Abstract

carcinoma de células renais (CCR) é o tipo mais letal de câncer genito-urinário, devido à sua oculta e aparecimento de resistência à quimioterapia e à radiação. Recentemente, evidências acumuladas sugeriu nódoas, inibidores da 3-hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A (HMG-CoA) redutase, foram associados com a redução do risco de cancro. No presente estudo, teve como objetivo investigar os efeitos potenciais da sinvastatina em células RCC e os mecanismos subjacentes pelos quais sinvastatina exercidas suas ações. Com viabilidade celular, a formação de colónias, e fluxo ensaios de citometria de apoptose, descobrimos que sinvastatina o crescimento celular potente suprimido das células A498 e 786-S em um tempo e dose-dependente maneira. Consistentemente, o modelo de xenotransplante realizado em ratos pelados exibiu crescimento reduzido do tumor com tratamento com sinvastatina. Além disso, também foram observados os efeitos inibitórios da sinvastatina sobre migração e invasão em

vitro

. Mecanicamente, apresentamos que a sinvastatina poderia suprimir a proliferação ea motilidade das células RCC via inibição da fosforilação de AKT, mTOR e ERK em um tempo e dose-dependente maneira. Outras investigações sobre o mecanismo subjacente revelou simvastatina pode exercer efeitos anti-tumorais através da supressão da fosforilação induzida por IL-6 de JAK2 e STAT3. Em conclusão, estes resultados sugerem que a apoptose induzida por simvastatina e a sua actividade anti-metástases em células RCC foram acompanhadas por inibição de AKT /mTOR, ERK, e JAK2 vias /STAT3, o que implica que a simvastatina pode ser um agente terapêutico potencial para o tratamento de pacientes com CCR

Citation:. fang Z, Tang Y, fang J, Zhou Z, Xing Z, Guo Z, et al. (2013) Crescimento Celular Sinvastatina Inibe Câncer Renal e Metástase via AKT /mTOR, ERK e JAK2 /STAT3 Caminho. PLoS ONE 8 (5): e62823. doi: 10.1371 /journal.pone.0062823

editor: Zhongjun Zhou, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 15 Janeiro, 2013; Aceito: 26 de março de 2013; Publicado em: 17 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 fang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 81.172.435). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de células renais (CCR) é o tipo mais comum de câncer renal, sendo responsável por cerca de 90-95% neoplasias renais [1]. Em todo o mundo, a mortalidade por RCC excedeu 100.000 pacientes por ano [2]. Cerca de 25-30% dos pacientes desenvolvem metástases no diagnóstico de RCC [3], com a sobrevivência ≥5 anos que varia de 5% a 10%, e sobrevivência global média de menos de um ano [4], [5]. A intervenção cirúrgica é o principal tratamento para RCC localizada, mas sozinho ele tem limitado benefício em pacientes com doença agressiva [1]. Além disso, tradicional quimioterapia citotóxica e imunoterapia não conseguiram demonstrar um benefício em pacientes no cenário adjuvante [6]. Nos últimos anos temos visto um rápido desenvolvimento da terapia alvo molecular [7]. Entre as terapias de primeira linha direcionados, sunitinib e temsirolimus são os mais representativos, o que pode bloquear a via de sinalização de múltiplos receptores tirosina-quinase (RTK) e alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), respectivamente [8], [9]. No entanto, nenhuma das intervenções seria considerada custo-efetiva em um limite de disposição para o pagamento de 30.000 libras por ano de vida ajustado pela qualidade [10]. Assim, há uma grande demanda por tratamentos que podem prolongar a sobrevivência sem aumentar muito os custos ou corroer a qualidade de vida dos pacientes.

As estatinas (ou 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A [HMG-CoA] redutase inibidores) são um grupo de drogas, que são análogos estruturais de inibidores da HMG-CoA redutase que inibem a conversão de HMG-CoA em mevalonato [11], [12]. Para além das suas propriedades de redução de colesterol, as estatinas apresentam numerosos efeitos pleiotrópicos, incluindo o anti-inflamação e na imunomodulação [13], [14], a redução no risco de várias formas de demência [15], e um decréscimo na proteinúria e a progressão da doença renal doença [16], [17]. De importância, a evidência emergente revelou que a estatina pode exibir efeitos anti-neoplásicos em uma variedade de células cancerosas [18], incluindo o cancro da próstata [19] – [22], o cancro da mama [23] – [25], cancro hepático [26], [ ,,,0],27] e câncer de cólon [28], [29]. Encorajador, um estudo caso-controle retrospectivo, que envolveu 500.000 veteranos relatou um papel protetor das estatinas contra o desenvolvimento da RCC [30]. No entanto, o efeito preciso de sinvastatina contra células RCC e os mecanismos moleculares subjacentes não foram bem estabelecidos.

No presente trabalho, os nossos dados estabelecer os efeitos inibidores do crescimento e pró-apoptóticos da sinvastatina sobre células RCC, tanto em

vitro Comprar e no

vivo

. Enquanto isso, nós também achamos que a sinvastatina pode potencialmente diminuir a migração e invasão de células RCC. Outras investigações dos mecanismos subjacentes indica AKT /mTOR, ERK e JAK2 /SAT3 vias desempenham papéis fundamentais nessas ações. Nossas descobertas sugerem as implicações clínicas da sinvastatina no tratamento de pacientes com CCR.

Materiais e Métodos

Ética declaração

O protocolo experimental animais respeitou as regras manejo animal do Ministério chinês da Saúde (Documento n ° 55, 2001) e foi aprovado pelo animal Care e Use Committee da Universidade de Shandong. -Pathogen Free BALB /c ratos pelados (pesando 19 ± 2 g, grau SPF, certificado SCXK2011-0012) de 4-5 semanas de idade foram adquiridos a partir do Departamento de Laboratório Ciência Animal da Universidade de Pequim (Beijing, China). Todos os animais foram mantidos no Laboratório chave do Cardiovascular remodelação e Pesquisa Function em Qilu Hospital da Universidade de Shandong.

As linhas celulares e reagentes

linhas de células A498 Humana e 786-S foram obtidos de American Type cultura Colecção (ATCC) e cultivadas em meio DMEM de alto teor de glucose (Hyclone) com 10% de soro fetal de bovino (FBS), sob as condições de 5% de CO2 a 37 ° C. A sinvastatina (sal de sódio, C25H39O6 · Na) foi adquirido da Sigma (St. Louis, MO, EUA), que foi activado de acordo com as instruções do fabricante. IL-6 humana foi adquirida de R D Systems (Minneapolis, MN, USA). Os anticorpos contra fosfo-mTOR, mTOR, fosfo-AKT (Ser473), AKT, fosfo-JAK2, JAK2, fosfo- STAT3 (Tyr705 e Ser727), STAT3, PARP, GAPDH, e HRP-conjugado de cabra anti-coelho e anti-murganho IgG foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA). Os anticorpos contra casepas-3, Bax, Bcl-2 e de survivina foram obtidos a partir de Imuno-forma (Newark, DE, EUA). Os anticorpos contra fosfo-ERK, ERK foram obtidos a partir de Anbo (San Francisco, CA, EUA).

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular foi determinada por 3- (4, 5-dimetiltiazol-2 -il) -2, 5-difeniltetrazólio brometo de MTT) (. Resumidamente, A498 (2 × 10

3 células /poço) e 786-O (1 × 10

3 células /poço) em meio de 100 ul foram inoculadas em placas de 96 poços. Após 12 horas, o meio em cada poço foi substituído com o meio contendo diferentes concentrações de simvastatina e a placa foi incubada durante 48, 72 e 96 horas. Subsequentemente, 20 uL de MTT (5 mg /ml) foi adicionado em cada poço. Após incubação a 37 ° C durante 4 h, o sobrenadante foi removido e 200 ul de DMSO foi adicionado a cada poço. Após a precipitação estava completamente dissolvido, os valores de absorvância foram determinados com o Microplate Reader (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA).

Efeito da sinvastatina na morfologia celular

Quando A498 e 786 -O células atingiram 70% de confluência, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, exposto a 16 | iM durante 48 horas a sinvastatina. A morfologia das células tratadas foi observado sob microscópio e fotomicrografias foram tiradas com câmera digital Olympus.

Clone ensaio de formação de

células A498 e 786-S foram semeadas a densidade de 1 × 10

3 células /poço em placas de 6 poços. Após incubação durante a noite, cada poço foi adicionado de simvastatina (8 e 16 ^ M) e incubou-se durante 24 horas. Em seguida, o meio foi substituído por meio completo sem simvastatina e incubadas sob as condições de 5% de CO

2 e 37 ° C durante duas semanas. Quando os clones visíveis formadas sobre as placas, a incubação foi terminada. Os clones foram lavadas com PBS e em seguida fixadas com metanol e coradas com violeta de cristal a 0,1% durante 30 min. A colônia contendo mais de 50 células foi contado sob um microscópio.

In vitro

zero ensaio

In vitro

ensaio zero foi realizado conforme descrito anteriormente [31]. As células A498 e 786-S foram cultivadas em placas de 24 poços. Após incubação durante 24 horas, cada poço foi riscado manualmente com uma ponta de pipeta de 200 uL, lavou-se três vezes com PBS e incubaram-se a 37 ° C com sinvastatina (8 e 16 uM). A área de rascunho foi fotografada 18 horas mais tarde. A distância entre duas bordas celulares foram analisados ​​pelo software ImageJ

Invasion e migração ensaio

O sistema Transwell (24 poços, 8 mm de tamanho de poro com membrana de policarbonato;. Corning Costar, Lowell, MA, EUA) revestidas com 2 mg /ml de Matrigel (BD Biosciences) foi utilizado para as

in vitro

ensaios de invasão. Um total de 5 × 10

5 células foram suspensas em meio isento de soro e 100 ul foram adicionados às câmaras superiores. DMEM contendo 20% de FBS e simvastatina (8 e 16 ^ M) foi então adicionada à câmara inferior. Após 24 horas, as células restantes nas câmaras superiores foram removidas com um cotonete de algodão enquanto as células ligadas à superfície inferior foram fixadas com metanol e coradas com violeta de cristal a 0,1%. O número de células que migraram para o lado inferior foi contado em cinco campos aleatoriamente sob um microscópio de luz. O número de células foi contado e analisados ​​estatisticamente.

Para o ensaio de migração, as células foram semeadas em câmaras superiores sem revestido Matrigel. O resto do ensaio foi realizado como o ensaio de invasão. Após 18 horas, as células na superfície inferior foram contadas também em cinco campos aleatoriamente, em seguida, o número de células foi analisada estatisticamente.

Ensaio de Apoptose

Este ensaio foi realizado para detectar apoptose de células com uma anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, San Jose, CA). Em resumo, as células colhidas foram ressuspensas em 100 ul de tampão de ligação para se conseguir uma concentração de 1 × 10

6 /mL. Em seguida, foram adicionados 5 ul de anexina V-FITC e iodeto de propídio 5 ul (PI, 20 ug /ml) e os tubos foram incubados durante 15 min à temperatura ambiente no escuro. Finalmente, o tampão de ligação (400 ul) foi adicionado a cada tubo de reacção e as células foram analisadas por citometria de fluxo. Os dados foram analisados ​​pelo software V2.9 WinMDI (Instituto de Pesquisa Scripps, San Diego, CA, EUA).

interferência de RNA e transfecção transitória

pequeno RNA de interferência (siRNA) visando AKT humana , ERK1 /2 e STAT3 foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA). As células A498 (2 × 10

5 células /poço em placas de 6 poços) foram transfectadas com AKT, ERK1 /2 e STAT3 usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante, respectivamente. Após a transfecção, as células foram incubadas durante 24 h e, em seguida, tratados com sinvastatina (8 uM) para o MTT, migração, invasão e ensaios de transferência de Western.

análise Western blot

As células foram recolhidas e lisadas em tampão RIPA, na presença de inibidores de protease. A proteína (50 ug) foi separada por SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de PVDF utilizando um aparelho de transferência húmida (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). As membranas foram bloqueadas com leite não gordo a 5% e incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários, seguido por incubação com os anticorpos secundários marcados com peroxidase de rábano. As bandas de proteína foram visualizadas com quimioluminescência aumentada (Millipore). Os níveis de proteína foram detectadas usando o leitor de quimioluminescência ImageQuant LAS4000 (GE, EUA). Os níveis de proteína foram analisadas pelo software ImageJ.

tumor xenoenxerto modelo

Em resumo, um total de 5 × 10

6 de células A498 foram misturados com Matrigel e então injectados por via subcutânea no flanco ratos nus. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente em dois grupos (10) de cada grupo. Em seguida, os ratos foram dadas de simvastatina na dose de 5 mg /kg /d por sonda oral durante 5 semanas. Os ratinhos de controlo receberam o mesmo volume de solução salina normal. O volume do tumor e ratinhos de peso foi medido a cada semana. Todos os ratos foram mortos 50 dias após a inoculação das células cancerosas e os tumores foram recolhidos.

Terminal desoxinucleotidil transferase rotulagem final dUTP nick (TUNEL) ensaio

tumores de xenoenxerto foram fixadas em formalina, -embebido em parafina e em seguida, cortada em secção-6 uM para o ensaio de TUNEL para identificar as células apoptóticas. TUNEL Apoptosis Assay kit (Beoytime, Beijing, China) foi utilizado para corar as células em apoptose. Estas células foram visualizados com fluorescente vermelha sob um microscópio de fluorescência (Olympus).

A análise estatística

t-teste bilateral de Student foi utilizado para determinar diferenças estatísticas entre os valores de tratamento e controle. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p 0,05. Todos os dados são apresentados como a média ± DP de três experiências independentes.

Resultados

Sinvastatina inibe a proliferação celular das células cancerosas renais

Para estudar os efeitos da sinvastatina sobre a proliferação RCC de células, as células A498 e 786-S foram expostas a diferentes concentrações de simvastatina por 48, 72 e 96 h no ensaio MTT. Por conseguinte, a sinvastatina, inibiu significativamente a proliferação de células A498 e 786-S de uma forma tempo e dose-dependente (* P 0,05, ** P 0,01) (Fig. 1A e 1B). A viabilidade de células A498 e 786-S foi reduzida para 52,6% e 38,8%, após tratamento com sinvastatina (16 uM) durante 72 horas, com o IC50 de 1,26 ^ M ± 18,434 e 16,311 ± 1,21 pM, respectivamente.

O efeito da sinvastatina sobre a viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. As células A498 (A) e células 786-S (B) foram tratadas com sinvastatina, durante 48, 72 e 96 h. Sinvastatina viabilidade celular significativamente inibida de ambas as linhas celulares de um modo dose e dependente do tempo. As alterações morfológicas de células A498 e 786-S induzidas por sinvastatina foram exibidos. Imagens de (C) e as células A498 786-S antes e após a adição de sinvastatina (D) (16 uM) foram tomados em 48 h. Depois de tratadas com sinvastatina, durante 48 h, em corpos apoptóticos (C) células (D) 786-O A498 e pode ser observado por microscopia óptica. (E) Efeito inibitório da sinvastatina na formação de colónias. (F) O número de colónias foi contado sob o microscópio e colônia é definida para consistir em pelo menos 50 células. Os resultados representam SD ± como a média de três experiências independentes e o erro padrão correspondente. * P 0,05; ** P . 0,01

Efeito da sinvastatina na morfologia celular de células de cancro renal

De acordo com as conclusões anteriores [32], também observamos uma resposta em duas fases no tumor células de sinvastatina tratamento. A fase precoce, ocorreu uma mudança dramática na morfologia da célula dentro das primeiras 6 h a 24 h. A fase mais tardia da resposta ocorreu entre as 24 h a 72 h, o que envolveu a perda de integridade da membrana plasmática. mudança morfologia das células A498 e 786-S após tratamento com sinvastatina (16 uM) durante 48 horas, foi mostrado na Fig. 1C e 1D. Como representado, a sinvastatina células causados ​​a retrair os seus processos e perdem a integridade da membrana plasmática. O encolhimento do corpo da célula central em torno dos núcleos foi observada na membrana plasmática, indicando apoptose estava a acontecer nestas células. O corpo apoptótica era claramente visível após o tratamento com sinvastatina (16 �) durante 48 h.

Sinvastatina inibe a formação de colónias em células de cancro renal

Nós também examinaram os efeitos da sinvastatina sobre a formação de colónias de células de as células RCC. O nosso estudo mostrou que a sinvastatina inibiram a formação de colónias de células A498 e 786-S de uma forma dependente da dose (Fig. 1E). O número de colónias foi diminuído significativamente após as células RCC tratados com sinvastatina (8 e 16 ^ M), em comparação com as células de controlo (* P 0,05, ** P 0,01). (Fig. 1F)

induz Sinvastatina a apoptose em células de cancro renal

para verificar e quantificar as células apoptóticas induzidas por simvastatina, utilizou-se a Anexina Alexa Fluor 488 e coloração com iodeto de propídio V conjugado a analisar a percentagem de células apoptóticas. As percentagens de células apoptóticas precoces e mais tarde foi apresentado no canto inferior direito (RV) e superior direito (QSD) quadrante dos histogramas, respectivamente (Fig. 2A e 2B). A percentagem total de células apoptóticas (UR + LR) aumentou de 2,64% em células A498 não tratadas com sinvastatina a 7,82% e 10,15% nas células tratadas com sinvastatina (8 e 16 uM, respectivamente) após 48 horas (* P 0,05, ** P 0,01) (Figura 2C).. Encontrámos o fenómeno semelhante em células 786-S, e a percentagem total de células apoptóticas foi aumentado de 6,32% a 9,68% e 17,6% (* P 0,05, ** P 0,01) (Figura 2D.). O tratamento de células A498 e 786-O com 8 e 16 uM sinvastatina durante 48 horas a apoptose induzida em ambas as linhas celulares, e foi de uma maneira dependente da dose. A indução significativa de apoptose após tratamento com sinvastatina indicado o seu efeito anti-cancro nas células RCC.

(A) A498 e (B) células 786-S foram tratados com sinvastatina (0, 8 e 16 ^ M) durante 48 horas e corados com FITC-annexinV e PI. A percentagem de células sobreviventes foi mostrada no quadrante inferior esquerdo; a percentagem da fase inicial da apoptose e da fase tardia de células de apoptose foram mostradas nos quadrantes inferiores e superiores do direita, respectivamente. (C, D) A quantificação da apoptose induzida por simvastatina foi calculada. Os dados são apresentados como média ± DP de três experiências independentes. * P 0,05, ** P . 0,01

Migração e invasão são inibidos por sinvastatina em células de cancro renal

O ensaio scratch foi implementada para detectar o efeito da sinvastatina na migração de células do cancro renal. Como mostrado na Fig. 3A e 3B, a migração de células A498 foi retido por sinvastatina de uma forma dependente da dose. E o efeito similar foi também observado em células 786-S (Fig. 3C e 3D). Para testar ainda a influência de simvastatina na migração celular e invasão, as células A498 tratadas com o aumento da concentração da sinvastatina foram aplicadas à migração Transwell e ensaios de invasão de Matrigel Transwell-subjacentes. O nosso resultado mostrou que a simvastatina pode inibir significativamente a migração de células renais e invasão do cancro (* P 0,05, ** P 0,01) (Fig. 4A e 4B) de uma forma dependente da dose. Encontramos o mesmo efeito da sinvastatina em células 786-O (* P 0,05, ** P 0,01). (Fig. 4C e 4D)

(A) Ensaio risco de células A498 tratadas com 0, 8 e 16 mm de sinvastatina. (B) A inibição da migração foi transformado para a percentagem da distância inicial entre as duas extremidades. As células A498 tratadas com sinvastatina mostrou uma taxa mais baixa do fecho da ferida do que as células de controlo. ensaio (C) Risco de células 786-O tratado com 0, 8 e 16 mm de sinvastatina. (D) As células 786-O tratados com sinvastatina mostraram uma menor taxa de fechamento da ferida do que as células de controlo.

(A) O tratamento com 0, 8 e 16 mm de sinvastatina mostrou migração inibida e invasão de células A498. (B) O número de células A498 que migrou e invadiu foi contado com sucesso. (C) A migração e a invasão de células 786-S foi inibida após tratamento com diferentes concentrações de simvastatina. (D) A diminuição do número de células 786-O indicado o grande efeito inibidor da sinvastatina sobre a mobilidade celular. Os dados são apresentados como média ± DP de três experiências independentes. *

P Art 0,05, **

P

. 0,01

Sinvastatina inibe o crescimento do tumor e induzir células tumorais apoptose em um modelo de xenotransplante

Para determinar se a sinvastatina inibe o crescimento do tumor em

vivo

, células A498 (5 × 10

6) foram injectadas subcutaneamente em cada flanco de ratinhos nus. a inibição do crescimento do tumor foi distinta em ratinhos tratados com simvastatina a 5 mg /kg /d, em comparação com ratinhos tratados com PBS (* P 0,05) (Fig. 5A, 5B e 5C). Além disso, não houve toxicidade significativa para ratinhos tratados com sinvastatina (5 mg /kg /d), avaliando ratinhos peso de 2 grupos (Fig. 5D). Para se conhecer se a sinvastatina poderia induzir a apoptose de células RCC no ensaio

vivo

, secções de parafina de xenoenxertos de tumor A498 a partir de ratinhos nus foram aplicados ao terminal desoxinucleotidilo transferase dUTP nick marcação terminal (TÚNEL). O aumento do número de células positivas TUNEL demonstrou claramente que a simvastatina poderia induzir a apoptose de RCC em

vivo

(* p 0,05). (Fig. 5E e 5F)

Imagens da excisado tumores (a) e os ratinhos nus (C) foram tomadas a partir do grupo de controlo e tratamento. As setas apontam para os xenotransplantes. (B) Os gráficos representam a média dos volumes tumorais dos xenoenxertos A498 tratadas com ou sem a sinvastatina. curva de peso (D) do corpo de ratinhos nus portadores de tumores A498 tratadas com sinvastatina. coloração (E) Representante TUNEL (fluorescência vermelha) de xenoenxertos de cancro renal A498. gráfico (F) da barra que mostra a quantificação das células positivas A498 tunel em xenogafts tumorais. Os dados são apresentados como média ± DP, * p . 0,05

Efeitos de simvastatina na expressão de proteínas relacionadas com a apoptose de células

A expressão da proteína Bax pró-apoptótica tem sido frequentemente associada com o aumento da apoptose, enquanto que a proteína anti-apoptótica de Bcl-2 tem sido associada com a inibição de apoptose em células alvo [33], [34]. Depois tratou-se com o aumento das concentrações de simvastatina durante 48 h, foi detectada a expressão de Bax e Bcl-2 em células RCC. Consistente com o aumento da apoptose em A498 e 786-O, o nível de Bax foi elevada enquanto que o nível de Bcl-2 foi diminuída (Fig. 6A). A relação do nível de proteína Bax /Bcl-2 é o factor decisivo para transmitir o sinal de apoptose. Ao comparar a intensidade das suas bandas, encontramos o rácio de Bax /Bcl-2 foi aumentada de uma maneira dependente da dose (* P 0,05, ** P 0,01) (Figura 6B.). Com a proporção elevada de Bax /Bcl-2, o casepase-3 para jusante a apoptose foi activado. Como é mostrado, a expressão de survivina e pró-caspase-3 foi diminuído, enquanto que a expressão da caspase-3 clivada e PARP foi clivagem de elevado.

células A498 e 786-O (A) foram ensaiadas quanto Bcl-2, Bax, de comprimento completo de caspase 3 e caspase 3 clivada, PARP comprimento completo e PARP clivada por análise de transferência de western com GAPDH como um controlo. (B) Bax /Bcl-2 relações de células 786-S e A498. O valor densitometria de cada banda foi determinada com ImageJ. Os dados foram apresentados como a média ± DP de três experiências independentes. * P 0,05, ** P 0,01. (C-H) Os níveis de mTOR, AKT, ERK e as suas formas fosforiladas foram analisadas por western blotting. Quantificação da p-mTOR /mTOR, p-AKT /AKT e proporção p-ERK /ERK foi determinada por análise de densitometria.

A sinvastatina e inibe a proliferação de metástases de células RCC via AKT /mTOR e ERK via

transferência de Western foi utilizada para detectar o mecanismo subjacente, através da qual a sinvastatina exercida suas acções. mTOR é frequentemente desregulado nas células cancerosas, que está sob investigação como um alvo potencial para pacientes com CCR [35]. AKT, como o montante da mTOR, desempenha um papel crítico na proliferação, sobrevivência e a motilidade das células cancerosas e que pode fosforilar directamente mTOR [36]. Por isso, investigamos o efeito da sinvastatina sobre a regulação da via AKT /mTOR. Após células A498 e 786-S foram tratados com sinvastatina (8 e 16 ^ M) durante 24 e 48 horas, os níveis de fosforilação de AKT e mTOR foram eficazmente suprimida. As proporções de p-AKT /AKT, bem como p-mTOR /mTOR também foram reduzidos em um tempo e dose-forma dependente (Fig. 6C, 6D, 6E e 6F). ERK, que é a frequência aberrantemente activadas em células cancerosas, promove a proliferação de células de cancro e metástase [37]. Em seguida, testámos os efeitos de sinvastatina sobre a activação de ERK, e encontrou simvastatina inibiu a fosforilação de ERK em um tempo e dose-dependente maneira em ambas as células A498 e 786-S (Fig. 6G e 6H)

.

Para investigar o papel de AKT e ERK em proliferação e a mobilidade de células RCC, utilizou-se siRNA para knockdown AKT e ERK1 /2 expressão genética em células A498. Como mostrado na Fig. 7A e 7B, a análise de transferência de Western indicou uma redução significativa nos níveis de proteína de AKT e ERK1 /2 em células transfectadas com AKT e ERK1 /2 campared para as células transfectadas com ARNsi simulada. Em seguida, avaliou-se a apoptose induzida por simvastatina e a sua actividade anti-metástases em células A498, que foram transfectadas com AKT ou ERK1 2 siRNA /. Os resultados mostraram que o knockdown de AKT ou 2 proliferação celular ERK1 /significativamente suprimida, migração e invasão (Fig. 7C, 7D, 7E e 7F), indicando que a AKT e ERK1 /2 desempenham papéis importantes na proliferação, migração e invasão de células RCC . Além disso, a sinvastatina, inibiu significativamente a proliferação e a motilidade em células AKT ou ERK1 2 knockdown /, o que sugere que a inibição da via de sinalização de ERK AKT ou pode aumentar o efeito anti-cancro de simvastatina.

(A, B as células A498 foram transfectadas) e tratado com simvastatina (8 uM), e os níveis de AKT e ERK foram analisados ​​por transferência de western com GAPDH como um controlo. Após transfectadas com ARNsi de AKT ou de ERK, células A498 foram incubadas na ausência ou na presença de simvastatina (8 uM) durante 48 h. A viabilidade celular foi medida por doseamento MTT (C, D), e a migração celular e invasão foi medida por ensaio Transwell (E, F). * P 0,05 ou ** p 0,01, comparado com as células não tratadas (Mock). # P 0,05 ou ## p 0,01, comparado com as células transfectadas com ARNsi de AKT ou de ERK

A sinvastatina e inibe a proliferação de metástases de células RCC através de IL-6 via JAK2 /STAT3 induzida

Anteriormente, as estatinas têm sido relatados para exercer efeitos pleiotrópicos sobre sinalizações celulares e funções envolvidas na inflamação [38]. Assim, especula-se a sinvastatina exerce efeito supressor do tumor através da modulação da inflamação indutor de tumores. evidências acumuladas relatou a via JAK2 pró-inflamatório /STAT3 desempenha um papel crítico na metástase de câncer, angiogénese e apoptose [39]. Notavelmente, a IL-6 é uma citocina que podem activar a sinalização de JAK2 /STAT3 em células cancerosas, que tem um efeito importante na oncogénese [40]. Para avaliar se a IL-6 pode induzir a proliferação e a metástase de células de cancro de RCC, que células A498 privadas de soro durante 12 h e, em seguida, cultivaram-na ausência ou presença de IL-6 durante 48 h. Em seguida, a viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT, enquanto a capacidade de metástases de células foi medido pelo ensaio Transwell. Descobrimos que a IL-6 pode induzir de forma significativa a proliferação e a metástase de células A498. Além disso, a IL-6 e a proliferação de metástases em células A498 induzida poderia ser suprimida pela simvastatina (8 uM) (Fig. 8A e 8B).

(A, B) de células A498 foram tratadas com IL-6 ( 10 ng /ml) durante 48 h, e a vitalidade celular e a motilidade foi estimada utilizando o ensaio de MTT e Transwell respectivamente. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. * P 0,05 ou ** p 0,01, em comparação com as células tratadas sem IL-6. (C-H) Simvastatina inibiram a fosforilação de Jak2, STAT3 (Tyr705) e STAT3 (Ser727) em células de cancro renal em uma dose e modo dependente do tempo. análise quantitativa do p-JAK2 /JAK2, p-STAT3 (Tyr705) /STAT3 e p-STAT3 (Ser727) /rácio STAT3 foi exibido em cada painel inferior.

Em seguida, investigamos se a sinvastatina inibe a fosforilação de JAK2 e STAT3 induzida por IL-6 em células RCC. As células A498 e 786-S foram pré-tratados com sinvastatina (8 e 16 ^ M) durante 12, 24 e 48 horas, e, em seguida, estas células foram incubadas com a IL-6 (10 ng /ml) durante 10 min. As análises de transferência de Western mostrou que a sinvastatina de IL-6 inibiu significativamente o fosforilação induzida de JAK2 e STAT3, tanto local Tyr705 e Ser727 (Fig. 8C-8H).

STAT3 Para avaliar se está envolvido na apoptose induzida e anti-sinvastatina -metastasis de células RCC. Aplicou-se siRNA para knockdown expressão do gene da STAT3 em células A498. Após transfectadas com ARNsi STAT3 ou oligonucleótidos de controlo, as células A498 foram tratadas com sinvastatina (8 uM), ou controlo. Como mostrado na Fig. 9A, knockdown da STAT3 suprimiu significativamente a proliferação, a migração e a invasão de células A498 (Fig. 9B e 9C), indicando que a STAT3 desempenha um papel importante na proliferação e a motilidade em células A498. Além disso, o tratamento combinado com sinvastatina (8 uM) e STAT3 siARN diminuiu a viabilidade celular e a motilidade das células A498, em comparação com as células tratadas apenas com STAT3 siARN. Portanto, estes resultados sugerem que a IL-6 induzida por via de JAK2 /STAT3 foi associada com a sobrevivência e metástases de células RCC, e a inibição de IL-6 induzida por JAK2 /via de sinalização da STAT3 poderia sensibilizar as células RCC para tratamento com sinvastatina.

(a) as células A498 foram transfectadas com ARNsi STAT3 e tratados com sinvastatina (8 uM), e os níveis de STAT3 foi analisada por western blotting com GAPDH como um controlo. (B, C) Após transfectadas com ARNsi de STAT3, células A498 foram incubadas na ausência ou na presença de simvastatina (8 uM) durante 48 h. A viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT, (B), e a migração celular e invasão foi medida por ensaio Transwell (C). * P 0,05 ou ** p 0,01, comparado com as células não tratadas (Mock). # P 0,05 ou ## p . 0,01, em comparação com as células transfectadas com STAT3 siRNA

Sinvastatina inibe a fosforilação de AKT, ERK e STAT3 em tumores de xenoenxerto

Para determinar se o efeito de simvastatina sobre o crescimento de xenoenxerto de tumor A498 envolve a inibição de AKT, ERK1 /2 e a actividade da STAT3. análise de transferência de Western de AKT, ERK1 /2 e STAT3 activação indicou que os níveis de fosforilação de AKT, ERK1 /2 e STAT3 foram eficazmente suprimida no xenoenxerto A498, após tratamento com sinvastatina em

vivo (Fig. 10). No geral, nosso estudo indicou que a sinvastatina poderia inibir o crescimento do tumor renal em

vivo

envolvendo a inibição de AKT, atividade ERK1 /2 e STAT3.

análise de Western blot para a AKT fosforilada, ERK e STAT3 níveis em xenoenxerto de tumor recolhidas de ratinhos nus tratados com ou sem a sinvastatina. A determinação quantitativa de p-AKT /AKT, p-ERK /ERK e proporção p-STAT3 /STAT3 foi determinada por análise de densitometria. * P . 0,05 comparado com o controlo

Discussão

As manchas são inibidores de redutase HMG-CoA, que são amplamente utilizados no tratamento de distúrbios lipídicos, em particular a hipercolesterolemia [41]. Recentemente, numerosos dados experimentais mostraram que as estatinas apresentam efeitos anti-tumor contra células cancerosas de diferentes origens diferentes [42].