Abstract
SRC, também conhecido como proto-oncogene c-Src, é uma tirosina não-receptor quinase que desempenha um papel importante na progressão do cancro através da promoção de percursos de sobrevivência, angiogénese, proliferação e invasão. Neste estudo, verificou-se que os níveis de proteína SRC foram consistentemente regulada em tecidos de câncer de pulmão, mas que os níveis de mRNA SRC variaram de forma aleatória, o que sugere que um mecanismo pós-transcricional estava envolvido na regulação da SRC. Porque microRNAs (miRNAs) são potentes reguladores pós-transcricional da expressão do gene, foi utilizada bioinformática análises de pesquisa para miRNAs que potencialmente visam SRC. Foram identificados locais de segmentação específicos para miR-203 na região 3 ‘não traduzida (3’-UTR) de SRC. então nós validada experimentalmente miR-203 como um regulador direto de SRC usando ensaios de transfecção celular e luciferase e mostraram que miR-203 inibiu a expressão SRC e, consequentemente, desencadeou supressão do /Ras via SRC /ERK. Finalmente, demonstramos que a repressão de SRC por miR-203 suprimiu a proliferação e migração e promoveu a apoptose de células de câncer de pulmão. Em resumo, este estudo fornece as primeiras pistas sobre o papel do miR-203 como um supressor de tumor em células de câncer de pulmão através da inibição da tradução SRC
Citation:. Wang N, Liang H, Zhou Y, Wang C , Zhang S, Pan-Y, et ai. (2014) miR-203 suprime a proliferação e migração e promove a apoptose de células do cancro do pulmão por Segmentação SRC. PLoS ONE 9 (8): e105570. doi: 10.1371 /journal.pone.0105570
editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 07 de abril de 2014; Aceito: 21 de julho de 2014; Publicação: 20 de agosto de 2014
Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações do Programa Nacional de Pesquisa Básica da China (973 Programa) (No. 2014CB542300), a National Science Foundation Natural da China (No. 81101330, 31271378 e 81250044), a Fundação de Ciência Natural da província de Jiangsu (No. BK2011013 e BK2012014), e o Fundo especial de Investigação para Pública Indústria do Bem-Estar da Saúde (nº 201.302.018). Este trabalho também foi apoiado pelo programa para New Century excelentes talentos na Universidade do Ministério da Educação, China (NCET-12-0261). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por aproximadamente 80% de todos os casos [1]. A maioria dos cancros do pulmão (56%) são diagnosticados numa fase distante porque a doença precoce é normalmente assintomática; apenas 15% dos casos são diagnosticados numa fase locais [2]. Na verdade, os pacientes com câncer de pulmão freqüentemente apresentam invasão tumoral celular e metástase antes do diagnóstico, o que torna os tratamentos atuais, incluindo cirurgia, radioterapia e quimioterapia, ineficaz. A taxa de sobrevida em 5 anos global para o cancro do pulmão de não pequenas células é extremamente baixa (17,1%). Portanto, estudar a base molecular do câncer de pulmão é crucial para a concepção de novos agentes terapêuticos que irão melhorar a taxa de sobrevivência.
Com os avanços substanciais em nossa compreensão da biologia do tumor, vias de sinalização chave envolvidos na mediação de crescimento do câncer de pulmão e progressão foram identificados [3]. Dominantes oncogenes e genes supressores tumorais envolvidos na patogênese do câncer de pulmão têm atraído interesse substancial, e seus papéis centrais e contribuição fundamental para o mau comportamento de células cancerosas se tornaram clara [4]. Estes genes oferecer novos alvos para terapias biológicas. Um tal alvo é SRC (também conhecida como c-Src), um proto-oncogene que codifica uma tirosina-quinase que é frequentemente sobre-expressa e activada em muitos tipos de cancro, incluindo cancro do pulmão [5], [6]. Com base molecular, SRC regula várias cascatas de sinalização associados ao desenvolvimento e progressão do tumor, incluindo a via de quinase de adesão focal (FAK), o receptor do factor de crescimento epidérmico via (EGFR), e a /via ERK Ras [7]. Consequentemente, SRC funciona como um oncogene favorecer a proliferação, migração e invasão de vários tipos de células cancerosas [8], [9]. Apesar destes avanços recentes em nossa compreensão dos papéis importantes da SRC em tumorigênese, o mecanismo molecular preciso através do qual SRC contribui para a progressão do cancro do pulmão continua a ser totalmente elucidado.
A classe de pequenos, não codificante, único RNAs -cordas conhecidos como microARNs (miARNs) tem sido mostrado para ser envolvido no cancro. miARNs ligar mRNAs alvo em locais complementares nas suas regiões 3 ‘não traduzida (3’-UTRs), suprimindo desse modo a expressão do gene alvo ao nível pós-transcricional [10], [11]. Através deste mecanismo, miARNs regulam uma grande variedade de processos biológicos, incluindo a proliferação e diferenciação celular, a migração, a apoptose, o desenvolvimento, metabolismo e [10]. Por outro lado, a disfunção de miARNs está implicado em vários cancros humanos, incluindo o cancro do pulmão, e miARN pode funcionar como oncogenes e supressores de tumor durante a carcinogénese [12], [13]. Por exemplo, a baixa expressão de let-7a e alta expressão do cluster do miR-17-92 estão associadas com um mau resultado clínico no cancro do pulmão [14], [15]. Além disso, foi relatado que o miR-31 pode reprimir directamente os supressores de tumores e LATS2 PPP2R2A em cancro do pulmão humano [16]. Estes resultados sublinham a necessidade de uma pesquisa em profundidade para miRNAs que são expressas de forma aberrante durante a carcinogênese de pulmão, bem como a necessidade de uma investigação intensiva do seu papel na biologia do tumor.
Embora a desregulamentação dos miRNAs e jogo SRC papéis importantes na carcinogênese de pulmão, não há correlação entre SRC e miRNAs no cancro do pulmão tem sido relatada. Neste estudo, previmos que SRC é um alvo de miR-203. Após a medição dos níveis de miR-203 e SRC expressão em tecido de cancro de pulmão humano e emparelhado amostras de tecidos não cancerosos, detectamos uma correlação inversa entre os níveis de proteína SRC miR-203 e. Além disso, validadas experimentalmente a inibição direta da tradução SRC por miR-203 utilizando ensaios de transfecção celular e luciferase. Finalmente, mostrámos que o miR-203 inibiu a expressão SRC e, consequentemente, desencadeou a supressão das vias de sinalização a jusante de Src, tais como a via /Ras /ERK SRC, que eventualmente suprimiu a proliferação e a migração e promoveu a apoptose de células de cancro do pulmão.
Materiais e Métodos
células e tecidos humanos
o cancro do pulmão linhas celulares A549 humana, HCC827 e H1975, e a linha de células de fibroblastos de pulmão humano normal HLF foram adquiridos de do Instituto Xangai de Biologia celular, da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). A549, HCC827, e células H1975 foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (GIBCO, CA, EUA), e células HLF foram cultivadas em F12K suplementado com 10% de soro fetal de bovino (GIBCO) e 2,5 g /l de NaHCO
3. Todas as células foram incubadas em 5% de CO
2 a 37 ° C numa atmosfera saturada de água. Os tumores de pulmão e tecidos normais adjacentes emparelhados foram derivadas de pacientes submetidos a um procedimento cirúrgico no Gulou Hospital Afiliado da Universidade de Nanjing (Nanjing, China). Em seguida, as lâminas secção tumorais foram sujeitas a análise de imuno-histoquímica de SRC (sc-8056, Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Todos os pacientes ou seus responsáveis desde consentimento por escrito, e ao Comité de Ética da Universidade de Nanjing aprovado todos os aspectos deste estudo. Os fragmentos de tecido foram imediatamente congeladas em azoto líquido no momento da cirurgia e armazenado a -80 ° C. As características clínicas dos pacientes estão listados na Tabela S1 S1 Ficheiro.
Isolamento de ARN e RT-PCR quantitativo
O ARN total foi extraído a partir das células cultivadas e tecidos humanos utilizando TRIzol Reagent (Invitrogen , Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Ensaios para quantificar miARNs foram realizadas utilizando sondas Taqman miARN (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, 1 jag de RNA total foi transcrito reverso-em ADNc utilizando transcriptase inversa de AMV (Takara, Dalian, China) e um iniciador de haste-laçada RT (Applied Biosystems). As condições de reacção foram as seguintes: 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 30 min, e 85 ° C durante 5 min. PCR em tempo real foi realizado utilizando um kit TaqMan PCR em uma Biosystems 7300 Sequence Detection System Aplicada (Applied Biosystems). As reacções foram incubadas numa placa óptica de 96 poços a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. Todas as reacções foram corridas em triplicado. Após a reacção, o limiar de ciclo (C
T) de dados foram determinados utilizando as definições de limite fixo, e a média C
t dos PCRs em triplicado foi determinada. Um método C
T comparativa foi utilizado para comparar cada condição para os controlos. Os níveis relativos dos miARNs em células e tecidos foram normalizados para U6. A quantidade de miRNA em relação ao U6 controle interno foi calculado usando o
-ΔΔCT equação 2, em que ΔΔC
T = (C
T miRNA – C
T U6)
-alvo – (C
T miRNA – C
T U6)
controle. Para quantificar o mRNA SRC, 1 ug de ARN total foi transcritos de modo inverso em ADNc utilizando oligo dT e Thermoscript (Takara) na reacção, a qual foi realizada com as seguintes condições: 42 ° C durante 60 min e 70 ° C durante 10 min . Em seguida, PCR em tempo real foi realizado utilizando o produto de RT, Syber verde corante (Invitrogen) e iniciadores específicos para SRC e GAPDH. As sequências dos iniciadores eram as seguintes: SRC (sentido): 5′-CATCCAAGCCTCAGACCCA-3 ‘; SRC (anti-sentido): 5’-TGACACCACGGCATA CAGC-3 ‘; GAPDH (sentido): 5’-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3 ‘; e GAPDH (anti-sentido): 5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3 ‘. As reacções foram incubadas a 95 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 30 s. Após as reacções estarem completas, o C
valores T foram determinadas por fixação de um limiar fixo. A quantidade relativa de ARNm de SRC foi normalizado para GAPDH.
A sobre-expressão e knockdown de miR-203
RNAs de controlo negativo sintéticos pré-miR-203, anti-miR-203 e mexidos foram adquiridos a partir de Ambion (Austin, TX, EUA). Todas as células foram semeadas em placas de 6 poços ou pratos de 60 mm, e as células foram transfectadas com Lipofectamine 2000 (Invitrogen) no dia seguinte quando as células foram de aproximadamente 70% confluentes. Em cada poço, quantidades iguais de pré-miR-203, foram utilizados RNA controle negativo mexidos anti-miR-203 ou. As células foram colhidas 24 h após a transfecção por RT-PCR quantitativo e Western blotting.
repórter luciferase ensaio
Para testar a ligação directa de miR-203 para o SRC gene alvo, um repórter de luciferase ensaio foi realizado como anteriormente descrito [17]. Toda a região 3 ‘não traduzida (3′-UTR) de SRC humano foi amplificada utilizando PCR com o ADN genómico humano como um molde. Os produtos de PCR foram inseridos no plasmídeo p-MIR-repórter (Ambion), e a inserção foi confirmada por sequenciação como correcta. Para testar a especificidade de ligação, as sequências que interagiram com a sequência de semente de miR-203 foram mutados (a partir de AUUUCA UAAAGU), e o mutante SRC 3’-UTR foi inserido num repórter de luciferase equivalente. Para os ensaios de repórter de luciferase, as células A549 foram cultivadas em placas de 24 poços e cada poço foi transfectado com 1 ug de pirilampo plasmídeo repórter de luciferase, um ug de um β-galactosidase (β-gal) plasmídeo de expressão (Ambion), e quantidades iguais (100 pmol) de pré-miR-203, o ARN de controlo negativo misturados usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) anti-miR-203 ou. O plasmídeo β-gal foi utilizado como um controlo de transfeco. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram analisadas utilizando um kit de ensaio de luciferase (Promega, Madison, WI, EUA).
construção de plasmídeo e siRNA ensaio de interferência
Uma sequência de siRNA alvejando o SRC cDNA humano foi desenhado e sintetizado por GenePharma (Xangai, China). A sequência de siARN foi 5′-CACUACAAGAUCCGGAAAC-3 ‘. Um siARN mexidos foi incluído como um controlo negativo. Um plasmídeo de expressão de mamífero que codifica o quadro de leitura aberta SRC humano (M02-pReceiver-SRC) foi adquirido a partir de GeneCopoeia (Germantown, MD, EUA). Um plasmídeo vazio serviram como um controlo negativo. O vector de expressão e SRC SRC siRNA foram transfectados em células A549 usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. O ARN total e proteína foram isolados 24 h pós-transfecção. Os níveis de ARNm de SRC e expressão de proteína foram analisados por RT-PCR quantitativo e Western blotting.
Extracção de proteínas e Western blotting
Todas as células foram enxaguadas com PBS (pH 7,4) e lisadas em RIPA lise tampão (Beyotime, China), suplementado com um cocktail de protease e fosfatase Inibidor (Thermo Scientific 78440) em gelo durante 30 min. As amostras de tecidos foram congeladas sólido com azoto líquido, moída num pó e lisadas em tampão de lise RIPA contendo o cocktail de protease e fosfatase Inibidor em gelo durante 30 min. Quando necessário, sonicação foi utilizada para facilitar a lise. Os lisados celulares ou tecidos homogeneizados foram centrifugados durante 10 minutos (12000 g, 4 ° C). O sobrenadante foi recolhido e a concentração de proteína foi calculada usando um kit de ensaio de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA). Os níveis de proteína foram analisados utilizando Western blot com anticorpos correspondentes. Os níveis de proteína foram normalizados por sondagem as mesmas manchas com um anticorpo GAPDH. Os anticorpos foram adquiridos a partir das seguintes fontes: anti-c-Src (B-12) (sc-8056, Santa Cruz Biotechnology), anti-ERK1 /2 (pT202 /pY204) (BD Biosciences 612359, EUA), anti-ERK1 (BD Biosciences 610031, EUA), anti-PKCalpha (H-7) (sc-8393, Santa Cruz Biotechnology) e anti-GAPDH (SC-365062, Santa Cruz Biotechnology). a actividade do RAS foi detectada utilizando o Kit de Ensaio de Activação de Ras da Upstate-Millipore (17-218). As bandas de proteína foram analisadas utilizando o software ImageJ.
A viabilidade celular ensaio
Para avaliar a viabilidade celular, as células A549 foram semeadas em triplicado em placas de 96 poços a uma densidade de 5 x 10
3 células por poço em 100 ul de meio de cultura. O índice de proliferação celular foi medida utilizando o ensaio de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil (MTT) (Sigma, EUA), que foi realizada 12, 24, 36, e 48 h após a transfecção de acordo com as instruções do fabricante.
a migração celular ensaio
a capacidade de migração de células A549 transf ectadas com o plasmídeo de miR-203 mímica ou SRC sobreexpressão foi ensaiado numa câmara de Boyden Transwell (6,5 -mm, Costar, EUA). As membranas de policarbonato (tamanho de poro de 8 uM) na parte inferior do compartimento superior da Transwells foram revestidos com 1% de f ibronectina humana (R D systems 1918-FN, EUA). As células foram colhidas 24 h após a transfecção e suspensas em meio de cultura DMEM com FBS livre. Em seguida, as células foram adicionadas à câmara superior (4 × 10
4 células /cavidade). Ao mesmo tempo, 0,5 ml de DMEM com 10% de FBS foi adicionado ao compartimento inferior, e as placas Transwell-contendo foram incubadas durante 12 h em 5% de CO
2 atmosfera saturada com H
2O. Após a incubação, as células que tinham entrado na superfície inferior da membrana de filtro foram fixadas com 4% de paraformaldeído durante 25 min à temperatura ambiente, lavou-se 3 vezes com água destilada e coradas com 0,1% de violeta cristal em borato 0,1 M e 2% de etanol para 15 min à temperatura ambiente. As células remanescentes na superfície superior da membrana de filtro (não migrante) foram raspadas suavemente com uma cotonete. Imagens das superfícies inferiores (com células migrantes) foram capturados por um fotomicroscópio (5 campos por câmara) (BX51 da Olympus, Japão), e as células foram contadas cegamente.
ensaios de apoptose
A apoptose de células A549 transf ectadas com o plasmídeo mímica ou SRC superexpressão de miR-203 foi testado utilizando um iodeto de anexina V-FITC /propídio (PI) a coloração ensaio. As células A549 foram cultivadas em placas de 12 cavidades e foram transfectadas com miR-203 mímico, ARNsi, ou a sobre-expressão do plasmídeo SRC para induzir a apoptose. Pré-miR-controlo e ARNsi de controlo serviram como controlos negativos. As células foram cultivadas durante a noite com meio completo e ambos forma depleção de soro contendo soro; e as células fixadas e flutuantes foram então colhidas. A análise de citometria de fluxo de células apoptóticas foi realizada utilizando um kit de V FITC-anexina /PI coloração (BD Biosciences, CA, EUA). Após lavagens com PBS frio, as células foram ressuspensas em tampão de ligação (HEPES 100 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM e CaCl 25 mM
2) seguido de coloração com anexina V-FITC /PI à temperatura ambiente no escuro durante 15 min. As células apoptóticas foram então avaliadas por gating células PI e Anexina V-positiva num activada por fluorescência (FACS) de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) e separação de células. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.
A análise estatística
Todas as imagens de Western blotting são representativos de pelo menos três experiências independentes. RT-PCR quantitativa, o ensaio repórter da luciferase, e os ensaios de viabilidade celular e apoptose foram efectuados em triplicado, e cada experiência foi repetida várias vezes. Os dados apresentados são a média ± SE de pelo menos três experiências independentes. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a p . 0,05 usando teste t de Student
Resultados
A sobre-regulação da proteína SRC, mas não mRNA, em tecidos de câncer de pulmão
primeiro investigado expressão SRC por meio de ambos análise imuno-histoquímica e análise de immunoblot em tecidos de câncer de pulmão humanos e os tecidos não cancerosos correspondente. Nós descobrimos que os níveis de proteínas CRE foram dramaticamente mais elevada nos tecidos de cancro do pulmão (Figura 1, A-C). Embora a proteína SRC foi consistentemente regulada em tecidos de câncer de pulmão, os níveis de mRNA SRC não diferiram significativamente entre o câncer e os tecidos não cancerosos (Figura 1D). Além disso, verificou-se que o nível de proteínas SRC foi maior em células A549 do adenocarcinoma do pulmão humano comparada com a de células normais de fibroblasto de pulmão HLF (figura S1, A e B em S1 Ficheiro), mas o nível de ARNm de SRC foi igual nestas duas linhas celulares (Figura S1C em S1 Arquivo). Esta disparidade entre proteína e mRNA na expressão SRC em cancros do pulmão sugere fortemente que um mecanismo pós-transcricional está envolvido na regulação SRC.
(A) Imagem representativa da análise imunohistoquímica da expressão SRC no cancro do pulmão (CL) e tecido adjacente (NL) amostras normais. (B e C) Análise de transferência de Western dos níveis da proteína SRC em seis pares de amostras CL e NL expressão. B: Imagem representativa; C: análise quantitativa. Análise (D) RT-PCR quantitativa dos níveis de expressão relativa de ARNm de SRC em seis pares de amostras CL e NL. * P 0,05; ** P . 0,01
Identificação da conservadas miR-203 locais-alvo dentro da 3’UTR do SRC
Um importante modo de regulação pós-transcricional é a repressão de mRNA transcrições de miARN. miARNs são, portanto, susceptível de desempenhar um papel biologicamente importante na regulação da expressão de CRE do cancro do pulmão. Três algoritmos computacionais, incluindo TargetScan [18], Miranda [19], e PicTar [20], foram utilizados em combinação para identificar potenciais miARNs que podem direcionar SRC. Usando essas abordagens, miR-203 foi identificado como um candidato miRNA reguladoras de SRC. A interacção previstos entre os sítios-alvo no SRC 3′-UTR miR-203 e são ilustrados na Figura 2A. Quatro potenciais locais alvo de miR-203 foram encontrados na 3’UTR do ARNm da sequência de SRC. Os valores de energia livre mínima de estes híbridos foram -16,9, -20,1, -15,8, -18,9 e kcal /mol, respectivamente, os quais estão bem dentro da gama de pares de miARN alvo genuínos. Além disso, o emparelhamento base perfeita ocorreu entre a região da semente (a sequência de núcleo que abrange os primeiros 2-8 bases da madura miRNA) e os alvos cognatos. Além disso, as sequências de ligação de miR-203 em SRC 3′-UTR são altamente conservadas entre espécies.
(A) Representação esquemática dos duplexes hipotéticos formados pelas interacções entre os locais de ligação no SRC 3′- UTR (topo) e miR-203 (inferior). O valor de energia livre previsto de cada híbrido é indicado. Os locais de reconhecimento de sementes são indicados, e em todos os nucleótidos estas regiões são altamente conservadas entre espécies, incluindo a humana, de ratinho, de rato e. (B) Análise de RT-PCR quantitativa dos níveis de expressão de miR-203 (na forma do rácio da miARN /U6) em seis pares de amostras CL e NL. (C) curva de correlação de Pearson de dispersão da mudança vezes nos níveis de proteína de miR-203 e SRC em tecidos de cancro do pulmão humano. (D) curva de correlação de Pearson de dispersão da mudança vezes nos níveis de miR-203 e mRNA SRC em tecidos de câncer de pulmão humanos. * P 0,05; ** P . 0,01
Detecção de uma correlação inversa entre os níveis de miR-203 e SRC no cancro do pulmão amostras de tecido
miRNAs são geralmente pensado para ter padrões de expressão que são opostos para que os seus objectivos de [21] – [23]. A seguir, investigou se miR-203 foi inversamente correlacionada com SRC no câncer de pulmão. Depois de determinar os níveis de miR-203 nos mesmos seis pares de tecidos cancro do pulmão e os correspondentes tecidos não cancerosos, que mostrou que os níveis de miR-203 foram consistentemente regulados negativamente em tecidos de cancro do pulmão (Figura 2B). A correlação inversa entre os níveis de miR-203 e os níveis de proteínas CRE (Figura 2C) e a disparidade entre o miR-203 níveis e os níveis de ARNm SRC (Figura 2D) foram adicionalmente ilustrada utilizando as curvas de correlação de Pearson de dispersão. Tal como observado, uma correlação inversa entre os níveis de miR-203 e os níveis de proteína SRC, mas não os níveis de ARNm, foi observada em tecidos de cancro do pulmão humano. Da mesma forma, o miR-203 também foi menor nível em células A549 em comparação com a de células HLF (figura S1D no ficheiro S1). Os resultados indicam fortemente que um típico, miRNA-mediada, mecanismo de regulação pós-transcricional estava envolvido na SRC repressão.
Validação de SRC como um alvo direto de miR-203
A correlação entre miR -203 e SRC foi ainda examinada pela avaliação da expressão SRC em células de adenocarcinoma de pulmão A549 humanos após a sobre-expressão de miR-203. Nestas experiências, a sobre-expressão de miR-203 foi obtida por transfecção das células com pré-miR-203 (um duplex de ARN sintético imitando o oligonucleótido precursor de miR-203). Como antecipado, o miR-203 em níveis de células A549 foram aumentou mais de 300 vezes quando as células foram transfectadas com pré-miR-203 (Figura 3A). Para validar que a transfecção de miR-203 foi bem sucedida, um dos genes alvo representativos de miR-203, PKCalpha (ref), foi avaliada e mostrou-se que PKCalpha foi significativamente regulada negativamente em células A549 depois de transfecção de miR-203 (Figura S2 em S1 Arquivo). Do mesmo modo, a expressão da proteína SRC foi reduzido pela introdução de miR-203 em células A549 (Figura 3, B e C). Para determinar o nível em que o miR-203 influenciada expressão SRC, repetiu-se as experiências acima mencionadas e examinaram a expressão de ARNm de SRC após a transfecção. Embora o nível intracelular de miR-203 foi alterado significativamente após tratamento com pré-miR-203, a sobre-expressão de miR-203 não afecta a estabilidade do mRNA SRC (Figura 3D). Por outro lado, a correlação entre o miR-203 e SRC também foi examinada avaliando a expressão em células de SRC de fibroblastos de pulmão HLF normais após knockdown de miR-203, com anti-miR-203 (oligonucleótidos anti-sentido modificados concebidos para direccionar especificamente miR- madura 203) (Figura 3A). Derrubar o miR-203 em células HLF resultou no aumento dos níveis de proteína SRC mas não ARNm (Figura 3D) (, B e C, Figura 3). Estes resultados demonstram que o miR-203 regula especificamente a expressão de proteínas SRC ao nível pós-transcricional, o qual é um mecanismo de regulação típico animais miARN-mediada. Para demonstrar a robustez do teste, repetiu-se as experiências acima mencionadas em duas linhas celulares de adenocarcinoma de pulmão, HCC827 adicionais e H1975. Do mesmo modo, os níveis de miR-203 foram significativamente aumentada quando as células HCC827 e H1975 foram transfectadas com pré-miR-203 (Figura S3, A e E em S1 do ficheiro). Por conseguinte, os níveis de proteínas CRE foram suprimida quando as células HCC827 e H1975 foram tratados com pré-miR-203 (Figura S3, B, C, F e G em S1 Ficheiro), mas os níveis de mRNA SRC não foram influenciados por este tratamento (Figura S3, D e H em S1 do ficheiro).
(análise a) RT-PCR quantitativa dos níveis de miR-203 em células A549 tratadas com pré-miR-controlo ou pré-miR-203 e em células HLF tratados com anti-miR-controlo ou anti-miR-203. (B e C), análise de transferência de Western dos níveis de proteína src na células A549 tratadas com pré-miR-controlo ou pré-miR-203 e em células HLF tratados com anti-miR-controlo ou anti-miR-203. B: Imagem representativa; C: análise quantitativa. (D) Análise de RT-PCR quantitativa de níveis de ARNm de SRC em células A549 tratadas com células HLF pré-miR-controlo ou pré-miR-203 e em tratados com anti-miR-controlo ou anti-miR-203. repórteres de luciferase (E) Firefly contendo de tipo selvagem (WT) ou os sítios de ligação do mutante (MUT) miR-203 em SRC 3′-UTR foram co-transfectados em células A549 com pré-miR-controlo ou pré-miR-203 e em células HLF com anti-miR-controlo ou anti-miR-203. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram analisadas utilizando um kit de ensaio de luciferase. Os resultados são calculados como a razão entre a actividade de luciferase de pirilampo, no pré-miR-203- ou células anti-miR-203 transfectadas normalizados para as células de controlo. * P 0,05; ** P . 0,01
Para determinar se os efeitos reguladores negativos que o miR-203 exercidas sobre a expressão SRC eram mediados através da ligação de miR-203 para os locais presumíveis na 3′-UTR o ARNm SRC, SRC comprimento completo 3′-UTR que contém os quatro locais de ligação de miR-203 presumíveis foi fundido a jusante do gene da luciferase de pirilampo num plasmídeo repórter. O plasmídeo resultante foi transfectado para as células A549, juntamente com um plasmídeo de controlo da transfecção (β-gal) e pré-miR-203. Como esperado, a sobre-expressão de miR-203 resultou numa redução de mais de 50% da actividade do repórter de luciferase em comparação com células tratadas com o ARN de controlo negativo (Figura 3E). Além disso, introduzimos mutações pontuais nos locais complementares correspondentes na SRC 3′-UTR para eliminar os locais de ligação de miR-203 previstos (todas as quatro posições de ligação foram mutante). Este repórter de luciferase mutante não foi afectada pela sobre-expressão de miR-203 (Figura 3E). Em contraste, quando o plasmídeo resultante foi transfectado para células HLF, juntamente com um plasmídeo de controlo da transfecção (β-gal) e anti-miR-203, o knockdown de miR-203 resultou num aumento de mais de 75% da actividade do repórter de luciferase em comparação com células tratadas com o ARN de controlo negativo, enquanto que o repórter luciferase mutante não foi afectada por o knockdown de miR-203 (Figura 3E). Esta descoberta sugere que os locais de ligação contribuem fortemente para o miRNA: interação mRNA mediar a repressão pós-transcricional da expressão SRC. Em conclusão, os nossos resultados demonstram que o miR-203 reconhece e liga-se directamente para o 3′-UTR do mRNA SRC e inibe a tradução SRC
supressão da via da SRC /Ras /sinalização ERK por miR-203.
a seguir, analisadas as consequências biológicas da expressão SRC diminuiu causada por miR-203 em células de câncer de pulmão. Como um oncogene potente, SRC regula a proliferação ea motilidade das células cancerosas afetando as vias de sinalização /ERK FAK, EGFR, e Ras [7]. Por isso, nós investigamos se a supressão da expressão de SRC devido a miR-203 regula as actividades das moléculas no /via de sinalização de Ras SRC /ERK. Em primeiro lugar, nós validado o efeito da actividade de Src na via de sinalização de Ras /ERK em células A549. De acordo com relatórios anteriores [7], [24], knockdown de SRC pela interferência de ARN mediada por siRNA resultou numa diminuição de ARNm SRC e os níveis de proteína (Figura 4, A-C), que, por sua vez, conduziu a uma diminuição da Ras-GTP e fosforilado-ERK1 /2 (Figura 4, A e B). Em contraste, a sobre-expressão de SRC resultou num aumento de ARNm SRC e os níveis de proteína (Figura 4, A-C), que, por sua vez, conduziu ao aumento da Ras-GTP e fosforilado-ERK1 /2 (Figura 4, A e B). Em seguida, investigou-se a indução miR-203 pode simular a redução SRC na supressão da via de sinalização Ras /ERK. Como antecipado, a sobre-expressão de miR-203 em células A549 regulada negativamente a proteína SRC e resultou em menos activa Ras-GTP, o qual, por sua vez, levou a uma menor fosforilada ERK1 /2 (Figura 4, D e E). Tomados em conjunto, os resultados sugerem que a Ras /ERK, como a via de sinalização a jusante de SRC, pode ser rigorosamente controlado por via reguladora de miR-203 /SRC.
(A e B) Análise de transferência de Western da proteína níveis de SRC, Ras-GTP, o total de Ras, ERK1 /2 e ERK1 em células A549 transfectadas com controle de siRNA, SRC siRNA, vetor de controle, ou SRC vetor. A: imagem representativa; B: análise quantitativa. Análise (C) RT-PCR quantitativa dos níveis de ARNm de SRC em células A549 tratadas com ARNsi de controlo, SRC siRNA, vector de controlo, ou SRC vector. (D e E) análise de transferência de Western dos níveis de proteínas de SRC, Ras-GTP, o total de Ras, ERK1 /2, e ERK1 em células A549 transf ectadas com pré-miR-controlo ou pré-miR-203. D: imagem representativa; E: análise quantitativa. * P 0,05; ** P . 0,01
O papel do miR-203 na regulação da SRC em células de câncer de pulmão
A seguir, com foco em estudar o papel de miR-203 na regulação SRC. Porque SRC é conhecido por estar envolvido na regulação da proliferação celular, apoptose, e a migração, foi investigado se o miR-203 regularia SRC para modular a proliferação celular, apoptose, e a migração de células A549. Em apoio à noção de que a SRC é essencial na promoção da proliferação [25], as células A549 transfectadas com SRC siRNA mostraram inibição da proliferação celular (Figura S4A em S1 Arquivo); em contraste, a transfecção com o plasmídeo SRC-sobre-expressam, que expressa especialmente o quadro completo de leitura aberta (ORF) de SRC sem o miR-203-responsivo 3′-UTR, teve um efeito contrário sobre a proliferação celular (Figura S4B no ficheiro S1). Posteriormente, avaliamos o papel de miR-203 na proliferação celular. Como esperado, as células A549 transf ectadas com pré-miR-203 diminuiu os níveis de proteína SRC (Figura 5, A e B) e proliferaram a uma taxa significativamente mais baixa (Figura 5C). Tabela S1.