reduzindo a dosagem de tratamento ou tempo de cisplatina.

A549 taxa de sobrevivência de células tumorais após análises de 1 uM, 5 uM, 10 uM , e 25 uM de cisplatina foi administrada e incubou-se durante 24 e 48 horas. O reagente de MTS foi utilizado para detectar as taxas de sobrevivência. Pré-tratamento com SBPE utilizando 5 mg /ml (a) e SBPE 10 mg /ml (b) adicionou-se doses de cisplatina e incubou-se durante 24 e 48 horas. O reagente MTS foi utilizado para detectar as taxas de sobrevivência.

apoptose induzida pela cisplatina e SBPE Terapia

Western blot foram usadas para observar como a terapia de combinação mudou a regulação da apoptose proteínas (Fig 5a); e os resultados indicaram que as proteínas pró-apoptóticas p53 (Figura 5b), Bax (Figura 5D), e Bad (Figura 5e) aumentou à medida que progrediu o tempo dentro de 24 horas. Isso era especialmente verdadeiro para p53, que aumentaram significativamente após apenas 12 horas. A proteína anti-apoptótica, Bcl-2, diminuíram significativamente o tempo progredia (Figura 5c) e foi reduzida em 32% após 24 horas, o que alcançados os efeitos um dia mais cedo do que a taxa de redução de 37% obtida após 48 horas, quando apenas se cisplatina administrada.

Apopthsis induzida pela combinação terapêutica SBPE e cisplatina (um) 6 horas após o tratamento, utilizando 10 mg /foi adicionado e incubado durante 24 horas e 48 mL de SBPE e 25 pM de cisplatina. Western blot foram usadas para observar os efeitos sobre as proteínas fenômeno apoptose de células relacionadas (p53, Bcl-2, Bax e Bad). Todos os géis foram executados sob as mesmas condições experimentais. gráfico de quantificação para p53 (b); BCL-2 (c); Bax (d); Bad (e).

O estabelecimento de um Concentração SBPE ideal para induzir cancro da citotoxicidade celular e um tempo ideal para administrar adicional quimioterapia Drogas

Nossa citotoxicidade as análises mostraram que as concentrações do SBPE e tempos de tratamento aumentado assim o fez o seu efeito citotóxico. Portanto, nós estabelecemos uma relação entre células cancerosas A549, concentrações do SBPE, e tempos de exposição, a fim de induzir de forma otimizada autofagia celular A549 (Fig 6). Usando Matlab 2015a, realizamos uma quantificação tridimensional dos (a) valores de viabilidade celular existentes; (b) concentrações SBPE; e os tempos (c) SBPE exposição a fim de revelar quaisquer relacionamentos. De acordo com a Figura 2, verificou-se que quando a taxa de viabilidade das células foi de 70%, aproximadamente 70% das células foram induzidas a tornar-se autophagic. Neste ponto, a cisplatina pode então ser adicionada para acelerar os efeitos citotóxicos do tratamento. Em uma viabilidade celular de 70%, que depois se obter dez pontos de tempo nesta dosagem e um derivado expressão relacional utilizado para estimar a correlação entre o tempo e a dosagem SBPE. A expressão relacional para o tempo e dosagem do SBPE em co-incubação de células do cancro do pulmão A549 foi o seguinte: Onde

y

representa a concentração do agente dada para as células,

x

representa o tempo de implementação e 5,7665 é a constante de cálculo.

o valor de detecção de teste de citotoxicidade MTS foi inserido no software de análise matemática MATLAB, através de um software de estatística para criar uma coordenada diagrama tridimensional sobre a relação entre a concentração, tempo e viabilidade . XYZ foram as variáveis. X-AXIS representa SBPE concentração X = [X, x1]; matrizes X e os símbolos X1 representam concentrações SBPE de 0 mg /mL, 1 mg /ml, 5 mg /mL, 10 mg /mL, 25 mg /mL, e 50 mg /mL; Y-AXIS representa o tempo de ação SBPE Y = [Y, y1]; matrizes Y e Y1 representam 24 e 48 horas; Z-AXIS representa viabilidade celular Z = [Z, Z1]; e matrizes Z e Z1 representam viabilidades após a administração SBPE por 24 e 48 horas. As matrizes de dados foram inseridos usando comandos de surf e um esquema de superfície tridimensional foi plotado. As cores representam as relações de ação entre os três.

Verificando a Optimal farmacêutica e concentração para SBPE para induzir o câncer celular Autophagy

De acordo com a Figura 2, descobrimos que quando a viabilidade celular taxa foi de 70%, aproximadamente 70% das células foram induzidas a tornar-se autophagic. A cisplatina pode ser adicionado neste momento para acelerar os efeitos citotóxicos. De acordo com a Figura 6 e a fórmula apresentada, para as células a atingir um estado autophagic, as células devem ser dada SBPE durante um certo período de tempo a fim de que para atingir uma taxa de sobrevivência de 70%. Realizou-se ensaios de MTS no SBPE 5 mg /mL (32 h), 6,25 mg /mL (30 h), 7,5 mg /mL (16 h), e 10 mg /mL (6 h) para verificar se este período de tempo desde que a óptima dosagem e concentração para o SBPE para induzir autofagia de células cancerígenas. Os resultados indicaram que a viabilidade celular pode ser mantida em 70% como mostrado na Figura 7a. Realizamos a microscopia de fluorescência e descobriu que LC3 sobreposto com LAMP-1 quando SBPE foi administrada a estes 4 concentrações. Esta observação representou uma sobreposição do autophagosome e o lisossoma. Portanto, a administração SBPE por um período específico de tempo pode realmente estimular a autofagia celular A549 (Fig 7b).

(a) Concentração e verificação vez contra viabilidade foi realizado de acordo com os valores de análise matemática geradas pelo MATLAB software estatístico como mostrado na Figura 6. SBPE concentrações de 5 mg /ml, 6,25 mg /ml, 7,5 mg /mL, e 10 mg /mL; prazos foram de 32, 30, 16, e 6 horas; e o reagente MTS foi utilizado para detectar as suas actividades. (B) A imunocoloração foi usado para marcar a proteína autofagia, LC3; lisossômico marcador, LAMP-1; e marcador nuclear, DAPI. As células foram incubadas durante oito horas e foram ampliada 630X em observar a distribuição autofagia. As setas indicam autofagossomas (sobreposto com verde e vermelho).

Os efeitos que Combinando SBPE à quimioterapia drogas gemcitabina e paclitaxel tem na Cancer Cell Viabilidade Taxa

De acordo com a figura 8, o citotóxico efeitos de gemcitabina e paclitaxel em 72 horas pode ser melhorada, pois a concentração SBPE é aumentada. No entanto, gemcitabina necessária a administração de 100 uM de até 72 horas e paclitaxel necessária a administração de 100 uM de até 48 horas, a fim de alcançar a IC50. Semelhante a Cisplatina, nós pré-tratados com as células SBPE durante seis horas e, em seguida, adicionado a gemcitabina ou a combinação de paclitaxel, a fim de observar se SBPE pode aumentar significativamente os efeitos citotóxicos de A gemcitabina ou paclitaxel e ao mesmo tempo reduzir a sua dosagem. Os resultados indicaram que após o tratamento com 50 uM de gemcitabina e paclitaxel durante 48 horas, as taxas de sobrevivência foram eficazmente reduzida de 78% para 44% e 65% a 45%, respectivamente. Quando comparados com os resultados não tratados (Fig 8a e 8e), as células pré-tratadas SBPE requerida apenas metade da quantidade de gemcitabina ou paclitaxel em 48 horas para obter IC50.

(a) análise de viabilidade de células de tumor A549 após a administração de gemcitabina. Depois de 1 uM, 5 uM, 10 uM, 50 uM e 100 uM de gemcitabina foi administrado durante 24 e 48 horas, o reagente MTS foi utilizado para detectar as suas actividades. Em segundo lugar, depois de 6 horas de tratamento com 10 mg /mL de SBPE; A gemcitabina foi adicionada durante 24 horas (B), 48 horas (C) e 72 horas (D). Análise de células tumorais A549 (e), a viabilidade após o tratamento com 1 uM, 5 uM, 10 uM, 50 uM e 100 uM de paclitaxel e incubou-se durante 24 e 48 horas. O reagente de MTS foi utilizado para detectar as suas actividades. Em segundo lugar, depois de 6 horas de tratamento com 10 mg /mL de SBPE; tratamento com paclitaxel foi adicionado durante 24 horas (f), 48 horas (g) e 72 horas (h).

Discussão

Existem inúmeros efeitos colaterais associados com medicamentos quimioterápicos tradicionais existentes [26-29]. Por exemplo, cisplatina, uma droga de quimioterapia comumente usado para tratar o cancro do pulmão tem um longo tempo de resposta, é propenso a resistência aos medicamentos, e aplicação a longo prazo pode inibir a apoptose ou produzem efeitos colaterais desagradáveis ​​para os pacientes [58]. Outro medicamento de quimioterapia, gemcitabina, pode causar sintomas desconfortáveis, como tonturas, vómitos, leucopenia, trombocitopenia, e toxicidade renal [59]. ervas medicinais chinesas tradicionais estão começando a emergir como drogas anti-câncer [35-38]. Actualmente, cerca de dois terços dos pacientes com câncer estão na metade da década de estágio do seu diagnóstico por causa das restrições técnica de diagnóstico e reduzem as oportunidades cirúrgicos [2, 15-23]. Pacientes Durante estas fases avançadas são demasiado fracos para suportar fisicamente o trauma da cirurgia e os efeitos secundários tóxicos da quimioterapia. A cirurgia convencional do cancro, radiação, quimioterapia e tratamento de todos os métodos têm limitações, tais como o grau da patologia do paciente, o tempo de tratamento, a idade, condição física, a existência de complicações, e alergias a medicamentos. Alguns doentes podem estar relutantes em aceitar esses métodos de tratamento ou se interromper o tratamento devido aos efeitos colaterais [2, 15-23]. ervas medicinais chinesas faltam estas restrições e podem ser utilizados de acordo com [60, 61]. As vantagens de ervas medicinais chinesas são mais do que meramente os efeitos citotóxicos contra células cancerosas, mas também aumentar os benefícios de aptidão física, induzem citocinas imunitárias, e reforçar a imunidade celular; assim, fornecendo proteção contra o câncer. No entanto, não existem ensaios clínicos em larga escala utilizando medicamentos tradicionais chineses que demonstram repetidamente a sua eficácia “baseada em evidências médicas”. Portanto, ervas medicinais chinesas ainda estão sendo classificados como medicamentos secundários e alternativas para o tratamento do câncer.

Neste estudo, nós investigamos se a fitoterapia tradicional, SBPE, pode induzir a autofagia de células tumorais. Nós ainda administrada cisplatina observar se SBPE pode matar células de câncer de pulmão e ao mesmo tempo reduzir as dosagens de cisplatina. Finalmente, foram comparados os efeitos produzidos por outros medicamentos de quimioterapia, na esperança de estabelecer um chinês-ocidental terapia de combinação de tratamento. Os nossos resultados indicaram que SBPE não iria produzir citotoxicidade significativa para as células epiteliais de pulmão normais, mas faria com que a morte de células de cancro do pulmão, nas mesmas concentrações. Nós também descobrimos que as células de câncer de pulmão iria atingir seu IC50 após o tratamento com 10 mg /mL SBPE por 24 horas. Embora o mecanismo de citotoxicidade inferior do SBPE para células normais permanece desconhecida, estes resultados significam que SBPE pode eficientemente matar células de câncer de pulmão sem danificar as células normais.

Quando a autofagia ocorre, autofagossomas marcado com LC3 formar lisossomos autofágicos com LAMP-1 lisossomos marcado com. Descobrimos que SBPE poderia induzir autofagia de células A549 e este tornou-se mais evidente quanto tempo passou. Os lisossomas autofágicos nas células tratadas atingiram um volume máximo de oito horas após a administração da droga. Expressão do rotulado, proteína lisossómica, p62, e o marcado, a proteína autophagosomal, Atg12, verificou nossos dados fluorescentes. Oito horas após a administração da droga, LC3-I clivado a quantidade máxima de LC3-II. Após 12 horas, as células do cancro do pulmão começou a apoptose, evidenciado pelo aumento da expressão da proteína da apoptose e marcadores pró-apoptóticos e a expressão reduzida do marcador anti-apoptótica. Com base nos resultados acima discutidos, SBPE pode induzir a apoptose de células de cancro de pulmão após autofagia. No entanto, embora o número de células em fase G1 tendeu a aumentar depois de 24 horas durante a análise do ciclo celular, o número de células na fase G2 /M não alterou e não havia nenhum sinal mostrando que SBPE pode causar a paragem do ciclo celular em células cancerosas . Curiosamente, o número de células em fase S aumentou de 31% para 38%, como o tempo de tratamento SPBE progrediu, mas caiu para 30% após 24 horas. A causa deste efeito é desconhecido, mas estima-se que a maioria das células moveu-se para a apoptose e uma pequena porção das células mudou-se para a fase G1 parada após 24 horas.

De acordo com a figura 4, que levou 48 horas para atingir IC50 após o tratamento de células A549 com o medicamento de quimioterapia, cisplatina. Outras pesquisas descobriram que pré-tratamento de células de cancro do pulmão com 10 mg /ml durante seis horas SBPE causaram 30% das células tratadas e induzidas a morrer autofagia em 50% destas células. taxa de sobrevivência de células do cancro tenderam a diminuir em células pré-tratadas com SBPE em comparação com os grupos que não foram pré-tratados. Além disso, a concentração e tempo de tratamento de cisplatina necessária para alcançar IC50 foi significativamente reduzida. O gráfico na Figura 6 tendência indicaram que quanto maior for a concentração e tempo de tratamento SBPE, mais forte o efeito citotóxico em 24 horas. De acordo com o nosso quadro de análise de Matlab, descobrimos que quando os níveis de concentração atingiu a região azul no gráfico, a citotoxicidade era quase 80%. Tratar com 5 mg /ml durante 24 horas SBPE reduzidas a viabilidade celular em até 80%.